Πληροφορίες

8.2: Ετοιμάστε το τζελ αγαρόζης - Βιολογία

8.2: Ετοιμάστε το τζελ αγαρόζης - Βιολογία


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Σε αυτό το εργαστήριο, θα χρησιμοποιήσετε γέλες αγαρόζης για να διαχωρίσετε τα μόρια DNA που παράγονται σε αντιδράσεις PCR. Εάν χρησιμοποιείτε τις συσκευές BioRad, τοποθετήστε τις μαύρες σφήνες σε κάθε άκρο του δίσκου χύτευσης.

1. Προσδιορίστε την ποσότητα αγαρόζης που θα χρειαστείτε για ένα τζελ 1,25% (1,25 g/100 mL) που ταιριάζει στην πλατφόρμα χύτευσης σας. Οι περισσότερες από τις συσκευές γέλης στο εργαστήριο είναι τα συστήματα BioRad Mini-Sub GT με δίσκο χύτευσης 7 cm x 7 cm που φιλοξενεί γέλη 30 mL. Ελέγξτε τους υπολογισμούς σας με τους συμπαίκτες σας πριν προχωρήσετε.

2. Γεμίστε έναν βαθμονομημένο κύλινδρο με τον κατάλληλο όγκο ρυθμιστικού διαλύματος TAE. Χύστε το διάλυμα σε μια μικρή φιάλη.

3. Ζυγίστε την κατάλληλη ποσότητα αγαρόζης. Ψεκάστε την αγαρόζη στην επιφάνεια του ΤΑΕ στη φιάλη. Σημείωση: η αγαρόζη δεν θα διαλυθεί μέχρι να ζεσταθεί.

4. Διαλύουμε την αγαρόζη θερμαίνοντας το διάλυμα για διαστήματα 15-20 δευτερολέπτων σε φούρνο μικροκυμάτων. Μετά από κάθε μεσοδιάστημα, αφαιρέστε τη φιάλη και περιστρέψτε την απαλά για να διασκορπιστεί το περιεχόμενο. Σημειώστε εάν τα σωματίδια αγαρόζης είναι ακόμη εμφανή ή εάν η αγαρόζη έχει διαλυθεί. Τα καλύτερα τζελ παρασκευάζονται από αγαρόζη που ΔΕΝ έχει παραψηθεί.

ΣΗΜΕΙΩΣΗ ΑΣΦΑΛΕΙΑΣ: Το διάλυμα αγαρόζης θα είναι πολύ ζεστό όταν το αφαιρέσετε από το φούρνο μικροκυμάτων! Να είστε προσεκτικοί όταν χειρίζεστε τη φιάλη. Προσέξτε ιδιαίτερα να μην έρθετε σε επαφή με τον ατμό που θα εισέλθει από το άνοιγμα της φιάλης. Διπλώστε πολλές χαρτοπετσέτες και τυλίξτε τις γύρω από το λαιμό της φιάλης όταν το χειρίζεστε. Εάν τύχει να χυθεί λίγη ζεστή αγαρόζη στο δέρμα σας, πλύντε το αμέσως με κρύο νερό και ειδοποιήστε το TA σας.

5. Αφήστε το διάλυμα αγαρόζης να κρυώσει μέχρι να αγγίξετε άνετα τη φιάλη με τα χέρια σας. Διαλύματα αγαρόζης άνω των 60 ̊C θα παραμορφώσουν το δίσκο χύτευσης! Ρίξτε το τζελ. Τοποθετήστε το δείγμα χτένας στη θέση του. Μην μετακινείτε την πλατφόρμα χύτευσης μέχρι να πήξει η γέλη. Θα ξέρετε ότι το τζελ σταθεροποιείται όταν γίνει αδιαφανές. Αφήστε το τζελ να στεγνώσει για περίπου 20 λεπτά αφού δέσει.


Εκπαίδευση ηλεκτροφόρησης νουκλεϊκών οξέων

Μάθετε για τα βασικά και τις συμβουλές για την ηλεκτροφόρηση γέλης για διαχωρισμό και ανάλυση νουκλεϊκών οξέων.

Βρείτε τεχνικούς πόρους για την ηλεκτροφόρηση γέλης νουκλεϊκού οξέος, που καλύπτουν το ιστορικό, τη ρύθμιση, τη ροή εργασίας, τις εκτιμήσεις, τις εφαρμογές και την αντιμετώπιση προβλημάτων.


ΒΙΒΛΙΟ ΜΕΘΟΔΟΥ

Η ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης είναι ο ευκολότερος και συνηθέστερος τρόπος διαχωρισμού και ανάλυσης DNA. Ο σκοπός του τζελ μπορεί να είναι η εξέταση του DNA, η ποσοτικοποίησή του ή η απομόνωση μιας συγκεκριμένης ζώνης. Το DNA απεικονίζεται στο πήκτωμα με την προσθήκη βρωμιούχου αιθιδίου, το οποίο είναι μεταλλαξιογόνο ή λιγότερο τοξικές ιδιόκτητες βαφές όπως GelRed, GelGreen και SYBR Safe. Το βρωμιούχο αιθίδιο και οι ιδιόκτητες βαφές συνδέονται με το DNA και είναι φθορίζοντα, που σημαίνει ότι απορροφούν το αόρατο υπεριώδες φως και μεταδίδουν την ενέργεια ως ορατό φως.

Τι ποσοστό ζελέ;

Τα περισσότερα πηκτώματα αγαρόζης παρασκευάζονται μεταξύ 0,7% και 2%. Μια γέλη 0,7% θα δείξει καλό διαχωρισμό (ανάλυση) μεγάλων θραυσμάτων DNA (5󈝶 kb) και μια γέλη 2% θα δείξει καλή ανάλυση για μικρά θραύσματα (0,2𔂿 kb). Μερικοί άνθρωποι φτάνουν μέχρι και το 3% για τον διαχωρισμό πολύ μικροσκοπικών θραυσμάτων, αλλά ένα κάθετο πήκτωμα πολυακρυλαμιδίου είναι πιο κατάλληλο σε αυτή την περίπτωση. Τα τζελ χαμηλού ποσοστού είναι πολύ αδύναμα και μπορεί να σπάσουν όταν προσπαθείτε να τα σηκώσετε. Τα τζελ υψηλού ποσοστού είναι συχνά εύθραυστα και δεν πήζουν ομοιόμορφα. Συνήθως φτιάχνω τζελ 1%.

Ποια δεξαμενή γέλης;

Τα μικρά τζελ 8x10 cm (minigels) είναι πολύ δημοφιλή και δίνουν καλές φωτογραφίες. Τα μεγαλύτερα τζελ χρησιμοποιούνται για εφαρμογές όπως η κηλίδωση Southern και Northern. Ο όγκος της αγαρόζης που απαιτείται για ένα minigel είναι περίπου 30󈞞 mL, για ένα μεγαλύτερο gel μπορεί να είναι 250 mL. Αυτή η μέθοδος προϋποθέτει ότι φτιάχνετε ένα μίνι-τζελ.

Πόσο DNA πρέπει να φορτώσω;

Το μεγάλο ερώτημα. Μπορεί να ετοιμάζετε ένα αναλυτικό τζελ για να κοιτάξετε απλώς το DNA σας. Εναλλακτικά, μπορεί να προετοιμάζετε ένα παρασκευαστικό τζελ για να διαχωρίσετε ένα θραύσμα DNA πριν το κόψετε από το τζελ για περαιτέρω επεξεργασία. Είτε έτσι είτε αλλιώς θέλετε να μπορείτε να δείτε τις ζώνες DNA κάτω από το υπεριώδες φως σε ένα τζελ χρωματισμένο με βρωμιούχο αιθίδιο. Τυπικά, μια ζώνη είναι εύκολα ορατή εάν περιέχει περίπου 20 ng DNA.

Τώρα εξετάστε ένα παράδειγμα. Ας υποθέσουμε ότι χωνεύετε ένα πλασμίδιο που περιλαμβάνει 3 kb φορέα και 2 kb ένθετο. Χρησιμοποιείτε EcoRI (ένα κοινό ένζυμο περιορισμού) και περιμένετε να δείτε τρεις ζώνες: το γραμμικό διάνυσμα (3 kb), το 5' άκρο του ενθέτου (0,5 kb) και το 3' άκρο του ενθέτου (1,5 kb). Για να δείτε τη μικρότερη ζώνη (0,5 kb) θέλετε να περιέχει τουλάχιστον 20 ng DNA. Η μικρότερη ζώνη είναι το 1/10 του μεγέθους του μη κομμένου πλασμιδίου. Επομένως, πρέπει να κόψετε 10x20 ng, δηλαδή 200 ng DNA (0,2µg). Τότε οι τρεις ζώνες σας θα περιέχουν 120 ng, 20 ng και 60 ng DNA αντίστοιχα. Και οι τρεις ζώνες θα είναι καθαρά ορατές στο τζελ και η μεγαλύτερη ζώνη θα είναι έξι φορές πιο φωτεινή από τη μικρότερη ζώνη.

Τώρα φανταστείτε να κόβετε το ίδιο πλασμίδιο με BamHI (άλλο δημοφιλές ένζυμο περιορισμού) και ότι το BamHI κόβει το πλασμίδιο μόνο μία φορά, για να το γραμμικοποιήσει. Εάν χωνέψετε 200 ng DNA σε αυτή την περίπτωση, τότε η ζώνη θα περιέχει 200 ​​ng DNA και θα είναι πολύ φωτεινή.

Πάρα πολύ DNA Το φορτωμένο σε ένα τζελ είναι κακό. Η μπάντα φαίνεται να τρέχει γρήγορα (που σημαίνει ότι είναι μικρότερη από ό,τι πραγματικά είναι) και σε ακραίες περιπτώσεις μπορεί να χαλάσει το ηλεκτρικό πεδίο για τις άλλες μπάντες, κάνοντάς τις να φαίνονται επίσης με λάθος μέγεθος.

Πολύ λίγο DNA είναι μόνο ένα πρόβλημα στο ότι δεν θα μπορείτε να δείτε τις μικρότερες μπάντες επειδή είναι πολύ αχνές.

Έχοντας πει όλα αυτά, τα τζελ DNA είναι συγχωρητικά και ένα ευρύ φάσμα φορτίων DNA θα δώσει αποδεκτά αποτελέσματα. Συνήθως χωνεύω και φορτώνω 2𔃂 µL από τα 50 µL που λαμβάνονται από ένα κιτ miniprep. Για αντιδράσεις PCR, εξαρτάται από την PCR, αλλά σε συνηθισμένες εφαρμογές τα 10󈞀 µL θα πρέπει να είναι πολλά για να δείτε το προϊόν στο τζελ.

Ποια χτένα;

Αυτό εξαρτάται από τον όγκο του DNA που φορτώνετε και τον αριθμό των δειγμάτων. Χτένες με πολλά μικροσκοπικά δόντια μπορεί να χωρέσουν 10 µL. Αυτό δεν είναι καλό εάν θέλετε να φορτώσετε 20 µL χωνευτικού περιορισμού συν 5 µL buffer φόρτωσης. Όταν αποφασίζετε εάν μια χτένα έχει αρκετά δόντια, να θυμάστε ότι πρέπει να φορτώσετε τουλάχιστον μία λωρίδα σήμανσης, κατά προτίμηση δύο.

Φτιάχνοντας το τζελ (για γέλη 1%, όγκος 50 mL)

Ζυγίστε 0,5 g αγαρόζης σε κωνική φιάλη 250 mL. Προσθέστε 50 mL 0,5xTBE, ανακινήστε για να αναμειχθεί.

Καλό είναι να χρησιμοποιείτε ένα μεγάλο δοχείο, αρκεί να χωράει στο φούρνο μικροκυμάτων, γιατί η αγαρόζη βράζει εύκολα.

Ψήνουμε στο μικροκύματα για περίπου 1 λεπτό για να διαλυθεί η αγαρόζη.

Το διάλυμα αγαρόζης μπορεί να βράσει πολύ εύκολα, γι' αυτό συνεχίστε να το ελέγχετε. Καλό είναι να το σταματήσετε μετά από 45 δευτερόλεπτα και να το στροβιλίσετε. Μπορεί να υπερθερμανθεί και να ΜΗΝ βράσει μέχρι να το βγάλετε και μετά να βράσει σε όλα τα χέρια σας. Έτσι φόρεσε γάντια και κρατήστε το στο μήκος των χεριών. Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε έναν καυστήρα bunsen αντί για φούρνο μικροκυμάτων - απλά θυμηθείτε να συνεχίσετε να τον παρακολουθείτε.

Αφήστε το να κρυώσει στον πάγκο για 5 λεπτά στους 60°C (ακριβώς πολύ ζεστό για να το κρατάτε με γυμνά χέρια).

Αν έπρεπε να το βράσετε για πολλή ώρα για να διαλυθεί η αγαρόζη, τότε μπορεί να έχετε χάσει λίγο νερό από τους υδρατμούς. Μπορείτε να ζυγίσετε τη φιάλη πριν και μετά τη θέρμανση και να προσθέσετε λίγο απεσταγμένο νερό για να αναπληρώσετε αυτόν τον χαμένο όγκο. Ενώ η αγαρόζη κρυώνει, ετοιμάστε τη δεξαμενή γέλης σε επίπεδη επιφάνεια.

Προσθέστε 1 µ L βρωμιούχου αιθιδίου (10 mg/mL) και ανακατέψτε για να αναμειχθεί

Ο λόγος που αφήνουμε την αγαρόζη να κρυώσει λίγο πριν από αυτό το βήμα είναι η ελαχιστοποίηση της παραγωγής ατμών βρωμιούχου αιθιδίου. Το βρωμιούχο αιθίδιο είναι μεταλλαξιογόνο και θα πρέπει να αντιμετωπίζονται με εξαιρετική προσοχή. Απορρίψτε το μολυσμένο άκρο σε ειδικό δοχείο υπολειμμάτων βρωμιούχου αιθιδίου. Διάλυμα 10 mg/mL βρωμιούχου αιθιδίου παρασκευάζεται με τη χρήση δισκίων (για να αποφευχθεί η ζύγιση της σκόνης) και αποθηκεύεται στους 4°C στο σκοτάδι με ΤΟΞΙΚΕΣ ετικέτες πάνω του.

Υπάρχουν εναλλακτικές λύσεις για τη χρήση τοξικού και μεταλλαξιογόνου βρωμιούχου αιθιδίου:

Ρίξτε το τζελ αργά στη δεξαμενή. Σπρώξτε τυχόν φυσαλίδες στο πλάι χρησιμοποιώντας μια μύτη μιας χρήσης. Τοποθετήστε τη χτένα και ελέγξτε ξανά ότι είναι σωστά τοποθετημένη.

Το πλεονέκτημα της αργής έκχυσης είναι ότι οι περισσότερες φυσαλίδες παραμένουν στη φιάλη. Ξεπλύνετε αμέσως τη φιάλη.

Αφήστε να σταθεροποιηθεί για τουλάχιστον 30 λεπτά, κατά προτίμηση 1 ώρα, με το καπάκι ανοιχτό αν είναι δυνατόν.

Το τζελ μπορεί να φαίνεται πολύ νωρίτερα, αλλά το να τρέξει DNA σε ένα πήκτωμα πολύ νωρίς μπορεί να δώσει τρομερά αποτελέσματα με διάχυτες κηλίδες.

Ρίξτε 0,5x ρυθμιστικό διάλυμα TBE στη δεξαμενή γέλης για να βυθίσετε τη γέλη σε βάθος 2𔃃 mm. Αυτό είναι το τρέχον buffer.

Πρέπει να χρησιμοποιήσετε το ίδιο ρυθμιστικό διάλυμα σε αυτό το στάδιο όπως χρησιμοποιήσατε για να φτιάξετε το τζελ. δηλ. Εάν χρησιμοποιήσατε 0,6xTBE στο τζελ, χρησιμοποιήστε 0,6xTBE για το τρέχον buffer. Θυμηθείτε να αφαιρέσετε τους μεταλλικούς σχηματιστές γέλης εάν τους χρησιμοποιεί η δεξαμενή γέλης σας.

Προετοιμασία των δειγμάτων

Μεταφέρετε μια κατάλληλη ποσότητα από κάθε δείγμα σε ένα νέο σωλήνα μικροφυγοκέντρου.

Μπορεί να είναι 10 µL μιας αντίδρασης PCR 50 µL ή 5 µL μιας πέψης με ένζυμα περιορισμού 20 µL. Εάν φορτώνετε ολόκληρα τα 20 µL μιας αντίδρασης PCR 20 µL ή μιας ενζυμικής χώνευσης (όπως κάνω συχνά), τότε δεν χρειάζεται να χρησιμοποιήσετε φρέσκα σωληνάρια, απλώς προσθέστε το ρυθμιστικό διάλυμα φόρτωσης στα σωληνάρια PCR. Γράψτε στο εργαστηριακό σας βιβλίο τη φυσική σειρά των σωλήνων, ώστε να μπορείτε να αναγνωρίσετε τις λωρίδες στη φωτογραφία γέλης.

Προσθέστε μια κατάλληλη ποσότητα ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης σε κάθε σωλήνα και αφήστε το άκρο μέσα στο σωλήνα.

Προσθέστε 0,2 όγκους buffer φόρτωσης, π.χ. 2 µL σε δείγμα 10 µL. Η άκρη θα χρησιμοποιηθεί ξανά για να φορτώσει το τζελ.

Αποθηκεύω τους δείκτες μου έτοιμους με buffer φόρτωσης στους 4°C. Ξέρω να φορτώσω 2 µL και πόσο DNA είναι σε κάθε ζώνη. Δείτε παρακάτω για περισσότερα σχετικά με αυτό.
Αποφύγετε τη χρήση των ακραίων πηγαδιών αν είναι δυνατόν. Για παράδειγμα, εάν έχετε 12 δείγματα και 2 δείκτες, τότε θα χρησιμοποιήσετε 14 λωρίδες συνολικά. Εάν η χτένα σας σχηματίζει 18 φρεάτια, τότε δεν θα χρησιμοποιείτε 4 φρεάτια. Είναι καλύτερο να μην χρησιμοποιείτε τα εξωτερικά φρεάτια γιατί είναι πιο πιθανό να λειτουργούν με παρέκκλιση.

Συνεχίστε τη φόρτωση των δειγμάτων και τελειώστε με μια τελευταία λωρίδα δείκτη

Φορτώνω τζελ από δεξιά προς τα αριστερά με το τζελ προσανατολισμένο έτσι ώστε τα φρεάτια να είναι κοντά στην άκρη του πάγκου και το DNA θα μεταναστεύσει μακριά από την άκρη του πάγκου. Αυτό συμβαίνει επειδή τα τζελ δημοσιεύονται, κατά σύμβαση, σαν τα φρεάτια να ήταν στην κορυφή και το DNA να είχε τρέξει στη σελίδα.

Κλείστε τη δεξαμενή γέλης, ενεργοποιήστε την πηγή ισχύος και ενεργοποιήστε τη γέλη στα 5 V/cm.

Για παράδειγμα, εάν τα ηλεκτρόδια απέχουν μεταξύ τους 10 cm, τότε λειτουργήστε το τζελ στα 50 V. Είναι καλό να λειτουργείτε το τζελ πιο αργά από αυτό, αλλά μην τρέχετε πιο γρήγορα. Πάνω από 5 V/cm η αγαρόζη μπορεί να θερμανθεί και να αρχίσει να λιώνει με καταστροφικές επιπτώσεις στην ανάλυση της γέλης σας. Μερικοί άνθρωποι τρέχουν το τζελ αργά στην αρχή (π.χ. 2 V/cm για 10 λεπτά) για να επιτρέψουν στο DNA να μετακινηθεί στο τζελ αργά και ομοιόμορφα και στη συνέχεια να επιταχύνουν το τζελ αργότερα. Αυτό μπορεί να δώσει καλύτερη ανάλυση. Είναι εντάξει να τρέχετε τζελ όλη τη νύχτα σε πολύ χαμηλές τάσεις, π.χ. 0,25𔂾,5 V/cm, αν θέλετε να πάτε σπίτι στις 11 η ώρα ήδη.

Ελέγξτε ότι ρέει ρεύμα

Μπορείτε να το ελέγξετε αυτό στην πηγή ισχύος, τα milliamps θα πρέπει να βρίσκονται στο ίδιο ball-park με την τάση, αλλά ο καλύτερος τρόπος είναι να κοιτάξετε τα ηλεκτρόδια και να ελέγξετε ότι εκλύουν αέριο (δηλ. φυσαλίδες). Εάν όχι, ελέγξτε τις συνδέσεις, ότι η πηγή ρεύματος είναι συνδεδεμένη στην πρίζα κ.λπ. Αυτό είναι γνωστό ότι συμβαίνει εάν οι άνθρωποι χρησιμοποιούν νερό αντί για τρεχούμενο ρυθμιστικό.

Παρακολουθήστε την πρόοδο της γέλης με αναφορά στη βαφή δείκτη.

Σταματήστε το τζελ όταν το μπλε της βρωμοφαινόλης έχει τρέξει τα 3/4 του μήκους του τζελ.

Απενεργοποιήστε και αποσυνδέστε τη δεξαμενή γέλης και μεταφέρετε τη γέλη (στην θήκη της αν είναι δυνατόν) στο σκοτεινό δωμάτιο για να κοιτάξετε στο κουτί φωτός UV.

Ορισμένες θήκες γέλης δεν είναι διαφανείς στην υπεριώδη ακτινοβολία, επομένως πρέπει να τοποθετήσετε προσεκτικά το τζελ στη γυάλινη επιφάνεια του φωτιστικού κουτιού. Η υπεριώδης ακτινοβολία είναι καρκινογόνο και δεν πρέπει να αφήνεται να γυαλίζει σε γυμνό δέρμα ή μάτια. Φορέστε λοιπόν προστατευτικά προσώπου, γάντια και μακριά μανίκια.

Το buffer φόρτωσης δίνει χρώμα και πυκνότητα στο δείγμα για να διευκολύνει τη φόρτωση στα φρεάτια. Επίσης, οι βαφές φορτίζονται αρνητικά σε ουδέτερα ρυθμιστικά διαλύματα και έτσι κινούνται στην ίδια κατεύθυνση με το DNA κατά την ηλεκτροφόρηση. Αυτό σας επιτρέπει να παρακολουθείτε την πρόοδο του τζελ. Οι πιο κοινές βαφές είναι το μπλε της βρωμοφαινόλης (Sigma B8026) και η ξυλενοκυανόλη (Sigma X4126). Η πυκνότητα παρέχεται από γλυκερίνη ή σακχαρόζη.

Η ακριβής ποσότητα της βαφής δεν είναι σημαντική
Φυλάσσετε στους 4°C για να αποφύγετε την ανάπτυξη μούχλας στη σακχαρόζη. 10 mL ρυθμιστικού διαλύματος φόρτωσης θα διαρκέσει για χρόνια.

Το μπλε της βρωμοφαινόλης μεταναστεύει με ρυθμό ισοδύναμο με 200� bp DNA. Εάν θέλετε να δείτε θραύσματα οπουδήποτε κοντά σε αυτό το μέγεθος, χρησιμοποιήστε την άλλη βαφή γιατί το μπλε της βρωμοφαινόλης θα κρύψει την ορατότητα των μικρών θραυσμάτων. Η ξυλενοκυανόλη μεταναστεύει σε ισοδυναμία περίπου 4kb. Επομένως, μην το χρησιμοποιήσετε εάν θέλετε να απεικονίσετε θραύσματα 4 kb.

Υπάρχουν πολλά διαφορετικά είδη δεικτών μεγέθους DNA. Παλιότερα το φθηνότερο καθορισμένο DNA προερχόταν από βακτηριοφάγο, έτσι πολλοί δείκτες κόβονταν DNA φάγων με ένζυμα περιορισμού. Πολλά από αυτά εξακολουθούν να είναι πολύ δημοφιλή, π.χ. λάμδα HindIII, λάμδα PstI, PhiX174 HaeIII. Αυτά δίνουν ζώνες με γνωστά μεγέθη αλλά τα μεγέθη είναι αυθαίρετα. Επιλέξτε έναν δείκτη με καλή ανάλυση για το μέγεθος θραύσματος που περιμένετε να δείτε στις λωρίδες δειγμάτων. Για παράδειγμα, για μικροσκοπικά προϊόντα PCR μπορείτε να επιλέξετε PhiX174 HaeIII αλλά για θραύσματα 6 kb θα επιλέξετε λάμδα HindIII. Πιο πρόσφατα, οι εταιρείες άρχισαν να παράγουν δείκτες σκάλας με ταινίες σε καθορισμένα διαστήματα, π.χ. 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5 kb και ούτω καθεξής έως 10 kb. Εάν γνωρίζετε τη συνολική ποσότητα DNA που έχει φορτωθεί σε μια λωρίδα δείκτη και γνωρίζετε τα μεγέθη όλων των ζωνών, μπορείτε να υπολογίσετε την ποσότητα του DNA σε κάθε ζώνη που είναι ορατή στο πήκτωμα. Αυτό μπορεί να είναι πολύ χρήσιμο για τον ποσοτικό προσδιορισμό της ποσότητας του DNA στις ζώνες του δείγματός σας σε σύγκριση με τις ζώνες δείκτη. Είναι καλό να τοποθετήσετε δύο λωρίδες σήμανσης, πλευρίζοντας τα δείγματα. Πολλές εταιρείες πωλούν δείκτες μεγέθους DNA. Πληρώνει για να ψωνίσετε για το φθηνότερο. Συχνά η τοπική εταιρεία βιοτεχνολογίας νεροχύτη κουζίνας πουλά εξαιρετικούς μαρκαδόρους.

Το TBE σημαίνει Tris Borate EDTA.

Οι άνθρωποι χρησιμοποιούν επίσης TAE (Tris Acetate EDTA). Δημιουργήστε ένα απόθεμα 10x χρησιμοποιώντας φθηνά αντιδραστήρια. Μη χρησιμοποιείτε ακριβά αντιδραστήρια «αναλυτικού βαθμού». Η φτηνή βάση Tris και το βορικό οξύ μπορούν να αγοραστούν χύμα.

Διαλύουμε τα υλικά σε 1,9 L απεσταγμένου νερού. pH σε περίπου 8,3 χρησιμοποιώντας NaOH και συμπληρώστε μέχρι 2 L.


Έννοιες και Τεχνικές Επιστήμης Καλλιέργειας Φυτικών Ιστών

4.6.1 Ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης

Η ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης είναι μία από τις πολλές φυσικές μεθόδους για τον προσδιορισμό του μεγέθους του DNA. Σε αυτή τη μέθοδο, το DNA αναγκάζεται να μεταναστεύσει μέσω μιας μήτρας αγαρόζης υψηλής διασύνδεσης ως απόκριση σε ηλεκτρικό ρεύμα. Σε διάλυμα, τα φωσφορικά άλατα του DNA είναι αρνητικά φορτισμένα και το μόριο επομένως θα μεταναστεύσει στον θετικό (κόκκινο) πόλο. Υπάρχουν τρεις παράγοντες που επηρεάζουν τον ρυθμό μετανάστευσης μέσω ενός πηκτώματος: το μέγεθος του DNA, η διαμόρφωση του DNA και η ιοντική ισχύς του ρυθμιστικού διαλύματος που τρέχει. Η κατασκευή της ηλεκτροφόρησης αγαρόζης αναφέρεται στο Σχ. 4.8.

Εικόνα 4.8. Ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης.


8.2: Ετοιμάστε το τζελ αγαρόζης - Βιολογία

Περίληψη άρθρου:

Η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης είναι η πιο κοινή μέθοδος κατά την οποία διαχωρίζεται και αναλύεται το μόριο του DNA. Αυτή η μέθοδος χρησιμοποιείται συνήθως στο πεδίο της βιοχημείας και της μοριακής βιολογίας για την απομόνωση του DNA. Αυτή η τεχνική υποστηρίζει επίσης τον διαχωρισμό και την ανάλυση πρωτεϊνών. Ένα χημικό βρωμιούχο αιθίδιο χρησιμοποιείται για την οπτικοποίηση του μορίου DNA. Η ιδιότητα αυτής της χημικής ουσίας είναι ότι συνδέεται ισχυρά με τις βάσεις του DNA και την κάνει να οπτικοποιείται.

Διαδικασία ηλεκτροφόρησης γέλης:
Η διαδικασία της ηλεκτροφόρησης γέλης για τον διαχωρισμό των μορίων DNA λαμβάνει χώρα με τον ακόλουθο τρόπο:
1) Χρησιμοποιώντας τα περιοριστικά ένζυμα, το μόριο DNA κόβεται σε μικρά κομμάτια ή θραύσματα.

2) Τα κομμένα θραύσματα DNA μετακινούνται στα φρεάτια ή σε γλάστρες όπου υπάρχει ήδη γέλη αγαρόζης.

3) Το πήκτωμα της αγαρόζης μαζί με τα θραύσματα DNA διέρχονται μέσω ηλεκτρικού ρεύματος.

4) Το φρεάτιο είναι εξοπλισμένο με αρνητικά και θετικά φορτισμένα ηλεκτρόδια. Όταν απελευθερώνεται ηλεκτρικό ρεύμα στο πήκτωμα, το αρνητικό ηλεκτρόδιο απωθεί τα αρνητικά φορτισμένα θραύσματα DNA και αυτά μετακινούνται στον θετικό πόλο του πηγαδιού.

5) Μέσω αυτής της μεθόδου μπορούν να απομονωθούν θραύσματα DNA ανάλογα με το μέγεθός τους και να οπτικοποιηθούν εύκολα.

Εφαρμογές του Agarose Gel:
Ο κύριος σκοπός της γέλης αγαρόζης είναι να απομονώσει και να αναλύσει τα μόρια του DNA που κόβονται από ένζυμα περιορισμού. Αυτά τα κομμένα κομμάτια DNA μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον σκοπό της κλωνοποίησης για την παραγωγή διαφόρων πλασμιδίων από ένα θραύσμα. Η λειτουργία της ηλεκτροφόρησης γέλης είναι να απομονώνει κομμένα πλασμίδια ή φορείς από τους μη κομμένους φορείς.

Η γέλη αγαρόζης μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τον διαχωρισμό των μορίων RNA ή πρωτεΐνης από το πήκτωμα. Τα θραύσματα DNA διαχωρίζονται ξανά πριν από την κηλίδωση Southern και το RNA και οι πρωτεΐνες διαχωρίζονται πριν από το στύπωμα Northern. Επιτρέπει επίσης στα θραύσματα DNA να περάσουν μέσω της PCR για να δημιουργήσουν διάφορα αντίγραφα μορίων DNA, ώστε να μπορούν να χρησιμοποιηθούν στη λήψη δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA ή σε οποιαδήποτε άλλη μέθοδο. Μόρια DNA ίδιου μεγέθους μπορούν να απομονωθούν μέσω της γέλης αγαρόζης, όταν το ηλεκτρικό ρεύμα περνά μέσα από αυτό.

Η ποσότητα και η ποιότητα του μεγέθους του μορίου DNA αναλύεται με λάμδα DNA ladder και παρατηρώντας την απουσία ραβδώσεων των θραυσμάτων αντίστοιχα. Σημαίνει ότι μόνο εκείνα τα θραύσματα DNA μπορούν να παρατηρηθούν ή να απομονωθούν που έχουν φθορίζουσα λωρίδα μέσα τους, ώστε να μπορούν να ταυτοποιηθούν.

Πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα:-
Το κύριο πλεονέκτημα της τεχνικής γέλης αγαρόζης είναι ότι μπορεί εύκολα να υποβληθεί σε επεξεργασία και το μόριο DNA που χρησιμοποιείται ως δείγμα μπορεί επίσης να ανακτηθεί χωρίς καμία βλάβη στο τέλος της διαδικασίας. Η γέλη αγαρόζης δεν μετουσιώνει τα δείγματα DNA και μένουν στο δικό τους.

Υπάρχει επίσης ένα μειονέκτημα της ηλεκτροφόρησης γέλης ότι μπορεί να λιώσει όταν το ηλεκτρικό ρεύμα περνά μέσα από αυτό. Για αυτό το λόγο υπάρχουν πιθανότητες το γενετικό υλικό να υιοθετήσει τα σχήματα που δεν χρειάζονται.

Χρήση ηλεκτροφόρησης γέλης:
Η ηλεκτροφόρηση γέλης μπορεί να χρησιμοποιηθεί στον τομέα της εγκληματολογίας. Η διαδικασία λήψης δακτυλικών αποτυπωμάτων DNA μπορεί να πραγματοποιηθεί χρησιμοποιώντας την ηλεκτροφόρηση DNA γέλης αγαρόζης.

Σχετικά με τον συγγραφέα / Πρόσθετες πληροφορίες:

Σημαντική δήλωση αποποίησης ευθύνης: Όλα τα άρθρα σε αυτόν τον ιστότοπο είναι μόνο για γενικές πληροφορίες και δεν αποτελούν συμβουλές επαγγελματιών ή ειδικών. Δεν φέρουμε καμία ευθύνη για την ορθότητα ή την αυθεντικότητα των πληροφοριών που παρουσιάζονται σε αυτό το άρθρο ή για οποιαδήποτε απώλεια ή τραυματισμό που προκύπτει από αυτές. Δεν υποστηρίζουμε αυτά τα άρθρα, δεν είμαστε ούτε συνδεδεμένοι με τους συντάκτες αυτών των άρθρων ούτε υπεύθυνοι για το περιεχόμενό τους. Ανατρέξτε στην ενότητα αποποίησης ευθύνης για τους πλήρεις όρους.


Πώς να τρέξετε το τζελ αγαρόζης;

Η μήτρα γέλης χυτεύεται ως οριζόντια πλάκα. Οι εσοχές δημιουργούνται χρησιμοποιώντας πλαστικές χτένες στις οποίες είναι φορτωμένο το DNA. Ωστόσο, πριν φορτωθεί το DNA, χρησιμοποιείται μια χρωστική φόρτωσης για την ανάμειξη του DNA για να ζυγίσει το δείγμα στο διάλυμα. Αυτή η μέθοδος αφήνει έναν ορατό δείκτη, ο οποίος θα βοηθήσει στην παρακολούθηση της εξέλιξης της κίνησης του DNA.

Για άγνωστα δείγματα, εκτελούνται κατά μήκος της κλίμακας DNA με γνωστό μήκος DNA για σύγκριση. Το πήκτωμα αγαρόζης τοποθετείται σε ένα δοχείο (δεξαμενή/κουτί γέλης) που περιέχει ένα αγώγιμο ρυθμιστικό διάλυμα ελεγχόμενου pH. Ένα ηλεκτρικό πεδίο εφαρμόζεται σε όλο το μήκος της γέλης.

Η κλίση τάσης επηρεάζει την ταχύτητα κίνησης μέσω της γέλης. Ένα τροφοδοτικό συνεχούς ρεύματος χρησιμοποιείται για την τροφοδοσία του ηλεκτρικού πεδίου. Στη διαδικασία της ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης, η παροχή ρεύματος ρυθμίζεται σε σταθερή τάση λαμβάνοντας υπόψη το μέγεθος της δεξαμενής. (6, 7 και 8)

Εικόνα 4: Ένα γονιδιωματικό DNA, το οποίο προέρχεται από δείγμα αίματος, υποβλήθηκε στη διαδικασία ηλεκτροφόρησης γέλης αγαρόζης.
Πηγή εικόνας:
Researchgate.net

Οπτικοποίηση DNA

Μόλις το DNA έχει μεταναστεύσει πλήρως μέσω της γέλης, το επόμενο σημαντικό βήμα είναι η οπτικοποίηση. Ο στόχος είναι να ελέγξουμε για το μήκος και τον αριθμό των μορίων σε ένα δεδομένο δείγμα. Το DNA χρωματίζεται για εύκολη οπτικοποίηση δεδομένου του γεγονότος ότι το DNA δεν είναι ορατό με γυμνό μάτι. Κατά την απεικόνιση τζελ, χρησιμοποιείται η φθορίζουσα κηλίδα καθώς παρέχει καλύτερα επίπεδα ανίχνευσης.

Η εικόνα γέλης αγαρόζης καταγράφεται χρησιμοποιώντας κάμερες υψηλής ευαισθησίας εξοπλισμένες με transilluminators μπλε φωτός. Χρησιμοποιείται για να διεγείρει τους φθορίζοντες λεκέδες να εκπέμπουν φως και στη συνέχεια θα καταγραφεί από την κάμερα.

Τα έγγραφα gel έχουν κάποιο είδος πηγής φωτισμού, ένα φίλτρο που απαλλάσσει το φως του φόντου και μια κάμερα για να ελέγχει το σήμα. Η ληφθείσα εικόνα χρησιμοποιείται για τον έλεγχο σύμφωνα με τα μοτίβα της ζώνης DNA, κάτι που είναι χρήσιμο για τον έλεγχο του μήκους και της ποσότητας του DNA. (5, 7, 8 και 9)

Εικόνα 5: Η ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης είναι μία από τις κοινώς χρησιμοποιούμενες διαδικασίες για τον διαχωρισμό βιολογικών μορίων.
Πηγή εικόνας:
wikimedia.org

Γιατί χρησιμοποιείται αγαρόζη στην ηλεκτροφόρηση γέλης αντί για άγαρ;

Το άγαρ είναι μια από τις ευρέως χρησιμοποιούμενες ουσίες κατά την ηλεκτροφόρηση. Ωστόσο, η χρήση γέλης αγαρόζης γίνεται όλο και πιο δημοφιλής. Μάλιστα, προτιμάται από το άγαρ γιατί χυτεύεται εύκολα και έχει λιγότερες φορτισμένες ομάδες.

Είναι ιδανικό για διαχωρισμό DNA διαφόρων μεγεθών, ειδικά αυτών που συναντώνται συνήθως στο εργαστήριο. Το διαχωρισμένο DNA μπορεί εύκολα να προβληθεί με χρώση και με τη βοήθεια κατάλληλου φωτισμού όπως το υπεριώδες φως.

Η διαδικασία εξαγωγής είναι επίσης σχετικά εύκολη. Η τυπική γέλη αγαρόζης που χρησιμοποιείται κυμαίνεται μεταξύ 0,7% και 2% και διαλύεται σε ρυθμιστικό ηλεκτροφόρησης. (2, 4 και 7)


Δες το βίντεο: Νταλαμάγκα Μαρία - Προσδιορισμός γλυκοζυλιωμένης αιμοσφαιρίνης (Φεβρουάριος 2023).