Πληροφορίες

Εσώνια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες σε μιτοχονδριακά γονιδιώματα

Εσώνια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες σε μιτοχονδριακά γονιδιώματα


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Μελετάω το μιτοχονδριακό γονιδίωμα και έχω διαβάσει ότι μερικά περιέχουν ιντρόνια. Ωστόσο, αυτά τα εσώνια κωδικοποιούν τις πρωτεΐνες. Δεν μπορώ πραγματικά να το καταλάβω αυτό. Θα μπορούσε κάποιος να μου πει σε ποιο ιντρόνιο σε ποιο γονιδίωμα μιτοχονδρίων αναφέρεται αυτό;


Τα μιτοχονδριακά γονιδιώματα διαφέρουν πολύ ως προς το μέγεθος, το δυναμικό κωδικοποίησης και ακόμη και αν είναι κυκλικά ή γραμμικά. Το μιτοχονδριακό DNA των θηλαστικών είναι μικρό (11-28 kbp) και χωρίς εσώνια. Ωστόσο, τα μιτοχόνδρια ορισμένων άλλων οργανισμών κυμαίνονται έως και 1000 kbp σε μέγεθος.

Ορισμένοι σπόγγοι (δημοσπόγγοι) με μεγάλα μιτοχονδριακά γονιδιώματα περιέχουν εσώνια τύπου Ι και εσώνια τύπου ΙΙ. Αν και αρχικά θεωρήθηκε ότι τα εσώνια δεν έχουν άλλη λειτουργία από το να διαχωρίζουν εξόνια, τα εσώνια ορισμένων πυρηνικών γονιδίων έχουν βρεθεί ότι περιέχουν γονίδια. Αυτό αποδεικνύεται ότι ισχύει και για μερικά από τα μιτοχονδριακά εσώνια. Για να παραθέσω από τότε εισαγωγή σε μια εργασία που βρήκα μέσω μιας αναζήτησης στο Διαδίκτυο:

Τα περισσότερα εσώνια της Ομάδας Ι κωδικοποιούν γονίδια ενδονουκλεάσης υποδοχής (HEG) και/ή ωριμάση της οικογένειας LAGIDADG †, ενώ τα περισσότερα εσώνια της Ομάδας ΙΙ κωδικοποιούν μια αντίστροφη μεταγραφάση (RT).

Αυτά τα εσώνια βρίσκονται σε γονίδια όπως αυτό που κωδικοποιεί την υπομονάδα 1 της κυτοχρωμικής οξειδάσης (COI).


† Αυτό φαίνεται να είναι λάθος εκτύπωση για την ΟΤΔμεγάλοΟι μεταλλάσες IDAD, οι οποίες είναι επίσης ενδονουκλεάσες, και εμπλέκονται στο μάτισμα των ιντρονίων στα οποία βρίσκονται.


Πρόταση νέας ονοματολογίας για τα ιντρόνια σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες σε μιτογόνα μυκήτων

Τα μυκητιακά μιτοχονδριακά γονίδια συχνά εισβάλλουν από ιντρόνια της ομάδας Ι ή ΙΙ, τα οποία αντιπροσωπεύουν έναν ιδανικό δείκτη για την κατανόηση της εξέλιξης των μυκήτων. Απαιτείται μια τυπική ονοματολογία των μιτοχονδριακών ιντρονίων για να αποφευχθεί η σύγχυση κατά τη σύγκριση διαφορετικών μυκητιακών μιτογόνων. Επί του παρόντος, υπάρχει μια τυπική ονοματολογία για τα ιντρόνια που υπάρχουν στα γονίδια rRNA, αλλά υπάρχει έλλειψη μιας τυπικής ονοματολογίας για τα ιντρόνια που υπάρχουν σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Σε αυτή τη μελέτη, προτείνουμε ένα νέο σύστημα ονοματολογίας για τα ιντρόνια σε μιτοχονδριακά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες μύκητα με βάση (1) συντομογραφία τριών γραμμάτων του επιστημονικού ονόματος ξενιστή, (2) όνομα γονιδίου ξενιστή, (3), ένα κεφαλαίο γράμμα P (για εσώνια ομάδας Ι), S (για ιντρόνια της ομάδας II) ή U (για ιντρόνια με άγνωστους τύπους) και (4) θέση εισαγωγής ιντρονίου στο γονίδιο ξενιστή σύμφωνα με τον μύκητα που παράγει κυκλοσπορίνη Tolypocladium inflatum. Η προτεινόμενη ονοματολογία αποδείχθηκε εφικτή ονομάζοντας ιντρόνια που υπάρχουν σε μιτογόνα 16 μύκητες των διαφορετικών phyla, συμπεριλαμβανομένων τόσο των βασικών όσο και των ανώτερων μυκητιακών γενεαλογιών, αν και απαιτείται μικρή προσαρμογή της ονοματολογίας για να ταιριάζει σε ορισμένες ειδικές συνθήκες. Η ονοματολογία είχε επίσης τη δυνατότητα να ονομάσει μιτοχονδριακά εσώνια φυτών/πρωτιστών/ζωικών. Ελπίζουμε οι μελλοντικές μελέτες να ακολουθήσουν την προτεινόμενη ονοματολογία για να διασφαλιστεί η άμεση σύγκριση μεταξύ διαφορετικών μελετών.


Γονιδιώματα

Ένα από τα καθοριστικά και ουσιαστικά χαρακτηριστικά της ζωής είναι το γενετικό υλικό. Ένας οργανισμός’s γονιδίωμα είναι το πλήρες σύνολο όλων των γονιδίων και του γενετικού υλικού που υπάρχει σε αυτόν τον οργανισμό ή μεμονωμένο κύτταρο. Συχνά σκεφτόμαστε τα γονίδια με όρους γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, ή γονιδίων που μεταγράφονται σε mRNA και στη συνέχεια μεταφράζονται σε πρωτεΐνη, ωστόσο, τα γονιδιώματα αποτελούνται από πολλά περισσότερα από απλά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Επιπλέον, τα χαρακτηριστικά των προκαρυωτικών και ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων διαφέρουν τόσο ως προς το μέγεθος όσο και ως προς το περιεχόμενο.
Η παρακάτω εικόνα δείχνει τα διαφορετικά εύρη μεγεθών γονιδιώματος σε διαφορετικές ταξινομικές ομάδες ζωής. Σημειώστε ότι, γενικά, τα προκαρυωτικά γονιδιώματα είναι μικρότερα από τα ευκαρυωτικά γονιδιώματα. Ωστόσο, τα μεγέθη του ευκαρυωτικού γονιδιώματος ποικίλλουν πολύ και δεν συνδέονται με την οργανική “ πολυπλοκότητα.” Ανατρέξτε σε αυτό το διάγραμμα καθώς διαβάζετε σχετικά με τις διαφορές και τις ομοιότητες μεταξύ προκαυωτικών και ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων.

Μεγέθη γονιδιώματος, από τη Wikipedia

Προκαρυωτικά γονιδιώματα

  • Τα γονιδιώματα των Βακτηρίων και των Archaea είναι συμπαγή ουσιαστικά όλο το DNA τους είναι “λειτουργικό” (περιέχει γονίδια ή γονιδιακά ρυθμιστικά στοιχεία).
  • Τα μεγέθη των προκαρυωτικών γονιδιωμάτων κυμαίνονται από περίπου 1 εκατομμύριο έως 10 εκατομμύρια ζεύγη βάσεων DNA, συνήθως σε ένα εγκύκλιος χρωμόσωμα
  • Τα γονίδια σε ένα βιοχημικό μονοπάτι ή μονοπάτι σηματοδότησης συχνά συγκεντρώνονται και διατάσσονται σε οπερόνια, όπου μεταγράφονται ως ένα μοναδικό mRNA που μεταφράζεται για να παράγει όλες τις πρωτεΐνες στο οπερόνιο.
  • Το μέγεθος των προκαρυωτικών γονιδιωμάτων σχετίζεται άμεσα με τις μεταβολικές τους ικανότητες – όσο περισσότερα γονίδια, τόσο περισσότερες πρωτεΐνες και ένζυμα παράγουν.

Ευκαρυωτικά Γονιδιώματα

  • Τα μεγέθη του γονιδιώματος των ευκαρυωτών είναι εξαιρετικά μεταβλητά, ακόμη και μέσα σε μια ταξινομική ομάδα (το λεγόμενο παράδοξο της τιμής C).
  • Τα ευκαρυωτικά γονιδιώματα χωρίζονται σε πολλαπλά γραμμικά χρωμοσώματα, κάθε χρωμόσωμα περιέχει ένα μόνο γραμμικό διπλό μόριο DNA.
  • Τα ευκαρυωτικά γονίδια σε ένα βιοχημικό ή σηματοδοτικό μονοπάτι δεν είναι οργανωμένα σε οπερόνια ένα mRNA κάνει μια πρωτεΐνη.
  • Πολλά ευκαρυωτικά γονίδια (τα περισσότερα ανθρώπινα γονίδια) είναι διαχωρισμένα μη κωδικοποιητικά εσώνια πρέπει να αφαιρεθούν και τα εξόνια να συναρμολογηθούν μεταξύ τους για να δημιουργηθεί ένα ώριμο mRNA. Τα ιντρόνια είναι “παρεμβαίνουσες” αλληλουχίες σε γονίδια που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Η παρακάτω εικόνα δείχνει μια μεγεθυμένη περιοχή ενός γονιδίου που τονίζει τα εναλλασσόμενα εξόνια και εσώνια.

Ένα γονίδιο μεταγράφεται και στη συνέχεια ματίζεται με διαφορετικούς τρόπους για να παραχθούν mRNA που κωδικοποιούν σχετικές πρωτεΐνες από διαφορετικούς συνδυασμούς εξονίων. http://www.genome.gov/Images/EdKit/bio2j_large.gif

Τι εξηγεί τη διακύμανση στο μέγεθος του γονιδιώματος;
Δεν υπάρχει καλή συσχέτιση μεταξύ του μεγέθους του σώματος ή της πολυπλοκότητας ενός οργανισμού και του μεγέθους του γονιδιώματός του. Τα ευκαρυωτικά γονιδιώματα που έχουν αλληλουχηθεί μέχρι στιγμής έχουν μεταξύ τους

30.000 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, ή λιγότερο από 10πλάσια διακύμανση στον αριθμό των γονιδίων. Το ανθρώπινο γονιδίωμα έχει περίπου 21.000 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (που αναθεωρήθηκαν πρόσφατα σε ελάχιστα

19.000 γονίδια). Επομένως, η 10.000-πλάσια διακύμανση στο μέγεθος του ευκαρυωτικού γονιδιώματος οφείλεται κυρίως σε ποικίλες ποσότητες μη κωδικοποιητικού DNA.
Ακολουθεί μια γρήγορη σύγκριση του μεγέθους του γονιδιώματος και του προβλεπόμενου αριθμού γονιδίων για μια δειγματοληψία ευκαρυωτών:

Είναι πολύ ενδιαφέρον να σημειωθεί ότι οι άνθρωποι έχουν περίπου τον ίδιο αριθμό γονιδίων με το μικροσκοπικό νηματώδη σκουλήκι, C. elegans και λιγότερα γονίδια από το ρύζι.

Τι υπάρχει στο ανθρώπινο γονιδίωμα;

Το περιεχόμενο του ανθρώπινου γονιδιώματος, από τη Wikipedia

  • Οι αλληλουχίες DNA που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (εξόνια) αποτελούν λιγότερο από το 2% του ανθρώπινου γονιδιώματος.
  • Τα ιντρόνια αποτελούν λίγο περισσότερο από το 1/4 του ανθρώπινου γονιδιώματος.
  • Τα μετατιθέμενα στοιχεία και το DNA που προέρχονται από αυτά αποτελούν περίπου το 1/2 του ανθρώπινου γονιδιώματος. Τα μετατιθέμενα στοιχεία είναι ουσιαστικά “παρασιτικό” DNA που βρίσκεται σε ένα γονιδίωμα ξενιστή, καταλαμβάνοντας χώρο στο γονιδίωμα αλλά δεν συνεισφέρουν χρήσιμες ή λειτουργικές αλληλουχίες στο γονιδίωμα. Είναι τα τρανσποζόνια DNA, τα ρετροτρανσποζόνια LTR, τα LINEs και τα SINE.
  • Επειδή είναι παρασιτικά στοιχεία DNA, τα μεταφερόμενα στοιχεία είναι εξαιρετικά πολύτιμα για τη μελέτη των εξελικτικών σχέσεων. Εάν ένα μεταφερόμενο στοιχείο “εισβάλλει””” ένα γονιδίωμα ενός οργανισμού, τότε είναι πιθανό να παραμείνει σε αυτό το γονιδίωμα καθώς ο πληθυσμός εξελίσσεται και όταν εμφανίζεται η ειδογένεση. Εάν το ίδιο μεταφερόμενο στοιχείο υπάρχει στην ίδια θέση στα γονιδιώματα δύο διαφορετικών ειδών, αυτό είναι ισχυρή απόδειξη ότι αυτά τα δύο είδη μοιράζονται έναν πρόσφατο κοινό πρόγονο που είχε επίσης το μεταφερόμενο στοιχείο στο γονιδίωμά του.
  • Μια οικογένεια SINE, που ονομάζεται στοιχείο Alu, είναι μια αλληλουχία 300 νουκλεοτιδίων που υπάρχει σε πάνω από 1 εκατομμύριο αντίγραφα σε γονιδιώματα ανθρώπων και χιμπατζήδων.
  • Οι τμηματικοί διπλασιασμοί είναι σχετικά μεγάλα (> 1 kb kb = 1.000 bp) τμήματα του DNA που έχουν διπλασιαστεί. Αυτοί οι διπλασιασμοί δημιουργούν αντίγραφα γονιδίων που μπορούν να μεταλλαχθούν και να αποκτήσουν νέες λειτουργίες. Οι οικογένειες γονιδίων (π.χ. άλφα- και βήτα-αιμοσφαιρίνη, μυοσφαιρίνη) προέκυψαν με αυτόν τον τρόπο.

Είναι το ανθρώπινο γονιδίωμα 80% “junk” ή 80% λειτουργικό;
Πρόσφατη δημοσίευση δεδομένων και εγγράφων από το έργο ENCODE, μια συστηματική έρευνα της ποικιλίας και της δραστηριότητας του ανθρώπινου γονιδιώματος από τις τροποποιήσεις της χρωματίνης έως τη μεταγραφή, ισχυρίστηκε ότι, σε αντίθεση με την προηγούμενη πεποίθηση, πλήρως το 80% του ανθρώπινου γονιδιώματος έχει τουλάχιστον κάποια βιοχημική δραστηριότητα. όπως η μεταγραφή (The ENCODE Project Consortium, 2012). Πράγματι, πολλά μικρά RNA, που ονομάζονται microRNAs (miRNAs) με σημαντικούς ρυθμιστικούς ρόλους, μεταγράφονται από διαγονιδιακές περιοχές. Ωστόσο, αυτά τα miRNA και άλλα ρυθμιστικά RNA αποτελούν λιγότερο από το 1% του ανθρώπινου γονιδιώματος και άλλες μελέτες έχουν δείξει ότι μόνο το 10% του γονιδιώματος φαίνεται να υπόκειται σε κάποιο εξελικτικό περιορισμό (ανασκόπηση Palazzo και Gregory, 2014).

Αλληλουχία DNA
Το έργο του ανθρώπινου γονιδιώματος ολοκληρώθηκε από μεγάλες τράπεζες αυτοματοποιημένων αναλυτών αλληλουχίας που χρησιμοποιούσαν την τεχνολογία διδεοξυ αλληλουχίας Sanger. Τα τελευταία χρόνια, ωστόσο, οι μαζικά παράλληλες τεχνολογίες αλληλούχισης έχουν μειώσει το κόστος και την απόδοση της αλληλουχίας DNA πολύ πιο γρήγορα από ό,τι έχει αυξηθεί η υπολογιστική ταχύτητα και ισχύς (νόμος Moore’s).

Οι συνέπειες για τη δυνατότητα απόκτησης τεράστιων ποσοτήτων αλληλουχίας DNA γρήγορα και φθηνά έχει εκπληκτικές συνέπειες για τη βιολογική έρευνα σε όλους τους τομείς και για την ανθρώπινη υγεία. Το TedTalk παρακάτω από τον Richard Resnick συζητά μερικές από τις εφαρμογές:


Αποτελέσματα και συζήτηση

Μιτοχονδριακή γενετική ποικιλότητα κατά μήκος S. cerevisiae πληθυσμός

Εξερευνήσαμε το 1011 S. cerevisiae απομονώσεις αλληλουχίας [47] για τη διερεύνηση της ενδοειδικής ποικιλομορφίας και εξέλιξης του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. Δεδομένου ότι τα μιτοχονδριακά γονιδιώματα περιλαμβάνουν μεταβλητές μακριές πλούσιες σε ΑΤ διαγονιδιακές περιοχές που είναι δύσκολο να συγκριθούν, εστιάσαμε αρχικά στις οκτώ μιτοχονδριακές κωδικοποιητικές αλληλουχίες DNA (CDS). Από 698 de novo συγκροτήματα γονιδιώματος, συλλέξαμε τα οκτώ πλήρη CDS. Από αυτά, 553 απομονώσεις είχαν επίσης μια πλήρη ή σχεδόν πλήρη μιτοχονδριακή αλληλουχία. Ένα υποσύνολο 353 αλληλουχιών γονιδιώματος δεν είχε καμία διφορούμενη βάση στα CDS (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S1, Πρόσθετο αρχείο 2: Πίνακας S1). Υπολογίσαμε την παγκόσμια γενετική ποικιλότητα με τη μέση απόκλιση ανά ζεύγη π. Συνολικά, παρατηρήσαμε χαμηλότερη ποικιλομορφία στην κωδικοποίηση πυρηνικών (π

0,003) [47] σε σύγκριση με τις μιτοχονδριακές αλληλουχίες (π

0,0085, Πρόσθετο αρχείο 2: Πίνακας S2), το οποίο έρχεται σε αντίθεση με αυτό που παρατηρήθηκε προηγουμένως για άλλα είδη ζυμομύκητα (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S2). Αυτή η αντίθετη τάση, περισσότερο παρόμοια με το πρότυπο που παρατηρείται στα ζώα παρά στους μύκητες [19, 48], είναι συνεπής με S. cerevisiae παρουσίασε ταχεία εξέλιξη των μιτοχονδριακών γονιδίων μετά από ολόκληρο τον διπλασιασμό του γονιδιώματος [49].

Παρατηρήσαμε έντονες διαφορές γενετικής απόκλισης των πυρηνικών και μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων μεταξύ άγριων και εξημερωμένων απομονώσεων. Σε άγριους κλάδους, παρά την υψηλότερη πυρηνική απόκλιση (έως 1,1% σε επίπεδο CDS), η γενετική απόσταση του μιτοχονδριακού CDS φτάνει στο μέγιστο

0,4% της πυρηνικής απόκλισης και οροπέδιο μετά. Αντίθετα, η απόκλιση της μιτοχονδριακής αλληλουχίας μεταξύ των εξημερωμένων κλάδων έχει μεγαλύτερη αύξηση, φθάνοντας στο μέγιστο σε χαμηλότερες πυρηνικές αποκλίσεις (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S3). Αυτή η διαφορά στην παραλλαγή παρατηρείται σε όλα τα μιτοχονδριακά CDS των οποίων οι τιμές του π είναι συστηματικά υψηλότερες στα εξημερωμένα σε σύγκριση με τα άγρια ​​απομονωμένα στελέχη.

Τα πιο σύντομα CDS, ATP8 και ATP9, έχουν τη χαμηλότερη αναλογία πολυμορφικών θέσεων (

2%) και οι χαμηλότερες τιμές του π (0,003 ή λιγότερο) και δεν έχουν μη συνώνυμες μεταλλάξεις. Σε αντίθεση, COX1 και COX2 είναι πολύ πολυμορφικά. Παρόλο COX1 έχει τις υψηλότερες πολυμορφικές θέσεις (8%), COX2 έχει το υψηλότερο π τιμή (0,0163, Πίνακας 1). Χρησιμοποιήσαμε τις διακριτικές αναλύσεις του κύριου συστατικού (DAPC) [50] για να αξιολογήσουμε τη συμβολή συγκεκριμένων γονιδίων στην ταξινόμηση των μιτοχονδριακών «απλοτύπων» και της ομαδοποίησης πληθυσμών. Το προσδιορίσαμε ποσοτικά ATP6 και COX2 αντιστοιχούν στο 38% και το 28% της ομαδοποίησης του πληθυσμού. Αυτή η παρατήρηση υποστηρίζει την ευρεία χρήση του COX2 στη μιτοχονδριακή φυλογένεση (Εικ. 1α) [37, 38, 51, 52].

Κατανομή αλληλόμορφων στα μιτοχονδριακά CDS. ένα Κατανομή μείζονος (μπλε) και δευτερεύοντος (κόκκινο) αλληλόμορφο για τις 259 πολυμορφικές θέσεις στις 234 S. cerevisiae μοναδικά πλήρη προφίλ (τα οποία περιλαμβάνουν 353 απομονώσεις). Τα προφίλ ταξινομούνται σύμφωνα με τη φυλογενετική τους σχέση χρησιμοποιώντας το φυλογενετικό δέντρο γειτονικής ένωσης (αριστερή πλευρά). σι Οι αριθμοί των μοναδικών αλληλόμορφων για κάθε μιτοχονδριακό CDS δείχνουν μια δραματική διαφορά μεταξύ των γονιδίων

Στη συνέχεια, δημιουργήσαμε μια μη περιττή βάση δεδομένων αλληλόμορφων. Παρατηρήσαμε έναν μεταβλητό αριθμό διακριτών αλληλόμορφων CDS (Εικ. 1β), με αποτέλεσμα υψηλό ποσοστό μοναδικών αλληλόμορφων προφίλ (234 από 353 απομονώσεις, Πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S1). Χρησιμοποιήσαμε αυτά τα μη περιττά αλληλικά προφίλ ως υποκατάστατο για να διερευνήσουμε την κατανομή του μιτοχονδριακού γονιδιώματος στον πληθυσμό. Σε παγκόσμιο επίπεδο, παρατηρήσαμε μια κακή επικάλυψη μεταξύ της φυλογενετικής γραμμής του μιτοχονδριακού και του πυρηνικού γονιδιώματος [47] με λίγες εξαιρέσεις που περιλαμβάνουν σχεδόν κλωνικές γενεαλογίες πυρηνικού γονιδιώματος, με συγκεκριμένα μιτοχονδριακά προφίλ. Αυτές οι εξαιρέσεις περιλαμβάνουν μια υποκατηγορία Sake, τις δύο κλινικές υποκατηγορίες Wine/European (ενίσχυση Y' και S. boulardii), της Βόρειας Αμερικής και των αναπαραγωγικά απομονωμένων κλάδων της Μαλαισίας [53]. Αντίθετα, το clade μικτής προέλευσης [47], το οποίο έχει μεγάλη ποικιλία οικολογικών (π.χ. αρτοποιεία, μπύρα, φυτά, ζώα, νερό, κλινικό δείγμα) και γεωγραφική προέλευση (π.χ. Ευρώπη, Ασία, Μέση Ανατολή, Αμερική), εμφανίζει χαμηλή ενδομιτοχονδριακή -διαφορά κλάσης παρά τη σημαντική διαφοροποίηση του πυρηνικού γονιδιώματος (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S4). Πράγματι, σε όλη την κλάση μικτής προέλευσης, διαχωρίζονται μόνο πολύ παρόμοια προφίλ μιτοχονδριακών γονιδίων, με παραλλαγές που περιορίζονται σε COX1 και VAR1, με αποτέλεσμα πολύ χαμηλή π (0,00008) σε σύγκριση με άλλες κλάσεις (

0,001, Πρόσθετο αρχείο 2: Πίνακας S2).

ο VAR1 Το γονίδιο είναι ένα ιδιαίτερα μεταβλητό, πολύ πλούσιο σε AT και επιρρεπές σε μη συνώνυμες μεταλλάξεις και indels. Αυτά τα indels αντιπροσωπεύουν ως επί το πλείστον στοιχεία που μοιάζουν με byp πλούσια σε GC ικανά να προκαλέσουν άλματα στη μετάφραση πρωτεϊνών σε άλλα είδη ζύμης [33]. Περιγράφηκαν δύο θέσεις, η μία ονομάστηκε «κοινή» και η άλλη κατάντη με σύμπλεγμα GC σε ανεστραμμένο προσανατολισμό [54]. Προσδιορίσαμε 35 αλληλόμορφες παραλλαγές του VAR1 γονίδιο που φιλοξενεί αυτές τις δύο συστάδες σε 117 απομονώσεις, που ανήκουν κυρίως στις ομάδες μωσαϊκού (Ν = 52) (Επιπλέον αρχείο 2: Πίνακας S1). Ενώ οι περισσότερες από τις αναφερόμενες περιπτώσεις περιείχαν το σύμπλεγμα GC είτε στην κοινή (Ν = 91, αντιπροσωπεύοντας 18 διαφορετικά VAR1 αλληλόμορφα), ή και στις δύο θέσεις (Ν = 6, σε 4 VAR1 αλληλόμορφα) [54], ένα μεγάλο κλάσμα των παρατηρούμενων αλληλικών παραλλαγών εδώ φιλοξενούσε μόνο το σύμπλεγμα GC στη δεύτερη θέση (Ν = 19, σε 13 VAR1 αλληλόμορφα). Ανακαλύψαμε επίσης δύο νέες παραλλαγές, τη μία με σύμπλεγμα GC στην κοινή θέση αλλά σε ανεστραμμένο προσανατολισμό (2 απομονώσεις) και τη δεύτερη με το σύμπλεγμα GC σε διπλό διπλασιασμό στη δεύτερη θέση (3 απομονώσεις).

Εκτός από τα κανονικά ORF, χαρακτηρίσαμε τα τέσσερα μη κανονικά ORF F-SceIV (ΩΜΕΓΑ ιντρόνιο), F-SceI (RF3), RF2 και F-SceIII (RF1) [31, 32]. F-SceIV είναι σχετικά ασυνήθιστο στον πληθυσμό (198 απομονώσεις), ενώ F-SceI, RF2 και F-SceIII είναι πιο διαδεδομένα (447, 542 και 477 απομονώσεις, αντίστοιχα). Αυτά τα τρία ORF είναι γνωστό ότι περιέχουν συμπλέγματα GC, τα οποία συχνά εισάγουν μετατοπίσεις πλαισίου στις ακολουθίες. Σε F-SceIII, εντοπίσαμε τρεις θέσεις συμπλέγματος GC. Η πρώτη θέση είναι ιδιαίτερα σπάνια (43 απομονώσεις) και σε δύο περιπτώσεις, το σύμπλεγμα GC είναι περικομμένο. Τα άλλα δύο συμπλέγματα GC είναι πολύ πιο άφθονα (σε 277 και 206 απομονώσεις, αντίστοιχα). Εντοπίσαμε 6 διακριτές θέσεις συμπλέγματος GC και στα δύο RF2 και F-SceI (βλ. Πρόσθετο αρχείο 2: Πίνακας S1). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα αποκάλυψαν υψηλή μεταβλητότητα της μιτοχονδριακής αλληλουχίας σε όλη την περιοχή S. cerevisiae φυσικός πληθυσμός.

Εκτεταμένη πρόσμιξη μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων

Ερευνήσαμε τη δομή του πληθυσμού του μιτοχονδριακού γονιδιώματος χρησιμοποιώντας τα οκτώ συνδεδεμένα CDS για να υπολογίσουμε το φυλογενετικό δίκτυο χρησιμοποιώντας το SPLITSTREE [55]. Το σύνολο δεδομένων περιλαμβάνει 239 μη περιττά προφίλ CDS, με 234 S. cerevisiae απομονώσεις με πλήρεις ακολουθίες CDS και πέντε Σ. παράδοξος αντιπροσώπους [56] ως εξωτερικές ομάδες. Το προκύπτον διαπλεκόμενο δίκτυο δείχνει μια ισχυρή διασυνδεσιμότητα των ακολουθιών, υποκείμενος συχνός ιστορικός ανασυνδυασμός (Εικ. 2α). Αντίθετα, τα κλασικά φυλογενετικά δέντρα δεν μπορούν να ομαδοποιήσουν με συνέπεια τα απομονωμένα στελέχη (Εικ. 2β). Χρησιμοποιώντας το ADMIXTURE [57], παρατηρήσαμε ότι οι απέναντι άκρες των δέντρων πέφτουν στον ίδιο πληθυσμό για χαμηλό κ αξίες (κ = 2–3), υπογραμμίζοντας περαιτέρω μια κακή ομαδοποίηση.

Σύνθετη φυλογένεση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. Μόνο S. cerevisiae έχουν χρησιμοποιηθεί απομονώσεις με πλήρη δεδομένα CDS (Ν = 353) εκτός από πέντε Σ. παράδοξος απομονώσεις που χρησιμοποιούνται ως εξωομάδα. ένα Φυλογενετικό δίκτυο μη πλεονασματικών συνδεόμενων ακολουθιών CDS (Ν = 237 προφίλ) παρήγαγε ένα εξαιρετικά διαπλεκόμενο δίκτυο που οδηγείται από ανασυνδυασμό με λίγες ομάδες στενά συνδεδεμένων στελεχών. σι Το δέντρο με ρίζες (αριστερά) δείχνει μια αδύναμη τοπολογία με λίγους κόμβους (κόκκινο) με τιμές bootstrap πάνω από 75. Ανάλυση ADMIXTURE γονιδιωματικών συστατικών (δεξιά) με κ που κυμαίνεται από 2 έως 15 επιβεβαιώνει τον υψηλό βαθμό ψηφιδωτού. Η άκρως αποκλίνουσα γενεαλογία της Ταϊβάν (πράσινη κουκκίδα) δεν αποκλίνει από τις άλλες γενεές σε αντίθεση με τη φυλογένεση του πυρηνικού γονιδιώματος

Η δομή του μιτοχονδριακού πληθυσμού φαίνεται να αντικατοπτρίζει ελάχιστα τη συστάδα που λαμβάνεται από το πυρηνικό γονιδίωμα. Για παράδειγμα, η πρώιμη αποκλίνουσα καταγωγή της Ταϊβάν που βασίζεται στο πυρηνικό γονιδίωμα δεν δείχνει μεγαλύτερη απόσταση αλληλουχίας. Ωστόσο, απομονώσεις που ανήκουν στις ψηφιδωτές ομάδες του S. cerevisiae Ο πληθυσμός εμφανίζει τους υψηλότερους βαθμούς πρόσμειξης, υποδεικνύοντας ότι η επιδημία έχει επηρεάσει τόσο το μιτοχονδριακό όσο και το πυρηνικό γονιδίωμα.

Στη συνέχεια, υπολογίσαμε τον συντελεστή συμφωνίας «W» χρησιμοποιώντας τη μέτρηση της συνάφειας μεταξύ του πίνακα αποστάσεων (CADM) [58] σε 0,79, με το 0 να δείχνει πλήρη διαφωνία και το 1 πλήρη συμφωνία μεταξύ των πινάκων απόστασης. Αυτή η τιμή υποδεικνύει μια σχετικά καλή συμφωνία μεταξύ των φυλογενετικών δικτύων μιτοχονδριακών και πυρηνικών γονιδιωμάτων. Αυτό πιθανότατα οφείλεται σε απομονώσεις με πολύ κοντινή μιτοχονδριακή αλληλουχία που συχνά έχουν επίσης παρόμοια αλληλουχία πυρηνικού γονιδιώματος, ενώ οι κύριοι κλάδοι του μιτοχονδριακού δέντρου είναι ασύμφωνοι. Συγκρίναμε περαιτέρω φυλογενετικά δέντρα και δίκτυα που βασίζονται σε συνενωμένες αλληλουχίες που προέρχονται από τα 8 μιτοχονδριακά CDS και 8 πυρηνικά γονίδια που χρησιμοποιήθηκαν προηγουμένως για φυλογενετικές μελέτες [59, 60] σε μια επιλογή 14 απομονώσεων (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S5).Με συνέπεια, οι μιτοχονδριακές αλληλουχίες οδήγησαν σε ένα ευρύτερο δίκτυο, υπονοώντας μια λιγότερο καθορισμένη φυλογενετική δομή και πιο έντονη πρόσμιξη, με πρώιμες διακλαδώσεις να εμπίπτουν στις παγκόσμιες μη κινεζικές γενεές. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας υπογραμμίζουν έναν έντονο διαχωρισμό στις εξελικτικές ιστορίες των δύο συνυπαρχόντων γονιδιωμάτων και η εκτεταμένη ανάμειξη μιτοχονδριακού γονιδιώματος παρέχει πρόσθετη υποστήριξη στη μιτοχονδριακή κληρονομιά του που απαιτεί αντιγραφή που βασίζεται στον ανασυνδυασμό [34, 61, 62].

Οι ενδοειδικές εισβολές του mtDNA είναι σπάνιες

Πρόσφατα περιγράψαμε τέσσερις κλάδες (δηλαδή Alpechin, Μεξικάνικη Αγαύη, Γαλλική Γουιάνα και Βραζιλιάνικη βιοαιθανόλη) με άφθονη Σ. παράδοξος ενδοειδικές εισβολές στο πυρηνικό γονιδίωμα [47]. Αναλύσαμε τα μιτοχονδριακά CDS για να αναζητήσουμε εισερχόμενα αλληλόμορφα. Οι τέσσερις κλάδες με άφθονες εισβολές πυρηνικού γονιδιώματος δεν έδειξαν καμία Σ. παράδοξος μιτοχονδριακά αλληλόμορφα. Εντούτοις, δύο απομονώσεις από την Αμερική (CQS, YCL) και ένα από την Αφρική (ADE), όλα γενετικά σχετιζόμενα με τη Γαλλική Γουιάνα και την Μεξικανική Αγαύη, φιλοξενούν δύο διαφορετικά πρότυπα Σ. παράδοξος μιτοχονδριακές εισβολές. Ανακτήσαμε το πλήρες σετ CDS για δύο από αυτά (CQS και YCL), ενώ το τρίτο (ADE) είναι ημιτελές αλλά πολύ κοντά στο YCL. Η εισβολή των μιτοχονδρίων στο στέλεχος YCL (YJM1399) έχει ήδη αναφερθεί, αλλά δεν παρουσιάστηκαν περαιτέρω αναλύσεις [28]. Δημιουργήσαμε ένα σύνολο πολυμορφικών δεικτών (μεθόδων), για να προσδιορίσουμε με ακρίβεια τα όρια εισβολής. ο S. cerevisiae Τα κύρια αλληλόμορφα ταυτοποιήθηκαν από τις 1011 απομονώσεις, ενώ για Σ. παράδοξος, προήλθαν από 23 απομονώσεις της Βόρειας Αμερικής για τις οποίες ήταν διαθέσιμη πλήρης χρωμοσωμική αλληλουχία [21, 56]. Ευρασιατική Σ. παράδοξος απομονώσεις δεν συμπεριλήφθηκαν λόγω της ομοιότητάς τους με S. cerevisiae ακολουθίες, πιθανόν λόγω αρχαίου γεγονότος εισβολής από S. cerevisiae προς το Σ. παράδοξος [21, 56, 63]. Δημιουργήσαμε έναν κατάλογο 110 πολυμορφικών θέσεων και εξάγαμε διαφορετικά αλληλόμορφα μεταξύ των δύο ειδών. Αρκετά γονίδια σε αυτές τις δύο απομονώσεις καταλογίστηκαν είτε ως εν μέρει είτε ως πλήρως εισχωρημένα (Εικ. 3α). Δεδομένου ότι η συχνότητα ορισμένων αλληλόμορφων είναι κοντά στο 50% και συχνά το λιγότερο κοινό αλληλόμορφο ενός είδους είναι το πιο κοινό αλληλόμορφο του δεύτερου, υπάρχει πιθανότητα να ονομαστούν ψευδώς θετικές εισβολές. Παρόλα αυτά, μακρά συνεχόμενη σειρά από Σ. παράδοξος μαρκαδόρος στο ΚΑΛΑΜΠΟΚΙ, ATP9, COX1, COX2 και COX3 γονίδια στο YCL, καθώς και εκείνα στο ΚΑΛΑΜΠΟΚΙ, COX1, COX2 και COX3 γονίδια στο CQS, είναι πιθανό να είναι γνήσια. Η απουσία ιχνών εισβολής στο S. cerevisiae απομονώσεις από την Ευρώπη θα μπορούσαν να εξηγηθούν από την υψηλότερη ομοιότητα αλληλουχίας με την ευρωπαϊκή Σ. παράδοξος, που εμποδίζουν τον εντοπισμό. Ωστόσο, εισβολές μεταξύ S. cerevisiae και ευρωπαϊκή Σ. παράδοξος Τα απομονωμένα στελέχη θα μπορούσαν επίσης να αποτραπούν από τη μη συγγραμμικότητα στη δομή των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων τους που πιθανώς επηρεάζουν τον ανασυνδυασμό [56].

Σπάνιος Σ. παράδοξος εισβολές. ένα Πολυμορφικοί δείκτες μεταξύ S. cerevisiae και Σ. παράδοξος στα μιτοχονδριακά CDS χρησιμοποιήθηκαν για τον εντοπισμό συμβάντων εισόδου. Τα όρια εισόδου ορίζονται ως το μέσο μεταξύ των δεικτών. Οι δύο κάτω σειρές υποδεικνύουν τη συχνότητα στον πληθυσμό του κύριου ή συναινετικού αλληλόμορφου (AF), στη συγκεκριμένη θέση και είδος. σι Ο αριθμός των εισερχόμενων ORF στο πυρηνικό γονιδίωμα δεν συσχετίζεται με το ποσοστό των γενετικών δεικτών Σ. παράδοξος σε μιτοχονδριακά CDS. Συμπεριλήφθηκαν μόνο απομονώσεις με πλήρη αδιαμφισβήτητα δεδομένα CDS (Ν = 353). Θέση απομόνωσης που αναφέρεται στο ένα είναι κυκλωμένο με κόκκινο χρώμα

Επεκτείνουμε περαιτέρω την ανάλυση των 110 πολυμορφικών θέσεων σε 353 απομονώσεις με πλήρως συναρμολογημένα CDS. Παρατηρήσαμε επιπλέον πιθανές περιπτώσεις μιτοχονδριακών εισβολών. Η απομονωμένη μιτοχονδριακή αλληλουχία YCL φιλοξενεί πάνω από το 50% του Σ. παράδοξος δείκτες, που πιθανώς υποδεικνύουν ένα ανασυνδυασμένο γονιδίωμα που προέρχεται από ένα πρόσφατο γεγονός μεταφοράς. Επιπλέον, ένας μικρός αριθμός από Σ. παράδοξος δείκτες βρίσκονται σε καθεμία S. cerevisiae απομόνωση, ίσως λόγω ελλιπούς γενεαλογικής ταξινόμησης. Συνολικά, ο αριθμός των Σ. παράδοξος Οι δείκτες στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα δεν συσχετίζονται με τον αριθμό των εισερχόμενων ORF στα πυρηνικά γονιδιώματα (Εικ. 3β), υποδηλώνοντας ότι οι ροές γονιδίων μεταξύ των ειδών ήταν ανεξάρτητες λόγω διακριτής προέλευσης ή/και μοίρας.

Κέρδος και απώλεια εσωνίων κατά την εξέλιξη και τη διασπορά

Δύο μιτοχονδριακά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, ΚΑΛΑΜΠΟΚΙ και COX1, φιλοξενούν ιντρόνια σε πολλαπλές τοποθεσίες και εξερευνήσαμε τα μοτίβα παρουσίας-απουσίας τους σε ολόκληρη τη συλλογή απομόνωσης 1011. COX1 Τα εσώνια βρίσκονται σε ποικίλες συχνότητες (διάμεσος 0,48) με εξαιρετικά μεταβλητά προφίλ παρουσίας-απουσίας (Εικ. 4α). Τα μοτίβα ιντρονίων υποστηρίζουν περαιτέρω χαμηλή μεταβλητότητα εντός των γενεών προέλευσης της Βόρειας Αμερικής, της Μαλαισίας και της μικτής προέλευσης (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S6). Αντίθετα, οι ομάδες των μωσαϊκών που σχετίζονται χαλαρά (συστάδες M1, M2 και M3) παρουσιάζουν το χαμηλότερο επίπεδο διατήρησης ιντρονίων, σύμφωνα με το αναμεμιγμένο γενετικό τους υπόβαθρο.

Η φυλογένεση του ιντρονίου αποτελεί τη βάση και των γεγονότων απώλειας και κέρδους. ένα Η κατανομή της παρουσίας και της απουσίας ιντρονίων δεν είναι σύμφωνη με τη φυλογένεση του μιτοχονδριακού δέντρου. Τα σπάνια εσώνια bi1α και ai3β επισημαίνονται (έντονα) το εσώνιο ai4γ δεν βρέθηκε στην ακολουθούμενη συλλογή και δεν φαίνεται. σι Μόνο 4 μη περιττές αλληλουχίες έχουν βρεθεί για το εσώνιο cox1 ai3β. Οι αλληλουχίες τους δεν σχετίζονται με άλλες Σακχαρομύκητα είδη, τα οποία δεν μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για ριζοβολία. Η ιδιαιτερότητα της κατανομής αυτού του ιντρονίου θα μπορούσε να υποδηλώνει ένα γεγονός κέρδους για συγκεκριμένη γενεαλογία. ντο ριζωμένο δέντρο του ΚΑΛΑΜΠΟΚΙ ιντρόνιο bi1α χρησιμοποιώντας Σ. παράδοξος και S. eubayanus ακολουθίες ως εξωομάδα. Οι κόμβοι με τιμές bootstrap κάτω από 0,5 έχουν συμπτύξει. Η παρουσία του σε πολλαπλές άκρως αποκλίνουσες ασιατικές γενεαλογίες και σε άλλες Σακχαρομύκητα είδος είναι συνεπής με την απώλεια ιντρονίων μετά τη διασπορά εκτός Κίνας. Το απομονωμένο CQS, το οποίο φιλοξενεί εισβολή τόσο στο πυρηνικό όσο και στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα, προέρχεται επίσης από Σ. παράδοξος προέλευση. Αυτό είναι συμβατό με την κατάντη εξωνική αλληλουχία, η οποία επίσης είναι εισερχόμενη

ο COX1 Οι συχνότητες ιντρονίων στον πληθυσμό είναι συνεπείς με την προηγούμενη αναφορά [28] και κυμαίνονται από 26 έως 86%. Εντοπίσαμε συνολικά 103 διαφορετικά COX1 συνδυασμοί ιντρονίων με δύο εσώνια, το ai4β και το ai5α, που δεν βρίσκονται ποτέ μαζί (το ai4β είναι στο 89 ενώ το ai5α στο 85, από τα 408 αλληλόμορφα). Δεδομένης της σύνδεσης μεταξύ αυτών των στενά απέχουσες ιντρονικές θέσεις, είτε αναπτύχθηκαν σε δύο προγονικούς πληθυσμούς είτε είναι απίθανο να ενωθούν με ανασυνδυασμό ή η διπλή παρουσία είναι λειτουργικά ασυμβίβαστη. Δύο επιπλέον COX1 εσώνια, ai3β και ai4γ, είναι πολύ σπάνια σε S. cerevisiae πληθυσμός. Ενώ το aI4γ επίσης απουσιάζει στα περισσότερα σχετικά Σακχαρομύκητα είδη, το ιντρόνιο ai3β υπάρχει σε όλα αυτά. Η μόνη εμφάνιση του ai3β έχει αναφερθεί προηγουμένως σε S. cerevisiae βρισκόταν στην απομόνωση YCL, η οποία επίσης περιέχει Σ. παράδοξος εισβολή γύρω από τη θέση ιντρόν μέσα COX1. Ωστόσο, αν και το εσώνιο ai3β υπάρχει σε Σ. παράδοξος, η αλληλουχία εσωνίου ai3β του YCL είναι πιο κοντά σε αυτή που βρίσκεται σε Lachancea meyersii [28]. Εκτός από το αλληλόμορφο YCL, βρήκαμε άλλες τρεις παραλλαγές του ai3β, όλες σχετικές με το Lachancea αλληλουχία. Δύο παραλλαγές υπάρχουν σε απομονώσεις YCL και ADE με άφθονη Σ. παράδοξος εισβολές, ενώ το στέλεχος CQS έχει σχετική έκδοση. Πρόσθετο εσώνιο ai3β υπάρχει σε δύο ασιατικές απομονώσεις και σε 19 απομονώσεις της Γαλλικής Γουιάνας, των οποίων η κλάση είναι πολύ εισχωρημένη από Σ. παράδοξος (Εικ. 4β). Η παρουσία του ιντρονίου ai3β μεταξύ αυτών των υψηλά εισερχόμενων σειρών υποδηλώνει ξεχωριστά γεγονότα πλευρικής μεταφοράς από Lachancea, αν και δεν μπορεί να αποκλειστεί ότι αυτά τα εσώνια μεταφέρθηκαν αρχικά από Lachancea, ή ένα σχετικό γένος, με Σ. παράδοξος πριν συμβεί η εισβολή.

Αντίθετα, οι έξι ΚΑΛΑΜΠΟΚΙ τα εσώνια είναι πιο ομοιόμορφα παρόντα (συχνότητες που κυμαίνονται από 88 έως 99%, Εικ. 4α) με τη μόνη εξαίρεση του πρόσφατα περιγραφόμενου bi1α [28] που εμφανίζεται σε χαμηλή συχνότητα (

5%). Παραδόξως, το bi1α είναι κοινό μεταξύ των ασιατικών κλάδων πρώιμης διακλάδωσης [47]. Άλλες απομονώσεις το φιλοξενούν, κυρίως απομονώσεις μωσαϊκού, αλλά διαχωρίζονται σε χαμηλή συχνότητα σε μη ασιατικές κλαδεύσεις. Η παρουσία του σε αρκετές Σακχαρομύκητα είδη εξωομάδας και στο S. cerevisiae Οι πρώιμες αποκλίνουσες γενεές υποδηλώνουν απώλεια πριν ή κατά τη διάρκεια της διασποράς εκτός Ασίας. Το εσώνιο θα μπορούσε να είχε εισαχθεί ξανά, από δευτερεύουσες επαφές με ασιατικές γραμμές θετικές bi1α. Για να ελέγξουμε αυτές τις υποθέσεις, κατασκευάσαμε ένα φυλογενετικό δέντρο χρησιμοποιώντας όλες τις αλληλουχίες και τις εξωομάδες εσωνίων bI1a (Εικ. 4c). Το φυλογενετικό δέντρο bi1α εμφανίζει περισσότερες παραλλαγές ασιατικών αλληλουχιών σε σύγκριση με τις μη ασιατικές, οι οποίες συγκεντρώνονται κυρίως σε δύο ομάδες που προέρχονται από διαχωρισμένους κλάδους ασιατικών ιντρονίων, σύμφωνα με πολλαπλά ξεχωριστά συμβάντα ανάκτησης στον παγκόσμιο πληθυσμό.

Τα αυτοσυνδυαζόμενα εσώνια έχουν συσχετιστεί με αυξημένες συχνότητες μεταλλάξεων στο οριακό εσώνιο/εξόνιο [29]. Σαρώσαμε τις εξωνικές αλληλουχίες σε ένα παράθυρο 70 νουκλεοτιδίων τόσο ανάντη όσο και κατάντη κάθε ιντρονίου σε COX1 και ΚΑΛΑΜΠΟΚΙ. Με συνέπεια, το εξαιρετικά κινητό COX1 Τα εσώνια συνδέονται με υψηλότερη συχνότητα εναλλακτικών αλληλόμορφων σε ένα παράθυρο 20 νουκλεοτιδίων δίπλα στα όρια εισαγωγής (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S7).

Οι δομικές αναδιατάξεις είναι σπάνιες στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα

Στη συνέχεια, διερευνούμε το μέγεθος και την παρουσία δομικής διαφοροποίησης στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα. Λαμβάνοντας υπόψη τα 250 κυκλοποιημένα συγκροτήματα, τα μεγέθη του μιτοχονδριακού γονιδιώματος κυμαίνονται από 73.450 έως 95.658 bp (Επιπλέον αρχείο 2: Πίνακας S3). Καθώς το περιεχόμενο γονιδίου διατηρείται εξ ολοκλήρου μεταξύ αυτών των απομονώσεων, αυτή η πλαστικότητα υψηλού μεγέθους οφείλεται στη μεταβλητότητα της διαγονιδιακής περιοχής (που κυμαίνεται από 45.254 έως 69.807 bp) και της περιεκτικότητας σε ιντρόνια (με μέγεθος από 7748 έως 20.024 bp) (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S8). Και οι δύο παράγοντες συσχετίζονται σε μεγάλο βαθμό με το συνολικό μήκος του μιτοχονδριακού γονιδιώματος (r 2 0,769 και 0,756, αντίστοιχα που σχετίζονται με συσχέτιση Π τιμές < 2.0E−04) (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S9). Το μέγεθος του μιτοχονδριακού γονιδιώματος ποικίλλει μεταξύ των απομονώσεων της ίδιας γενεαλογίας.

Η ανάλυση Synteny στα 553 απομονωμένα στελέχη με γονιδίωμα σε μεμονωμένο ικρίωμα υπογραμμίζει τέσσερις διακριτές γονιδιωματικές αναστροφές (Εικ. 5, Πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S10). Δύο ποικιλίες από τις σειρές μπύρας Wine/European και Ale, BKI και AQT, μοιράζονται μια αντιστροφή της περιοχής που κυμαίνεται από trnW έως COX2 γονίδιο, ενώ τρία στενά συνδεδεμένα στελέχη Wine/European (AIM, BNG και CFB) μοιράζονται μια μεγαλύτερη αναστροφή που περιλαμβάνει επίσης το γονίδιο 15S rRNA (Εικ. 5b, c). Αναστροφές βρέθηκαν επίσης σε BDN (αφρικανική μπύρα) και CDN (Εκουαδόρ) και σχετίζονται με περιοχές που κυμαίνονται από το 15S rRNA ή COX1 γονίδια, αντίστοιχα, στο ATP6 γονίδιο (Εικ. 5d, e). Όλα τα όρια αντιστροφής αντιστοιχίζονται σε εξαιρετικά επαναλαμβανόμενες διαγονιδιακές περιοχές πλούσιες σε ΑΤ, οι οποίες εμποδίζουν την ακριβή οριοθέτησή τους. Είναι ενδιαφέρον ότι όλες αυτές οι αναστροφές οδηγούν στην απώλεια ενός χαρακτηριστικού που μοιράζονται οι περισσότεροι ασκομυκήτες, δηλαδή ότι όλα τα γονίδια που κωδικοποιούν τις μιτοχονδριακές πρωτεΐνες μεταγράφονται από τον ίδιο κλώνο DNA [64]. Ωστόσο, οι μιτοχονδριακές λειτουργίες δεν φαίνεται να επηρεάζονται, καθώς αυτές οι απομονώσεις διατηρούν τις αναπνευστικές τους ικανότητες.

Δομικές παραλλαγές στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα. Σχηματική οργάνωση του μιτοχονδριακού γονιδιώματος με σχολιασμό για γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και γονίδια rRNA και tRNA. Οι κατά προσέγγιση θέσεις των σημείων διακοπής των αντιστροφών υποδεικνύονται με διακεκομμένες γραμμές. Αυτές οι οργανώσεις μιτοχονδριακού γονιδιώματος σχετίζονται με διαφορετικά στελέχη. ένα S288C (κοινόχρηστο στη συντριπτική πλειονότητα των απομονώσεων). σι AQI και BKI. ντο AIM, BNG και CFB. ρε CDN. μι BDN

Πρόσφατη αναφορά πρότεινε ότι η αλλαγή της σειράς γονιδίων στα γένη ζυμομυκήτων θα μπορούσε να σχετίζεται με το μέγεθος του μιτοχονδριακού γονιδιώματος [65]. Ενώ το Lachancea και Yarrowia clades, με μιτοχονδριακό γονιδίωμα μικρότερο από 50 kb, εμφανίζουν υψηλή συνενότητα μεταξύ των ειδών [66, 67], Σακχαρομύκητα clade (μέγεθος μιτοχονδριακού γονιδιώματος > 65 kb) είναι πιο επιρρεπές σε αναδιατάξεις [65]. Πράγματι, δομικές αναδιατάξεις ανιχνεύθηκαν επίσης στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα του Σ. παράδοξος [56]. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν ότι η δομική παραλλαγή του mtDNA μπορεί να είναι ανεκτή, ίσως περιορισμένη σε ισορροπημένα συμβάντα που δεν αλλάζουν τον αριθμό αντιγράφων CDS.

Η παραλλαγή στον αριθμό αντιγράφων mtDNA αποκαλύπτει φυσικές μικροκαμωμένες απομονώσεις

Ο αριθμός των μιτοχονδριακών αντιγράφων μπορεί να επηρεάσει δραματικά τους φαινοτύπους, αλλά είναι δύσκολο να μετρηθεί με μεθόδους υψηλής απόδοσης. Υπολογίσαμε τον αριθμό αντιγράφων mtDNA χρησιμοποιώντας τη σχετική κάλυψη του ATP6, COX2 και COX3, τα οποία παρέχουν ισχυρή χαρτογράφηση. Ο αριθμός των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων είναι γενικά σταθερός μεταξύ των κλάδων (Επιπρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S11), χωρίς σημαντικές διαφορές μεταξύ εξημερωμένων και άγριων γενεαλογιών, με διάμεσο 18 μιτοχονδριακά γονιδιώματα για κάθε απλοειδές πυρηνικό γονιδίωμα. Ωστόσο, η διακύμανση είναι ιδιαίτερα υψηλή στον πληθυσμό, φθάνοντας τα 80 αντίτυπα. Όπως αναφέρθηκε προηγουμένως [68], ο αριθμός αντιγράφων mtDNA κλιμακώνεται με την πλοειδία με γραμμικό τρόπο, με διπλοειδή στελέχη που έχουν περίπου διπλάσιο αριθμό μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων και τριπλοειδή που έχουν τριπλάσιο αριθμό, σε σύγκριση με τα απλοειδή κύτταρα (Εικ. 6α).

Φυσική παραλλαγή στον αριθμό αντιγράφων του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. ένα Ο αριθμός αντιγράφων του μιτοχονδριακού γονιδιώματος αυξάνεται γραμμικά με το περιεχόμενο του πυρηνικού γονιδιώματος. Ανιχνεύθηκαν 15 φυσικές μικροκαμωμένες απομονώσεις. Ο αριθμός των απομονώσεων υποδεικνύεται πάνω από το αντίστοιχο διάγραμμα. σι Η ανίχνευση κηλίδων σε μη ζυμώσιμη πηγή άνθρακα (YPEG) επιβεβαιώνει φυσικές μικροκαμωμένες απομονώσεις (εμφανίζεται ένα υποσύνολο δοκιμασμένων απομονώσεων). ντο Η μιτοχονδριακή δραστηριότητα (ως δυναμικό μεμβράνης) μεταβάλλεται έντονα από την έλλειψη μιτοχονδριακού γονιδιώματος (μαύρο έναντι γκρι συμβόλων), ενώ ο όγκος παραμένει αναλλοίωτος. ρε Διακύμανση της καμπύλης ανάπτυξης ισογονικών στελεχών με φυσιολογικά μιτοχόνδρια (rho + , κόκκινο), petite (rho 0 , πράσινο) και petite που φιλοξενούν την κατασταλτική μετάλλαξη ATP2G1099T (rho 0 ATP2 sup, μπλε). Μεταξύ των φυσικών μικροκαμωμάτων, μπορούμε να αναγνωρίσουμε τόσο απομονώσεις με υψηλό χρόνο διπλασιασμού (DT, μαύρη συμπαγής γραμμή) όσο και απομονώσεις με ανακτημένο ρυθμό ανάπτυξης, συγκρίσιμο με το μικροκαμωμένο με κατασταλτικές μεταλλάξεις (μαύρη διακεκομμένη γραμμή). μι Οι χρόνοι δημιουργίας για απομονώσεις με διαφορετικό μιτοχονδριακό CN δείχνουν τουλάχιστον δύο φυσικές μικροκαμωμένες απομονώσεις που φαίνεται να έχουν ανακτήσει τον κανονικό ρυθμό ανάπτυξης σε πλούσια μέσα. Οι καμπύλες ανάπτυξης για τις κυκλικές απομονώσεις φαίνονται στο ρε

Η παρουσία μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων θεωρείται ότι είναι η φυσική κατάσταση του S. cerevisiae κύτταρα, το οποίο ορίζεται ως rho + . Ωστόσο, τα στελέχη μπορούν να χάσουν τη μιτοχονδριακή λειτουργικότητα υπό διαφορετικές συνθήκες είτε με συσσώρευση μεταλλάξεων (rho − ) είτε με πλήρη απώλεια (rho 0 ) του μιτοχονδριακού γονιδιώματος. Αυτά τα μεταλλαγμένα ορίζονται ως «κυτταροπλασματικά μικροκαμωμένα» (δηλαδή «μικρά») επειδή σχηματίζουν μικρές αποικίες σε πλούσια ζυμώσιμα μέσα λόγω της αργής ανάπτυξής τους. Δεδομένου ότι η μεσολαβούμενη από την αναπνοή παραγωγή ATP είναι μειωμένη σε μικροκαμωμένα στελέχη, δεν μπορούν να αναπτυχθούν σε μη ζυμώσιμες πηγές άνθρακα. Εντοπίσαμε 15 πιθανές απομονώσεις φυσικών μικροκαμωγών (Επιπλέον αρχείο 2: Πίνακες S1 και S4) από την ανάλυση κάλυψης και επιβεβαιώσαμε ότι δεν μπορούσαν να αναπτυχθούν σε μέσα που βασίζονται σε μη ζυμώσιμες πηγές άνθρακα (Εικ. 6β). Όλες οι μικροκαμωμένες απομονώσεις φαίνεται να είναι rho 0 , με εξαίρεση δύο απομονώσεις rho −: ABM που διατήρησε ΚΑΛΑΜΠΟΚΙ γονίδιο και AHV που διατήρησαν ATP9 και VAR1 γονίδια (Επιπλέον αρχείο 2: Πίνακας S4). Αυτές οι απομονώσεις rho −, με άλλες πέντε rho 0 petite, ήταν απλοειδείς προερχόμενες από εργαστήριο (HO διαγράφηκε), και δεδομένου ότι ο χειρισμός του στελέχους θα μπορούσε να έχει προκαλέσει τη μιτοχονδριακή τους κατάσταση, αποκλείστηκαν από περαιτέρω αναλύσεις. Εξετάσαμε μια επιλογή τεσσάρων στελεχών για μιτοχονδριακή δραστηριότητα (μετρούμενη ως δυναμικό μεμβράνης) και όγκο. Συμπεριλάβαμε ως μάρτυρες ένα στέλεχος rho + άγριου τύπου και δύο προερχόμενες παραλλαγές rho 0 με τη μία να φέρει πρόσθετη μετάλλαξη (ATP2 G1099T), που αποκαθιστούν εν μέρει την ανάπτυξη των εμπλουτισμένων μέσων (Michael Breitenbach, αδημοσίευτα δεδομένα). Όπως αναμενόταν, τα δεδομένα δραστηριότητας δείχνουν αδυναμία ανάπτυξης σε μη ζυμώσιμες πηγές άνθρακα (YPEG). Ωστόσο, δεν υπήρχε σημαντική διακύμανση μεταξύ του μιτοχονδριακού όγκου των απομονωμένων στελεχών άγριου τύπου και μικρού μεγέθους, σύμφωνα με την ουσιώδη σημασία της διατήρησης των μιτοχονδρίων επίσης σε μικροκαμωμένα στελέχη (Εικ. 6γ, Πρόσθετο αρχείο 2: Πίνακας S4). Ερευνήσαμε εάν αυτές οι φυσικές μικροκαμώσεις έχουν διπλασιασμό χρόνου μετρώντας τις καμπύλες ανάπτυξης σε εμπλουτισμένα μέσα (YPD). Τα μικροκαμωμένα στελέχη εμφάνισαν διαφορετικούς ρυθμούς ανάπτυξης, με δύο από αυτά να έχουν σχεδόν κανονικό χρόνο διπλασιασμού (Εικ. 6d, e Πρόσθετο αρχείο 2: Πίνακας S4). Αυτά τα στελέχη δεν έχουν κανένα από τα δύο ATP2 G1099T ούτε ATP3 Ο πολυμορφισμός G348T που αποκαθιστά εν μέρει την ανάπτυξη σε πλούσια μέσα (Michael Breitenbach, αδημοσίευτα δεδομένα) επομένως, άλλες αντισταθμιστικές μεταλλάξεις μπορεί να έχουν αποκαταστήσει μερικώς την ανάπτυξη σε αυτά τα στελέχη. Δεν μπορούμε να αποκλείσουμε ότι ο μικροκαμωμένος φαινότυπος θα μπορούσε να έχει αυξηθεί κατά τη διάρκεια εργαστηριακών χειρισμών, ωστόσο, η αποκατάσταση σχεδόν φυσιολογικής ανάπτυξης σε ορισμένες από αυτές τις απομονώσεις πιθανότατα απαιτούσε εκτεταμένη διάδοση με μεγάλα μεγέθη πληθυσμού που υποδηλώνουν ένα πιο μακρινό συμβάν απώλειας mtDNA. Είναι γνωστό ότι η δημιουργία σπορίων είναι εξασθενημένη σε μικροκαμωμένα στελέχη [69] και, με συνέπεια, όλα τα φυσικά μικροκαμωμένα απομονωμένα στελέχη δεν σποριώνουν.


Συζήτηση

Αναλύσαμε την αλληλουχία του μιτοχονδριακού γονιδιώματος του Liriodendron tulipifera, το πρώτο από τη μεγάλη (>10.000 είδη) γενεαλογία μαγνολιειδών, που κάλυπτε ένα σημαντικό φυλογενετικό κενό και παρείχε μια εξωομάδα για σύγκριση με τις προηγουμένως μελετημένες σειρές μονοκοτυλήδονων και ευωδικών. Η φυλογενετική θέση του Λιριόδενδρο μας επέτρεψε να πολώσουμε τις αλλαγές σε μονοκοτυλήδονα και ευωδικά, οδηγώντας σε μια πιο λεπτομερή κατανόηση των μοτίβων απώλειας επεξεργασίας RNA, των κερδών των πλαστιδικών tRNA και της διατήρησης συστάδων γονιδίων στα ανθοφόρα φυτά. Αυτές οι προσπάθειες ενισχύθηκαν από το γεγονός ότι η Λιριόδενδρο Το μιτοχονδριακό γονιδίωμα εξελίσσεται εξαιρετικά αργά όσον αφορά την αλληλουχία γονιδίων, το περιεχόμενο και τη σειρά, επιτρέποντας μια άνευ προηγουμένου ματιά στην πρώιμη εξέλιξη των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων των φυτών. Έτσι, με πολλούς εντυπωσιακούς τρόπους, Λιριόδενδρο έχει ένα «απολιθωμένο» μιτοχονδριακό γονιδίωμα, το οποίο έχει υποστεί εντυπωσιακά μικρή αλλαγή τα τελευταία ∽ 100 εκατομμύρια χρόνια.

Πληροφορίες για την απόκτηση tRNA που προέρχονται από πλαστίδια

Τα στοιχεία που παρουσιάζονται εδώ υποδεικνύουν μια διαφορετική εξελικτική ιστορία των tRNA που προέρχονται από μιτοχονδριακά πλαστίδια σε αγγειόσπερμα από ό,τι υποτίθεται προηγουμένως [16, 54], γενικά ωθώντας την προέλευσή τους νωρίτερα στην εξέλιξη των ανθοφόρων φυτών (Εικόνα 2). Ενώ ο Γουάνγκ et al.[54] υπέθεσε μια πρόσφατη προέλευση του trnP(TGG)-cp στο κλαδί που οδηγεί σε Νικοτιάνα, η παρουσία του σε μονοκοτυλήδονα, ευδίκωτα και τώρα μανολοειδή (Εικόνα 2) υποδηλώνει ότι η απόκτησή του πιθανότατα προϋπήρχε του κοινού προγόνου αυτών των τριών γενεαλογιών. Ομοίως, η παρουσία του trnD(GTC)-cp σε Λιριόδενδρο πιθανότατα σπρώχνει την προέλευση αυτού του tRNA από τον κοινό πρόγονο των ευωδικών σε κάποια στιγμή μετά την απόκλιση γυμνόσπερμου/αγγειόσπερμου. Θα πρέπει να σημειωθεί, ωστόσο, ότι και σε αυτή την περίπτωση είναι πιθανές παράλληλες απολαβές στα μαγνολιοειδή και στα ευωδικά. Το μικρό μέγεθος και η διατηρημένη φύση των γονιδίων tRNA είναι τέτοια που αυτές οι ανταγωνιστικές υποθέσεις είναι δύσκολο, αν όχι αδύνατο, να δοκιμαστούν με φυλογενετική ανάλυση.

Γνωρίζουμε από άλλα μιτοχονδριακά γονιδιώματα αγγειόσπερμων ότι η μεταφορά αλληλουχίας από το γονιδίωμα του πλαστιδίου είναι συχνή σε μια εξελικτική κλίμακα [14, 55] και ότι μερικές φορές αυτά τα γεγονότα μεταφοράς οδήγησαν στην απόκτηση λειτουργικών tRNA, με βάση την ευρεία διατήρησή τους στα αγγειόσπερμα [56] . Ωστόσο, ο χρόνος των λειτουργικών μεταφορών ήταν ασαφής. Λόγω των αργών ρυθμών απώλειας γονιδίων, αλλαγής αλληλουχίας και κατακερματισμού γονιδίων-συστάδων, Λιριόδενδρο μπορεί να έχει διατηρήσει μία ή περισσότερες περιοχές DNA πλαστιδίου που χρονολογούνται από τις αρχικές μεταφορές αλληλουχίας που έσπειραν μόνιμα ορισμένα από τα πλαστιδικά tRNA που βρέθηκαν στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα του αγγειόσπερμου (Εικόνες 2 και 3). Ωστόσο, άλλες ερμηνείες είναι δυνατές. Για παράδειγμα, αυτό Λιριόδενδρο και οι περισσότεροι eudicots έχουν trnD(GTC)-cp (Εικόνες 2 και 3Α) θα μπορούσαν να οφείλονται σε ανεξάρτητα παράλληλα κέρδη, μία φορά σε έναν πρόγονο μαγνολιειδών και μία φορά στην αρχή της εξέλιξης του eudicot.

Μέρος του συλλογισμού μας ότι οι αλληλουχίες που προέρχονται από πλαστίδια στο Σχήμα 3Α, Β μπορεί να είναι υπολείμματα πρώιμων λειτουργικών μεταφορών tRNA πλαστιδίου είναι ότι το tRNA φαίνεται να διατηρείται πιο έντονα από τις πλευρικές περιοχές που μεταφέρθηκαν ταυτόχρονα, υποδηλώνοντας ότι η επιλογή καθαρισμού έχει διατηρήσει το tRNA ενώ η περιβάλλουσα μη κωδικοποιητική αλληλουχία επιδεινώθηκε. Το θραύσμα στο Σχήμα 3Α φαίνεται να είναι το παλαιότερο, έχοντας συσσωρεύσει 15% απόκλιση αλληλουχίας ανά ζεύγη. Δεδομένων των συμπερασματικών χαμηλών ρυθμών εξέλιξης αλληλουχίας τόσο στο μιτοχονδριακό όσο και στο πλαστιδικό γονιδίωμα του Λιριόδενδρο, η μεταφορά του μπορεί κάλλιστα να χρονολογείται στις αρχές της εξέλιξης του αγγειόσπερμου. Διστάζουμε, ωστόσο, να εκτιμήσουμε την πραγματική χρονική στιγμή της μεταγραφικής εκδήλωσης για διάφορους λόγους. Τα τρέχοντα χαμηλά ποσοστά υποκατάστασης στη σειρά των μαγνολιειδών είναι πιθανώς χαμηλότερα από τα ποσοστά νωρίτερα στην εξέλιξη του αγγειοσπέρματος, αποκλείοντας τη χρήση ενός αυστηρού μοριακού ρολογιού. Οι μεταφερόμενες περιοχές περιέχουν αλληλουχία πλαστιδίων με διαγονιδιακό DNA, καθώς και συνώνυμες και μη θέσεις, οι οποίες βρίσκονται υπό διαφορετικούς περιορισμούς στο πλαστίδιο σε σχέση με το μιτοχονδριακό γονιδίωμα, περιπλέκοντας περαιτέρω τις εκτιμήσεις χρόνου απόκλισης σε όλο το τμήμα. Το θραύσμα που προέρχεται από πλαστίδιο που περιέχει trnP(TTG)-cp (Εικόνα 3Β) φαίνεται να έχει μεταφερθεί πιο πρόσφατα από το θραύσμα στο Σχήμα 3Α, δεδομένης της μικρότερης συνολικής απόκλισης από τη συγγενή του πλαστιδική αλληλουχία. Σε αυτή την περίπτωση, ωστόσο, μεγαλύτερο μέρος του θραύσματος αποτελείται από γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, τα οποία πιθανότατα θα μείωναν τον συνολικό ρυθμό απόκλισης αλληλουχίας ανά ζεύγη μετά το συμβάν μεταφοράς.

Η ερμηνεία μας για το χρόνο από τη μεταφορά μπορεί επίσης να περιπλέκεται από την πιθανότητα η συντονισμένη εξέλιξη να ομογενοποιεί ομόλογες πλαστιδικές και μιτοχονδριακές αλληλουχίες [57]. Για παράδειγμα, είναι πιθανό ένα αποκλίνον, προερχόμενο από πλαστίδιο θραύσμα αλληλουχίας να περιέχει trnN(GTT)-cp (Εικόνα 3Γ) ήταν ήδη παρούσα στο Λιριόδενδρο μιτοχονδριακό γονιδίωμα από μια προηγούμενη μεταφορά και το σύντομο τέντωμα που περιείχε το tRNA «ενημερώθηκε» μέσω γονιδιακής μετατροπής μεταξύ αυτού και ενός αντιγράφου που εισήχθη εκ νέου του ίδιου τμήματος πλαστιδικού DNA, αποκαθιστώντας την ταυτότητα αλληλουχίας μεταξύ του πλαστιδίου και των μιτοχονδριακών αντιγράφων. Αυτός ο μηχανισμός συντονισμένης εξέλιξης υποστηρίχθηκε για να εξηγήσει τα μοτίβα της απόκλισης αλληλουχίας σε ένα τμήμα αλληλουχίας που προέρχεται από πλαστίδια στα μιτοχονδριακά γονιδιώματα του Ορύζα και Ζέα, όπου η απόκλιση πλαστιδίου/μιτοχονδρίου εντός του είδους είναι μικρότερη από ό,τι μεταξύ των ειδών στη μιτοχονδριακή περιοχή, παρά την υποτιθέμενη κοινή προέλευση του μεταφερόμενου θραύσματος [57]. Εάν τα μιτοχονδριακά και τα πλαστιδικά αντίγραφα εξελίσσονται σε συνεννόηση, το σχεδόν πανομοιότυπο θραύσμα που προέρχεται από πλαστίδιο στο Σχήμα 3C θα μπορούσε να είναι πολύ παλαιότερο από ό,τι υποδηλώνεται από την υψηλή ομοιότητα αλληλουχίας.

Χαμηλά ποσοστά υποκατάστασης μιτοχονδρίων και πλαστιδίων σε μαγνολιοειδή

Τα μιτοχονδριακά γονίδια σε Λιριόδενδρο εξελίσσονται με εξαιρετικά χαμηλό ρυθμό, συσσωρεύοντας μόλις 0,035 υποκαταστάσεις νουκλεοτιδίων ανά σιωπηλή τοποθεσία ανά δισεκατομμύριο χρόνια. Ως σημείο αναφοράς, χρησιμοποιώντας την ίδια υπολογιστική προσέγγιση που χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση του μιτοχονδριακού ρυθμού των φυτών, ευθυγραμμίσαμε και τα 13 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες από τα πλήρη μιτοχονδριακά γονιδιώματα ενός ανθρώπου [58], ενός Νεάντερταλ [59], μιας πιο απομακρυσμένης σχέσης Denisova ανθρωπίνη [60], και μια εξωομάδα χιμπατζήδων [61]. Υπολογίσαμε ένα απόλυτο ποσοστό σιωπηλής υποκατάστασης 69,5 ssb στους ανθρώπους, χρησιμοποιώντας τις σχετικές ημερομηνίες απόκλισης από το Krause et al.[60]. Ο ρυθμός ανθρώπινης μιτοχονδριακής υποκατάστασης είναι περισσότερο από 5.000 φορές ταχύτερος από Μαγνολία και 2.000 φορές πιο γρήγορα από Λιριόδενδρο. Διαφορετικά, η μέση ποσότητα μιτοχονδριακής απόκλισης σιωπηλής θέσης που συγκεντρώθηκε κατά τη διάρκεια μιας και μόνο γενιάς (25 χρόνια) στους ανθρώπους θα χρειαζόταν περίπου 50.000 χρόνια σε Λιριόδενδρο και 130.000 χρόνια μετά Μαγνολία.

ΜΗΧΑΝΗ ΚΟΥΡΕΜΑΤΟΣ et al.[10] χαρακτήρισε τα ποσοστά μιτοχονδριακής σιωπηλής υποκατάστασης σε περίπου 600 είδη φυτών με σύνολα δεδομένων από ένα έως πέντε γονίδια και διαπίστωσε επίσης ότι Silene noctiflora είναι το ταχύτερο [10]. Το πιο αργό εξελισσόμενο μιτοχονδριακό γονιδίωμα που αναφέρθηκε από τον Mower et al.[10] ήταν Κύκας σε 0,02 +/− 0,1 ssb, παρόμοιο με το Λιριόδενδρο ποσοστό που αναφέρεται εδώ και είναι μεγαλύτερο από την εκτίμησή μας για Μαγνολία χρησιμοποιώντας μια συνενωμένη ευθυγράμμιση 18 γονιδίων. Από όσο γνωρίζουμε, το εκτιμώμενο ποσοστό των 0,013 ssb in Μαγνολία είναι το χαμηλότερο αναφερόμενο ποσοστό υποκατάστασης σε επίπεδο γονιδιώματος σε οποιονδήποτε οργανισμό, αλλά αυτό το συμπέρασμα μετριάζεται από το σχετικό σφάλμα στις εκτιμήσεις μας. Για Μαγνολία και Λιριόδενδρο, το διάστημα εμπιστοσύνης πιθανότητας 95% σχετικά με την εκτίμηση ssb λόγω σφαλμάτων στην εκτίμηση συνώνυμης υποκατάστασης για συγκεκριμένο κλάδο ήταν 0,003 έως 0,034 και 0,015 έως 0,065, αντίστοιχα (Επιπλέον αρχείο 1: Πίνακας S3). Επιπλέον, οι εκτιμήσεις μας βασίζονται σε μεγάλο βαθμό σε βαθμονομημένους με απολιθώματα χρόνους απόκλισης, οι οποίοι προσθέτουν μια επιπλέον πηγή σφάλματος (για παράδειγμα, βλέπε [30, 31, 62, 63]). Χρησιμοποιήσαμε δύο ευρέως αποδεκτά απολιθώματα σε μαγνολιίδια [64, 65], τα οποία μαζί θα πρέπει να παρέχουν μια σχετικά ακριβή εκτίμηση χρόνου απόκλισης για τη σχετική ΛιριόδενδροΜαγνολία διαίρεση. Το 95% υψηλότερο διάστημα πυκνότητας πιθανότητας για αυτόν τον διαχωρισμό ήταν 94,9 έως 102,2 mya και η διάμεση τιμή που χρησιμοποιήσαμε για την εκτίμησή μας ήταν 97,4 mya (βλ. Μέθοδοι). Επομένως, στη μελέτη μας, σφάλματα στην εκτίμηση του απόλυτου ποσοστού για Λιριόδενδρο και Μαγνολία επηρεάζονται λιγότερο από την αβεβαιότητα του χρόνου απόκλισης παρά από το σφάλμα στην εκτίμηση πιθανότητας των συνώνυμων ποσοστών υποκατάστασης για συγκεκριμένο κλάδο.

Διαπιστώσαμε ότι τα ποσοστά υποκατάστασης μιτοχονδρίων και χλωροπλαστών συσχετίστηκαν κατά προσέγγιση στα είδη που εξετάστηκαν εδώ (Εικόνα 4), μια παρατήρηση που αξίζει πιο λεπτομερούς μελέτης παρακολούθησης. Αν και είναι πολύ νωρίς για να προεκταθεί πάρα πολύ, η συνήθεια ανάπτυξης (ετήσια έναντι πολυετής, θάμνος έναντι δέντρου) μπορεί να βασίζεται σε αυτό το μοτίβο [66]. Ο χρόνος δημιουργίας και οι ρυθμοί συνώνυμης υποκατάστασης συσχετίζονται γενικά αντιστρόφως στα φυτά (για ανασκόπηση, βλέπε [67]). Οι κινητήριες δυνάμεις πίσω από αυτή τη σχέση είναι ασαφείς, ωστόσο, καθώς τα φυτά δεν έχουν αποκλειστική βλαστική σειρά, επομένως ο χρόνος παραγωγής και ο αριθμός των αναπαραγωγικών κυτταρικών διαιρέσεων ανά έτος δεν είναι τόσο στενά συνδεδεμένοι όσο στα ζώα. Οι διαφορές μεταξύ ετήσιων και πολυετών, όσον αφορά τον ρυθμό ειδογένεσης και/ή τον μεταβολισμό, θα μπορούσαν να αποτελούν τη βάση της σχέσης του ρυθμού υποκατάστασης του χρόνου παραγωγής [67] και μπορεί να αναμένεται ότι επηρεάζουν με παρόμοιο τρόπο καθένα από τα τρία γονιδιώματα του φυτού. Καθώς τα πυρηνικά γονιδιωματικά δεδομένα γίνονται διαθέσιμα για μια ευρύτερη ποικιλία φυτών, θα είναι ενδιαφέρον να προσδιοριστεί εάν αυτή η συσχέτιση εκτείνεται και στα τρία γενετικά διαμερίσματα.

Τα δεδομένα μας ανέκτησαν επίσης μεγαλύτερη αναλογία ρυθμών σιωπηλής υποκατάστασης πλαστιδίου προς μιτοχονδριακό από ό,τι είχε βρεθεί προηγουμένως [9, 13, 51, 52]. Η εκτίμησή μας ωφελήθηκε από σημαντικά περισσότερα δεδομένα αλληλουχίας και πολύ ευρύτερη δειγματοληψία ταξινομικών κατηγοριών σε σχέση με προηγούμενες μελέτες, γεγονός που μπορεί να ευθύνεται για την απόκλιση. Επιπλέον, δεδομένου του εύρους 5.000-πλάσιων και 40-πλάσιων ποσοστών υποκατάστασης μιτοχονδρίων και πλαστιδίων, αντίστοιχα, που βρήκαμε, φαίνεται ότι η δειγματοληψία taxon μπορεί να έχει μεγάλη επίδραση στους μέσους συναγόμενους λόγους. Οι μιτοχονδριακές και πλαστιδικές σειρές «υψηλού ποσοστού» δεν έχουν πάντα αναλογικά αυξημένα ποσοστά και στα δύο γονιδιώματα των οργανιδίων [48], οδηγώντας σε ακραίες σχέσεις ρυθμού πλαστιδίου-μιτοχονδρίου (για παράδειγμα, 0,08 σε Silene conica) (Εικόνα 4). Η παραλλαγή από γονίδιο σε γονίδιο στα ποσοστά σιωπηλής υποκατάστασης μιτοχονδρίων [10] και πλαστιδίου [48, 53] είναι επίσης κοινά, υπογραμμίζοντας την ανάγκη να ληφθούν υπόψη πολλά μιτοχονδριακά και πλαστιδικά γονίδια για έναν ακριβή προσδιορισμό των σχετικών ρυθμών.

Η διατήρηση θέσεων επεξεργασίας RNA χάνονται σε πολλές γενεές

Το συνολικό υψηλό επίπεδο επεξεργασίας RNA C-to-U Λιριόδενδρο, μαζί με τον μεγάλο αριθμό μοναδικών τοποθεσιών επεξεργασίας, προσθέτουν περαιτέρω υποστήριξη για ένα μοντέλο σχετικά υψηλών επιπέδων επεξεργασίας RNA στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα του προγονικού αγγειόσπερμου (περίπου 700 θέσεις σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες), ακολουθούμενο από διάφορους βαθμούς επακόλουθης απώλειας σε διαφορετικά γενεαλογίες (Εικόνα 5) [26, 27]. Δεδομένα επεξεργασίας RNA από ένα αγγειόσπερμο από μια «πρώιμη αποκλίνουσα» γενεαλογία, όπως π.χ. Αμπορέλλα ή Νυμφαία, θα βοηθούσε στην πόλωση του βαθμού απώλειας επεξεργασίας Λιριόδενδρο, το οποίο φαίνεται να είναι εξαιρετικά χαμηλό με βάση αυτά τα δεδομένα. Δεν υπάρχει σαφής προσαρμοστική εξήγηση για την εμφάνιση και τη διατήρηση της επεξεργασίας RNA στα φυτά [25, 68, 69], αλλά μπορεί να προέκυψε μέσω ουδέτερων διεργασιών, μόνο για να γίνει ουσιαστική μετά από υποκαταστάσεις σε λειτουργικά σημαντικές κυτοσίνες που απαιτούσαν μεταγραφική επεξεργασία σε παράγουν το διατηρημένο αμινοξύ [70] – μια υπόθεση που εμπίπτει στην κατηγορία της «εποικοδομητικής ουδέτερης εξέλιξης» [71, 72]. Σύμφωνα με αυτό το μοντέλο, οι περισσότεροι ιστότοποι επεξεργασίας αλλάζουν τη μεταφρασμένη αλληλουχία αμινοξέων [21, 73], ένα μοτίβο που υπογραμμίζεται στο Λιριόδενδρο, στο οποίο το 82% των επεξεργασιών ήταν σε μη συνώνυμους ιστότοπους. Ενώ η εμφάνιση της επεξεργασίας RNA μπορεί να οφείλεται σε ουδέτερες διαδικασίες, η συγκριτική εργασία έχει βρει υποστήριξη για την επιλογή ευνοώντας την απώλεια της επεξεργασίας με την πάροδο του χρόνου [26, 27] και είναι πιθανό ότι αυτή η επιλογή θα ήταν ισχυρότερη σε μη συνώνυμες τοποθεσίες, όπου η αναξιόπιστη επεξεργασία θα να είναι το πιο επιβλαβές. Σύμφωνα με αυτήν την υπόθεση, βρήκαμε ότι η αναλογία απώλειας προς κέρδος ήταν 14:1 σε μη συνώνυμες τοποθεσίες σε σύγκριση με 2:1 σε σιωπηλές θέσεις στα αγγειόσπερμα (Εικόνα 5).

Διατήρηση αρχαίων συστάδων γονιδίων

Αν και η συνολική σειρά γονιδίων είναι εξαιρετικά μεταβλητή μεταξύ των μιτοχονδριακών γονιδιωμάτων αγγειόσπερμων [13], ακόμη και μεταξύ στενά συνδεδεμένων ταξινομικών κατηγοριών [15], τα αποτελέσματα εδώ υπογραμμίζουν τους αντισταθμιστικούς περιορισμούς σε σύντομες συστάδες γονιδιακής σύνδεσης που λειτουργούν σε όλη την εξέλιξη του αγγειόσπερμου. Ενώ ορισμένα από τα διατηρημένα συμπλέγματα (για παράδειγμα, rrnS–rrn5 και rpl2–rps19–rps3–rpl16) χρονολογούνται από τον αρχικό βακτηριακό πρόγονο των μιτοχονδρίων [19], άλλα είναι μοναδικά για τα αγγειόσπερμα, όπως το atp8–cox3–sdh4 και rps13–nad1.x2.x3 συστάδες. Τα πέντε συμπλέγματα που μοιράζονται Λιριόδενδρο και Κύκας πιθανότατα υπήρχαν νωρίς στην εξέλιξη των φυτών σπόρων και μπορούμε να κοιτάξουμε έξω από τα φυτά σπόρων για να συμπεράνουμε ποια από αυτά ήταν επίσης παρόντα νωρίς και στην εξέλιξη των αγγειακών φυτών. Μια συγκριτική ανάλυση σειράς γονιδίων έδειξε Huperzia να έχουν βιώσει λιγότερες αναδιατάξεις σε σχέση με τα βρυόφυτα από οποιοδήποτε άλλο μιτοχονδριακό γονιδίωμα αγγειακού φυτού [74], καθιστώντας το μια σημαντική σύγκριση για τη διατήρηση της τάξης των γονιδίων των αγγείων φυτών. Από τα πέντε συμπλέγματα που μοιράζονται Κύκας και Λιριόδενδρο, τρεις μοιράζονται με Huperzia και δύο δεν είναι. Όλες οι ομάδες γονιδίων που βρίσκονται σε Λιριόδενδρο προς εξαίρεση των Κύκας λείπουν επίσης Huperzia, υποδηλώνοντας ότι τέτοιες συστάδες είναι όντως ειδικές για τα αγγειόσπερμα.

Η μεταγραφή είναι πιθανόν ένας σημαντικός περιορισμός, σύμφωνα με τον οποίο τα γειτονικά γονίδια μοιράζονται έναν μόνο προαγωγέα και συν-μεταγράφονται, όπως φάνηκε για τρεις συντηρημένες ομάδες γονιδίων σε Νικοτιάνα[16]. Αυτό θα μπορούσε να εξηγήσει γιατί όλα τα σμήνη που διατηρούνται στα αγγειόσπερμα περιλαμβάνουν γονίδια που κωδικοποιούνται στον ίδιο κλώνο. Είναι ενδιαφέρον ότι τρεις από τις συστάδες που συμπεραίνεται ότι υπάρχουν στο προγονικό αγγειόσπερμα περιλαμβάνουν εσωτερικά θραύσματα μεταφρ- ματισμένα γονίδια (Εικόνα 6), τα οποία μπορεί, μετά από περαιτέρω εξέταση, να παρέχουν ενδείξεις ως προς τη ρύθμιση και την ανακατασκευή μεταγραφών πλήρους μήκους από μεταφρ- ματισμένα γονίδια.

ο Λιριόδενδρο Το μιτοχονδριακό γονιδίωμα φαίνεται να έχει υποβληθεί τόσο σε χαμηλά ποσοστά σιωπηλής υποκατάστασης όσο και σε σπάνιο κατακερματισμό συστάδων γονιδίων σε σχέση με τα μιτοχονδριακά γονιδιώματα με αλληλουχία ευωδικών και μονοκοτυλήδονων (Εικόνες 4 και 6). Ωστόσο, τα επίπεδα σιωπηλής υποκατάστασης και κατακερματισμού συστάδων γονιδίων δεν ποικίλλουν απαραίτητα σε όλα τα αγγειόσπερμα στη μελέτη μας. Για παράδειγμα, ένα από τα taxa με σχετικά υψηλό ποσοστό αθόρυβης υποκατάστασης (>30 × ταχύτερο από Λιριόδενδρο), Cucurbita, έχει 11 συντηρημένες ομάδες γονιδίων σε σύγκριση με 12 in Λιριόδενδρο, ενώ Ζέα, με σχετικά χαμηλότερο ρυθμό (10 × ταχύτερο από Λιριόδενδρο), έχει μόνο πέντε. Στα γονιδιώματα του πλαστιδίου του αγγειόσπερμου, υπάρχει υποστήριξη για μια θετική σχέση μεταξύ των ρυθμών δομικής εξέλιξης και εξέλιξης της αλληλουχίας [75], αλλά αυτή η σχέση δεν είναι καθολική [48, 53]. Σε Silene, για παράδειγμα, αν και τα ποσοστά αναδιάταξης της τάξης των πλαστιδικών γονιδίων είναι υψηλότερα σε είδη με υψηλότερα ποσοστά υποκατάστασης, πολλές από αυτές τις υποκαταστάσεις συμβαίνουν σε μη συνώνυμες θέσεις και έτσι δεν εξηγούνται εύκολα από ένα απλό, μεταλλαγμένο μοντέλο [48].


Περιεχόμενα

Τα ιντρόνια ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες του αδενοϊού [8] [9] και στη συνέχεια αναγνωρίστηκαν σε γονίδια που κωδικοποιούν γονίδια RNA μεταφοράς και ριβοσωμικού RNA. Τα ιντρόνια είναι πλέον γνωστό ότι υπάρχουν σε μια μεγάλη ποικιλία γονιδίων σε όλους τους οργανισμούς και τους ιούς σε όλα τα βιολογικά βασίλεια.

Το γεγονός ότι τα γονίδια διασπάστηκαν ή διακόπηκαν από ιντρόνια ανακαλύφθηκε ανεξάρτητα το 1977 από τους Phillip Allen Sharp και Richard J. Roberts, για τον οποίο μοιράστηκαν το Νόμπελ Φυσιολογίας ή Ιατρικής το 1993. [10] Ο όρος. εσώνιο εισήχθη από τον Αμερικανό βιοχημικό Walter Gilbert: [5]

"Η έννοια του σιστρόνιου [δηλαδή του γονιδίου] . πρέπει να αντικατασταθεί από αυτή μιας μονάδας μεταγραφής που περιέχει περιοχές που θα χαθούν από τον ώριμο αγγελιοφόρο – το οποίο προτείνω να ονομάσουμε εσώνια (για ενδογονιδιακές περιοχές) – εναλλασσόμενες με περιοχές που θα είναι εκφράζεται – εξόνια». (Gilbert 1978)

Ο όρος εσώνιο αναφέρεται επίσης σε intracistron, δηλαδή, ένα επιπλέον κομμάτι DNA που προκύπτει μέσα σε ένα σιστρόνιο. [11]

Αν και μερικές φορές ονομάζονται εσώνια ενδιάμεσες αλληλουχίες, [12] ο όρος "ενδιάμεση αλληλουχία" μπορεί να αναφέρεται σε οποιαδήποτε από πολλές οικογένειες εσωτερικών αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων που δεν υπάρχουν στο τελικό γονιδιακό προϊόν, συμπεριλαμβανομένων ιντεϊνών, μη μεταφρασμένων περιοχών (UTR) και νουκλεοτιδίων που αφαιρέθηκαν με επεξεργασία RNA, επιπλέον σε εσώνια.

Η συχνότητα των ιντρονίων εντός διαφορετικών γονιδιωμάτων παρατηρείται ότι ποικίλλει ευρέως σε όλο το φάσμα των βιολογικών οργανισμών. Για παράδειγμα, τα ιντρόνια είναι εξαιρετικά κοινά στο πυρηνικό γονιδίωμα των σπονδυλωτών με γνάθο (π.χ. ανθρώπους και ποντίκια), όπου τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες περιέχουν σχεδόν πάντα πολλαπλά εσώνια, ενώ τα ιντρόνια είναι σπάνια στα πυρηνικά γονίδια ορισμένων ευκαρυωτικών μικροοργανισμών, [13] για παράδειγμα. μαγιά αρτοποιίας/ζυθοποιίας (Saccharomyces cerevisiae). Αντίθετα, τα μιτοχονδριακά γονιδιώματα των σπονδυλωτών στερούνται εντελώς ιντρόνια, ενώ αυτά των ευκαρυωτικών μικροοργανισμών μπορεί να περιέχουν πολλά ιντρόνια. [14]

Μια ιδιαίτερα ακραία περίπτωση είναι η Drosophila dhc7 γονίδιο που περιέχει ένα εσώνιο ≥3,6 megabase (Mb), το οποίο χρειάζεται περίπου τρεις ημέρες για να μεταγραφεί. [15] [16] Από το άλλο άκρο, μια πρόσφατη μελέτη προτείνει ότι το μικρότερο γνωστό μήκος ευκαρυωτικού ιντρονίου είναι 30 ζεύγη βάσεων (bp) που ανήκουν στον άνθρωπο MST1L γονίδιο. [17]

Το μάτισμα όλων των μορίων RNA που περιέχουν ιντρόνιο είναι επιφανειακά παρόμοια, όπως περιγράφεται παραπάνω. Ωστόσο, διαφορετικοί τύποι ιντρονίων ταυτοποιήθηκαν μέσω της εξέτασης της δομής των ιντρονίων με ανάλυση αλληλουχίας DNA, μαζί με τη γενετική και βιοχημική ανάλυση των αντιδράσεων ματίσματος RNA.

Τουλάχιστον τέσσερις διαφορετικές κατηγορίες εσωνίων έχουν αναγνωριστεί: [1]

    που αφαιρούνται από ματοσωμικά εσώνια (σφυοσωματικά εσώνια)
  • Εσώνια σε πυρηνικά και αρχαϊκά γονίδια μεταφοράς RNA που αφαιρούνται από πρωτεΐνες (εσώνια tRNA)
  • Αυτοματιζόμενα ιντρόνια της ομάδας Ι που αφαιρούνται με κατάλυση RNA
  • Αυτοματιζόμενα ιντρόνια της ομάδας II που αφαιρούνται με κατάλυση RNA

Τα εσώνια της ομάδας III προτείνονται να είναι μια πέμπτη οικογένεια, αλλά λίγα είναι γνωστά για τη βιοχημική συσκευή που μεσολαβεί στο μάτισμα τους. Φαίνεται ότι σχετίζονται με τα ιντρόνια της ομάδας II και πιθανώς με τα σωμοσωματικά ιντρόνια. [18]

Spliceosomal intron Επεξεργασία

Τα πυρηνικά ιντρόνια προ-mRNA (συστημοσωματικά ιντρόνια) χαρακτηρίζονται από συγκεκριμένες αλληλουχίες ιντρονίων που βρίσκονται στα όρια μεταξύ ιντρονίων και εξονίων. [19] Αυτές οι αλληλουχίες αναγνωρίζονται από μόρια μάτιασμου RNA όταν ξεκινούν οι αντιδράσεις ματίσματος. [20] Επιπλέον, περιέχουν ένα σημείο διακλάδωσης, μια συγκεκριμένη αλληλουχία νουκλεοτιδίων κοντά στο 3' άκρο του ιντρονίου που συνδέεται ομοιοπολικά με το 5' άκρο του ιντρονίου κατά τη διαδικασία ματίσματος, δημιουργώντας ένα διακλαδισμένο (σχοινί με θηλειά) εσώνιο. Εκτός από αυτά τα τρία σύντομα διατηρημένα στοιχεία, οι αλληλουχίες εσωνίων του πυρηνικού προ-mRNA είναι εξαιρετικά μεταβλητές. Τα πυρηνικά εσώνια pre-mRNA είναι συχνά πολύ μακρύτερα από τα περιβάλλοντα εξόνια τους.

Εσώνια tRNA Επεξεργασία

Τα εσώνια μεταφοράς RNA που εξαρτώνται από πρωτεΐνες για απομάκρυνση εμφανίζονται σε μια συγκεκριμένη θέση εντός του αντικωδικονικού βρόχου των μη ματισμένων προδρόμων tRNA και αφαιρούνται από μια ενδονουκλεάση ματίσματος tRNA. Στη συνέχεια, τα εξόνια συνδέονται μεταξύ τους με μια δεύτερη πρωτεΐνη, τη λιγάση ματίσματος tRNA. [21] Σημειώστε ότι τα αυτοσυνδυαζόμενα ιντρόνια βρίσκονται επίσης μερικές φορές μέσα στα γονίδια tRNA. [22]

Εσώνια της ομάδας Ι και της ομάδας ΙΙ Επεξεργασία

Τα εσώνια της ομάδας I και της ομάδας II βρίσκονται σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (αγγελιοφόρο RNA), RNA μεταφοράς και ριβοσωμικό RNA σε ένα πολύ ευρύ φάσμα ζωντανών οργανισμών. κάνουν εκτεταμένες εσωτερικές αλληλεπιδράσεις που τους επιτρέπουν να αναδιπλώνονται σε μια συγκεκριμένη, πολύπλοκη τρισδιάστατη αρχιτεκτονική. Αυτές οι πολύπλοκες αρχιτεκτονικές επιτρέπουν την ύπαρξη εσωνίων της ομάδας Ι και της ομάδας ΙΙ αυτοσυναρμολόγηση, δηλαδή, το μόριο RNA που περιέχει εσώνιο μπορεί να αναδιατάξει τη δική του ομοιοπολική δομή έτσι ώστε να αφαιρέσει με ακρίβεια το εσώνιο και να συνδέσει τα εξόνια μεταξύ τους με τη σωστή σειρά. Σε ορισμένες περιπτώσεις, συγκεκριμένες πρωτεΐνες που δεσμεύουν το ιντρόνιο εμπλέκονται στο μάτισμα, δρώντας με τέτοιο τρόπο ώστε να βοηθούν το εσώνιο να αναδιπλωθεί στην τρισδιάστατη δομή που είναι απαραίτητη για τη δραστηριότητα αυτοματισμού. Τα εσώνια της ομάδας Ι και της ομάδας ΙΙ διακρίνονται από διαφορετικά σύνολα εσωτερικών διατηρημένων αλληλουχιών και αναδιπλωμένων δομών και από το γεγονός ότι το μάτισμα των μορίων RNA που περιέχουν εσώνια της ομάδας ΙΙ δημιουργεί διακλαδισμένα ιντρόνια (όπως αυτά των ματοσωμικών RNA), ενώ τα ιντρόνια της ομάδας Ι χρησιμοποιούν μη -κωδικοποιήθηκε το νουκλεοτίδιο γουανοσίνης (συνήθως GTP) για να ξεκινήσει το μάτισμα, προσθέτοντάς το στο 5'-άκρο του αποκομμένου ιντρονίου.

Ενώ τα εσώνια δεν κωδικοποιούν πρωτεϊνικά προϊόντα, είναι αναπόσπαστα στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ορισμένα εσώνια από μόνα τους κωδικοποιούν λειτουργικά RNA μέσω περαιτέρω επεξεργασίας μετά το μάτισμα για τη δημιουργία μη κωδικοποιητικών μορίων RNA. [25] Το εναλλακτικό μάτισμα χρησιμοποιείται ευρέως για τη δημιουργία πολλαπλών πρωτεϊνών από ένα μόνο γονίδιο. Επιπλέον, ορισμένα εσώνια διαδραματίζουν ουσιαστικούς ρόλους σε ένα ευρύ φάσμα ρυθμιστικών λειτουργιών έκφρασης γονιδίων, όπως η διάσπαση που προκαλείται από μη νόημα [26] και η εξαγωγή mRNA. [27]

Η βιολογική προέλευση των ιντρονίων είναι ασαφής. Μετά την αρχική ανακάλυψη των ιντρονίων σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες του ευκαρυωτικού πυρήνα, υπήρξε σημαντική συζήτηση σχετικά με το εάν τα ιντρόνια στους σύγχρονους οργανισμούς κληρονομήθηκαν από έναν κοινό αρχαίο πρόγονο (που ονομάζεται ιντρόνια-πρώιμη υπόθεση) ή αν εμφανίστηκαν σε γονίδια μάλλον πρόσφατα στην εξελικτική διαδικασία (που ονομάζεται υπόθεση εσωνίων-όψιμη). Μια άλλη θεωρία είναι ότι το μάτισμα και η δομή ιντρονίου-εξονίου των γονιδίων είναι ένα λείψανο του κόσμου του RNA (η πρώτη υπόθεση των εσωνίων). [28] Υπάρχει ακόμη σημαντική συζήτηση σχετικά με το κατά πόσον από αυτές τις υποθέσεις είναι πιο σωστές. Η δημοφιλής συναίνεση αυτή τη στιγμή είναι ότι τα εσώνια προέκυψαν μέσα στην ευκαρυωτική καταγωγή ως εγωιστικά στοιχεία. [29]

Πρώιμες μελέτες αλληλουχιών γονιδιωματικού DNA από ένα ευρύ φάσμα οργανισμών δείχνουν ότι η δομή ιντρονίων-εξονίων των ομόλογων γονιδίων σε διαφορετικούς οργανισμούς μπορεί να ποικίλλει ευρέως. [30] Πιο πρόσφατες μελέτες ολόκληρων ευκαρυωτικών γονιδιωμάτων έχουν πλέον δείξει ότι τα μήκη και η πυκνότητα (εσώνια/γονίδιο) των ιντρονίων ποικίλλουν σημαντικά μεταξύ συγγενών ειδών. Για παράδειγμα, ενώ το ανθρώπινο γονιδίωμα περιέχει κατά μέσο όρο 8,4 ιντρόνια/γονίδιο (139.418 στο γονιδίωμα), ο μονοκύτταρος μύκητας Encephalitozoon cuniculi περιέχει μόνο 0,0075 ιντρόνια/γονίδιο (15 ιντρόνια στο γονιδίωμα). [31] Εφόσον οι ευκαρυώτες προέκυψαν από έναν κοινό πρόγονο (κοινή καταγωγή), πρέπει να υπήρξε εκτεταμένο κέρδος ή απώλεια ιντρονίων κατά τη διάρκεια του εξελικτικού χρόνου. [32] [33] Αυτή η διαδικασία πιστεύεται ότι υπόκειται σε επιλογή, με τάση για αύξηση ιντρονίων σε μεγαλύτερα είδη λόγω των μικρότερων πληθυσμιακών μεγεθών τους, και το αντίστροφο σε μικρότερα (ιδιαίτερα μονοκύτταρα) είδη. [34] Οι βιολογικοί παράγοντες επηρεάζουν επίσης ποια γονίδια σε ένα γονιδίωμα χάνουν ή συσσωρεύουν ιντρόνια. [35] [36] [37]

Το εναλλακτικό μάτισμα των εξονίων μέσα σε ένα γονίδιο μετά την εκτομή ιντρονίου δρα για την εισαγωγή μεγαλύτερης μεταβλητότητας των πρωτεϊνικών αλληλουχιών που μεταφράζονται από ένα μόνο γονίδιο, επιτρέποντας τη δημιουργία πολλαπλών σχετικών πρωτεϊνών από ένα μόνο γονίδιο και ένα μόνο πρόδρομο μεταγράφημα mRNA. Ο έλεγχος του εναλλακτικού ματίσματος RNA πραγματοποιείται από ένα πολύπλοκο δίκτυο μορίων σηματοδότησης που ανταποκρίνονται σε ένα ευρύ φάσμα ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών σημάτων.

Τα εσώνια περιέχουν πολλές σύντομες αλληλουχίες που είναι σημαντικές για αποτελεσματικό μάτισμα, όπως θέσεις δέκτη και δότη σε κάθε άκρο του ιντρονίου καθώς και θέση σημείου διακλάδωσης, που απαιτούνται για τη σωστή μάτιση από το μάτισμα. Ορισμένα ιντρόνια είναι γνωστό ότι ενισχύουν την έκφραση του γονιδίου στο οποίο περιέχονται με μια διαδικασία γνωστή ως ενίσχυση με διαμεσολάβηση ιντρονίου (ΙΜΕ).

Οι ενεργά μεταγραμμένες περιοχές του DNA συχνά σχηματίζουν βρόχους R που είναι ευάλωτοι σε βλάβη του DNA. Σε εξαιρετικά εκφρασμένα γονίδια ζυμομύκητα, τα ιντρόνια αναστέλλουν το σχηματισμό του βρόχου R και την εμφάνιση βλάβης στο DNA. [38] Η ανάλυση σε επίπεδο γονιδιώματος τόσο σε ζυμομύκητες όσο και σε ανθρώπους αποκάλυψε ότι τα γονίδια που περιέχουν ιντρόνιο έχουν μειωμένα επίπεδα βρόχου R και μειωμένη βλάβη στο DNA σε σύγκριση με γονίδια χωρίς ιντρόνια παρόμοιας έκφρασης. [38] Η εισαγωγή ενός ιντρονίου σε ένα επιρρεπές σε βρόγχο R γονίδιο μπορεί επίσης να καταστείλει τον σχηματισμό και τον ανασυνδυασμό του βρόχου R. Οι Bonnet et al. (2017) [38] υπέθεσαν ότι η λειτουργία των ιντρονίων στη διατήρηση της γενετικής σταθερότητας μπορεί να εξηγήσει την εξελικτική τους διατήρηση σε ορισμένες τοποθεσίες, ιδιαίτερα σε γονίδια με υψηλή έκφραση.

Προσαρμογή λιμοκτονίας Επεξεργασία

Η φυσική παρουσία των ιντρονίων προάγει την κυτταρική αντίσταση στην πείνα μέσω της ενισχυμένης καταστολής των γονιδίων ριβοσωμικής πρωτεΐνης των οδών αίσθησης θρεπτικών συστατικών. [39]

Τα εσώνια μπορεί να χαθούν ή να αποκτηθούν κατά τη διάρκεια του εξελικτικού χρόνου, όπως φαίνεται από πολλές συγκριτικές μελέτες ορθολογικών γονιδίων. Μεταγενέστερες αναλύσεις εντόπισαν χιλιάδες παραδείγματα γεγονότων απώλειας και κέρδους ιντρονίων και έχει προταθεί ότι η εμφάνιση ευκαρυωτών ή τα αρχικά στάδια της ευκαρυωτικής εξέλιξης περιλάμβαναν εισβολή ιντρονίων. [40] Δύο οριστικοί μηχανισμοί απώλειας ιντρονίων, η απώλεια ιντρονίων που προκαλείται από την αντίστροφη μεταγραφάση (RTMIL) και οι γονιδιωματικές διαγραφές, έχουν εντοπιστεί και είναι γνωστό ότι συμβαίνουν. [41] Οι οριστικοί μηχανισμοί κέρδους ιντρονίου, ωστόσο, παραμένουν αόριστοι και αμφιλεγόμενοι. Τουλάχιστον επτά μηχανισμοί κέρδους ιντρονίου έχουν αναφερθεί μέχρι στιγμής: μετάθεση ιντρονίου, εισαγωγή τρανσποζονίου, διαδοχικός γονιδιωματικός διπλασιασμός, μεταφορά ιντρονίων, κέρδος ιντρονίου κατά τη διάρκεια επιδιόρθωσης σπασίματος διπλού κλώνου (DSBR), εισαγωγή ιντρονίου ομάδας II και ενδονοποίηση. Θεωρητικά, θα πρέπει να είναι ευκολότερο να συναχθεί η προέλευση των εσωνίων που αποκτήθηκαν πρόσφατα λόγω της έλλειψης μεταλλάξεων που προκαλούνται από τον ξενιστή, ωστόσο ακόμη και τα εσώνια που αποκτήθηκαν πρόσφατα δεν προέκυψαν από κανέναν από τους προαναφερθέντες μηχανισμούς. Αυτά τα ευρήματα εγείρουν έτσι το ερώτημα εάν οι προτεινόμενοι μηχανισμοί κέρδους ιντρονίου αποτυγχάνουν ή όχι να περιγράψουν τη μηχανιστική προέλευση πολλών νέων ιντρονίων επειδή δεν είναι ακριβείς μηχανισμοί κέρδους ιντρονίων ή εάν υπάρχουν άλλες, προς ανακάλυψη, διεργασίες που δημιουργούν νέα εσώνια. [42]

Στη μετάθεση ιντρονίου, τον πιο συχνά υποτιθέμενο μηχανισμό κέρδους ιντρονίου, ένα ματισμένο ιντρόνιο πιστεύεται ότι αντιστρέφει το μάτισμα είτε στο δικό του mRNA είτε σε άλλο mRNA σε θέση που προηγουμένως δεν ήταν ιντρονίου. Αυτό το mRNA που περιέχει ιντρόνιο στη συνέχεια μεταγράφεται αντίστροφα και το προκύπτον cDNA που περιέχει ιντρόνιο μπορεί στη συνέχεια να προκαλέσει κέρδος ιντρονίου μέσω πλήρους ή μερικού ανασυνδυασμού με τον αρχικό του γονιδιωματικό τόπο. Οι εισαγωγές τρανσποζονίου μπορούν επίσης να οδηγήσουν στη δημιουργία ιντρονίων. Μια τέτοια εισαγωγή θα μπορούσε να ενσωματώσει το τρανσποζόνιο χωρίς να διαταράξει την κωδικοποιητική αλληλουχία όταν ένα τρανσποζόνιο εισάγεται στην αλληλουχία AGGT, με αποτέλεσμα τον διπλασιασμό αυτής της αλληλουχίας σε κάθε πλευρά του τρανσποζονίου. Δεν είναι ακόμη κατανοητό γιατί αυτά τα στοιχεία συναρμολογούνται, είτε τυχαία, είτε από κάποια προνομιακή ενέργεια από το τρανσποζόνιο. Στον διαδοχικό γονιδιωματικό διπλασιασμό, λόγω της ομοιότητας μεταξύ συναινετικών θέσεων ματίσματος δότη και δέκτη, που μοιάζουν πολύ με AGGT, ο διαδοχικός γονιδιωματικός διπλασιασμός ενός εξωνικού τμήματος που φιλοξενεί μια αλληλουχία AGGT δημιουργεί δύο πιθανές θέσεις ματίσματος. Όταν αναγνωριστεί από το μάτισμα, η αλληλουχία μεταξύ του αρχικού και του διπλασιασμένου AGGT θα ματιστεί, με αποτέλεσμα τη δημιουργία ενός εσωνίου χωρίς αλλαγή της κωδικεύουσας αλληλουχίας του γονιδίου. Η επιδιόρθωση δίκλωνου σπασίματος μέσω μη ομόλογης ακραίας ένωσης αναγνωρίστηκε πρόσφατα ως πηγή κέρδους ιντρονίων όταν οι ερευνητές εντόπισαν σύντομες άμεσες επαναλήψεις που πλαισιώνουν το 43% των κερδισμένων ιντρονίων στη Δάφνια. [42] Αυτοί οι αριθμοί πρέπει να συγκριθούν με τον αριθμό των διατηρημένων ιντρονίων που πλαισιώνονται από επαναλήψεις σε άλλους οργανισμούς, ωστόσο, για στατιστική συνάφεια. Για την εισαγωγή ιντρονίου της ομάδας II, η επανατοποθέτηση ενός ιντρονίου της ομάδας II σε ένα πυρηνικό γονίδιο προτάθηκε για να προκαλέσει πρόσφατο κέρδος ματοσωμικού ιντρονίου.

Η μεταφορά ιντρονίου έχει υποτεθεί ότι καταλήγει σε κέρδος ιντρονίου όταν ένα παράλογο ή ψευδογονίδιο αποκτά ένα ιντρόνιο και στη συνέχεια μεταφέρει αυτό το ιντρόνιο μέσω ανασυνδυασμού σε μια θέση που απουσιάζει από ιντρόνιο στο αδελφό του παράλογο. Η ενδονοποίηση είναι η διαδικασία με την οποία μεταλλάξεις δημιουργούν νέα εσώνια από πρώην εξωνική αλληλουχία. Έτσι, σε αντίθεση με άλλους προτεινόμενους μηχανισμούς κέρδους ιντρονίου, αυτός ο μηχανισμός δεν απαιτεί την εισαγωγή ή παραγωγή DNA για τη δημιουργία ενός νέου ιντρονίου. [42]

Ο μόνος υποτιθέμενος μηχανισμός πρόσφατης αύξησης ιντρονίου που δεν έχει καμία άμεση απόδειξη είναι αυτός της εισαγωγής ιντρονίων της ομάδας II, ο οποίος όταν αποδεικνύεται in vivo, καταργεί την έκφραση γονιδίων. [43] Τα εσώνια της ομάδας II είναι επομένως πιθανότατα οι υποτιθέμενοι πρόγονοι των ματοσωμικών ιντρονίων, που δρουν ως ρετροστοιχεία ειδικά για τη θέση και δεν είναι πλέον υπεύθυνα για την αύξηση του ιντρονίου. [44] [45] Ο διαδοχικός γονιδιωματικός διπλασιασμός είναι ο μόνος προτεινόμενος μηχανισμός που υποστηρίζει in vivo πειραματικά στοιχεία: ένας σύντομος ενδογονιδιακός διπλός διπλασιασμός μπορεί να εισαγάγει ένα νέο εσώνιο σε ένα γονίδιο που κωδικοποιεί πρωτεΐνη, αφήνοντας αμετάβλητη την αντίστοιχη πεπτιδική αλληλουχία. [46] Αυτός ο μηχανισμός έχει επίσης εκτεταμένα έμμεσα στοιχεία που υποστηρίζουν την ιδέα ότι ο διαδοχικός διπλασιασμός του γονιδιώματος είναι ένας διαδεδομένος μηχανισμός για την αύξηση του ιντρονίου. Η δοκιμή άλλων προτεινόμενων μηχανισμών in vivo, ιδιαίτερα του κέρδους ιντρονίου κατά τη διάρκεια του DSBR, της μεταφοράς ιντρονίου και της ενδονοποίησης, είναι δυνατή, αν και αυτοί οι μηχανισμοί πρέπει να αποδειχθούν in vivo για να στερεοποιηθούν ως πραγματικοί μηχανισμοί κέρδους ιντρονίου. Περαιτέρω γονιδιωματικές αναλύσεις, ειδικά όταν εκτελούνται σε επίπεδο πληθυσμού, μπορούν στη συνέχεια να ποσοτικοποιήσουν τη σχετική συνεισφορά κάθε μηχανισμού, εντοπίζοντας πιθανώς προκαταλήψεις για συγκεκριμένα είδη που μπορεί να ρίξουν φως σε ποικίλους ρυθμούς αύξησης ιντρονίων μεταξύ διαφορετικών ειδών. [42]


ΜΕΘΟΔΟΙ

Προκειμένου να καθιερωθεί μια τυπική ονοματολογία για τα ιντρόνια σε γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες σε όλη την Βασίλειο Μύκητες, είναι απαραίτητο να βρεθεί ένα κατάλληλο μιτογόνο αναφοράς. Εξετάζοντας είδη μυκήτων με διαθέσιμα μιτογόνο, επιλέγουμε το μιτογόνο του μύκητα που παράγει κυκλοσπορίνη Tolypocladium inflatum ARSEF 3280 (αριθμός πρόσβασης NC_036382) ως το μιτογόνο αναφοράς. Το μιτογόνο των 25.328 bp του Τ. inflatum περιέχει και τα 15 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που συνήθως απαντώνται σε μιτογονογονίδια μυκήτων και δεν υπάρχει εσώνιο σε κανένα από αυτά τα γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (Zhang et al. 2017d). Δεν επιλέξαμε το πιο κατανοητό μοντέλο μύκητες: 'μαγιά αρτοποιίας' Saccharomyces cerevisiae, η μαγιά σχάσης Schizosaccharomyces pombe, το ευκαιριακό μυκητιακό παθογόνο Candida albicans, το νηματοειδές ευασκομύκητα Neurospora crassaκτλ. Αυτό συμβαίνει γιατί οι ζύμες ΑΝΩΝΥΜΗ ΕΤΑΙΡΙΑ. cerevisiae και Sc. pombe και τα δύο στερούνται γονιδίων που κωδικοποιούν τις αφυδρογονάσες NADH στο μιτογόνο τους (Foury et al. 1998) και C. albicans και N. crassa περιέχουν ιντρόνια σε πολλά διαφορετικά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (Borkovich et al. 2004 Bartelli et al. 2013). Επίσης, δεν επιλέξαμε το ανθρώπινο μιτοχονδριακό γονιδίωμα, το οποίο επιλέχθηκε ως αναφορά στα ονόματα εσωνίων που βρέθηκαν στο nad5 και cox1 σε ορισμένα μεταζώα (Emblem et al. 2011). Αυτό συμβαίνει επειδή το ανθρώπινο μιτογόνο περιέχει μόνο 13 τυπικά γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες χωρίς atp9 και rps3. Τα δύο τελευταία γονίδια είναι γνωστό ότι φιλοξενούν ιντρόνια σε μιτογονογονίδια μυκήτων.

Τόσο βασικά όσο και υψηλότερα μύκητες μπορεί να περιέχουν εσώνια στο μιτογόνο τους. Επιλέξαμε τυχαία αντιπροσωπευτικά είδη σε κάθε φύλο μυκήτων για να εντοπίσουμε και να ονομάσουμε πιθανά ιντρόνια (Πίνακας 1). Ο προσδιορισμός της θέσης εισαγωγής ενός ιντρονίου βασίζεται στην ευθυγράμμιση μεταξύ των αλληλουχιών του γονιδίου του ξενιστή και των αντίστοιχων γονιδιακών αλληλουχιών του Τ. inflatum (Επιπλέον αρχείο 1). Αν και υπάρχουν πολλά διαθέσιμα προγράμματα ευθυγράμμισης ακολουθιών, συνιστούμε τη χρήση του MAFFT (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/), το οποίο είναι γρήγορο κατά την ευθυγράμμιση μεγάλων ακολουθιών που περιέχουν πολλά εσώνια και μπορεί πάντα να δημιουργήσει ικανοποιητική στοίχιση σύμφωνα με την εμπειρία μας . Η προεπιλεγμένη ρύθμιση του MAFFT λειτουργεί καλά στις περισσότερες περιπτώσεις. Εάν τα όρια εξονίου-ιντρονίου δεν προσδιορίζονται σωστά (πιθανότατα λόγω της παρεμβολής ακολουθιών εσωνίων ή παρουσία βραχέων εξονίων) στις προεπιλεγμένες ρυθμίσεις, μπορεί κανείς να εξετάσει το ενδεχόμενο να προσαρμόσει τις παραμέτρους ευθυγράμμισης (π.χ. δοκιμάστε "Unalignlevel > 0" και πιθανώς "Leave gappy περιοχές» επιλέγοντας τη στρατηγική ευθυγράμμισης G-INS-1 ή G-INS-i) και/ή εισάγοντας πρόσθετες αλληλουχίες για ευθυγράμμιση από ένα είδος που σχετίζεται στενά με το υπό δοκιμή είδος. Επιπλέον, είναι πάντα σκόπιμο να γίνεται αναφορά σε γνωστά αποτελέσματα σχολιασμού και/ή χαρακτηριστικά νουκλεοτίδια σε θέσεις ματίσματος των ιντρονίων της ομάδας Ι/ΙΙ (Cech 1988) για να διασφαλιστεί η σωστή ευθυγράμμιση και αναγνώριση των ορίων εξονίου-ιντρονίου.


Πληροφορίες για τον συγγραφέα

Συνεργασίες

Universidade Federal do Espírito Santo, Grupo de Ecologia Bêntica, Departamento de Oceanografia, Av. Fernando Ferrari, 514, Vitória, ES, 29075-910, Βραζιλία

Auburn University, Department of Biological Sciences, 101 Life Sciences Building, Auburn, AL, 36849, USA

Yuanning Li & Kenneth M. Halanych

Department of Oceanography, SOEST, University of Hawaii at Manoa, 1000 Pope Road, Honolulu, HI, 96822, USA

Μπορείτε επίσης να αναζητήσετε αυτόν τον συγγραφέα στο PubMed Google Scholar

Μπορείτε επίσης να αναζητήσετε αυτόν τον συγγραφέα στο PubMed Google Scholar

Μπορείτε επίσης να αναζητήσετε αυτόν τον συγγραφέα στο PubMed Google Scholar

Μπορείτε επίσης να αναζητήσετε αυτόν τον συγγραφέα στο PubMed Google Scholar

Συνεισφορές

Σχεδίασε και σχεδίασε τα πειράματα: C.R.S., K.M.H. Πραγματοποίησε τα πειράματα: A.F.B., Y.L., C.R.S., K.M.H. Ανάλυσαν τα δεδομένα: Α.Φ.Β., Υ.Λ., Κ.Μ.Η. Συνεισφέροντα αντιδραστήρια/υλικά/εργαλεία ανάλυσης: K.M.H., C.R.S. Έγραψε την εργασία: A.F.B., Y.L., C.R.S., K.M.H.

Αντίστοιχοι συγγραφείς


Μέθοδοι

Απομονώσεις μυκήτων και εξαγωγή DNA

Δεκαέξι Τ. fuciformis Τα προϊόντα απομόνωσης (TF01-TF16) ελήφθησαν από το Κέντρο Διαχείρισης Πόρων του Βρώσιμου Μυκητιακού Γερμπλάσματος της επαρχίας Fujian, Fuzhou, Κίνα. Η προέλευση των απομονώσεων παρατίθεται στον Συμπληρωματικό Πίνακα 3. Μεταξύ αυτών, το TF15 απομονώθηκε από τα εθνικά πάρκα Wuyishan, Fujian, Κίνα, το 2014, το TF11 και το TF14 ελήφθησαν από το Εθνικό Φυσικό Καταφύγιο Wuyishan το 2015 και το TF01 ήταν ένα άλλο άγριο ισοόλη Εθνικό φυσικό καταφύγιο Huboliao του Fujian.

Αφού καλλιεργήθηκαν σε ζωμό δεξτρόζης πατάτας στους 25 °C για 48 ώρες, μεμονωμένα κύτταρα που μοιάζουν με ζύμη Τ. fuciformis πλύθηκαν και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 10.000 g για 5 λεπτά και αποθηκεύτηκαν στους -20 °C μετά από ξήρανση με κατάψυξη. Για την αλληλουχία Illumina, συνολικό γονιδιωματικό DNA 16 Τ. fuciformis Τα προϊόντα απομόνωσης εκχυλίστηκαν χρησιμοποιώντας το Omega HP Plant DNA Kit σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή, απαιτούνταν τουλάχιστον 500 ng DNA (> 18 ng/ul) για κάθε δείγμα. Για τον προσδιορισμό αλληλουχίας PacBio, ο προσδιορισμός αλληλουχίας ενός μορίου σε πραγματικό χρόνο (SMRT), μακρά θραύσματα DNA του TF02 και του TF15 απομονώθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο βρωμιούχου κετυλοτριμεθυλαμμώνιου (CTAB) όπως περιγράφεται στη διεύθυνση www.pacb.com/wp-content/uploads/2015/09 / DNA-extraction-chlamy-CTAB-JGI.pdf τουλάχιστον 20 μg DNA (OD260/280 μεταξύ 1,8 και 2,0, OD260/230 μεταξύ 2,0 και 2,2, άθικτο gDNA > 20 kb) απαιτούνταν για κάθε δείγμα.

Αλληλουχία γονιδιώματος, συναρμολόγηση και γονιδιακός σχολιασμός

Αλληλουχία κυνηγετικού όπλου ολόκληρου του γονιδιώματος 16 Τ. fuciformis Οι απομονώσεις πραγματοποιήθηκαν στην Beijing Novogene Bioinformatics Technology Co., Ltd. χρησιμοποιώντας την πλατφόρμα Illumina HiSeq 2500 με βιβλιοθήκες ζεύξης, στοχεύοντας δεδομένα 3–6 Gb ανά απομόνωση. Τα ακατέργαστα δεδομένα αλληλουχίας Illumina του Τ. mesenterica Το ATCC28783 (accession SRX8046622) έγινε λήψη από τη βάση δεδομένων SRA του NCBI. Οι ακατέργαστες αναγνώσεις συναρμολογήθηκαν χρησιμοποιώντας Velvet 1.2.03 [52].

Τα μιτοχονδριακά κολλήματα ταυτοποιήθηκαν με BLAST έναντι δημοσιευμένου μιτοχονδριακού γονιδιώματος του Cryptococcus neoformans var. grubii H99 (προσχώρηση NC_004336). Τα μιτοχονδριακά contig επεκτάθηκαν βήμα προς βήμα σύμφωνα με τη σχέση ζεύγους-άκρου των αναγνώσεων: εάν η μία ανάγνωση απεικονίζεται στο άκρο ενός contig, το άλλο άκρο μπορεί να επεκτείνει την ακολουθία. Διφορούμενες επεκτάσεις ή κενά επιβεβαιώθηκαν ή κλείστηκαν με προσδιορισμό αλληλουχίας PCR. Τα Contigs συνενώθηκαν σε μεμονωμένες κυκλικές αλληλουχίες DNA με βάση 100% επικάλυψη.

Η τεχνολογία προσδιορισμού αλληλουχίας PacBio χρησιμοποιήθηκε για την επαλήθευση της ακρίβειας συναρμολόγησης δύο από τις απομονώσεις με αλληλουχία Illumina, TF13 και TF15. Η αλληλουχία αυτών έγινε χρησιμοποιώντας PacBio RS II, στοχεύοντας περίπου 2,5 Gb ακατέργαστα δεδομένα ανά απομόνωση. Η συναρμολόγηση γονιδιώματος για δεδομένα αλληλουχίας PacBio έγινε χρησιμοποιώντας το πρόγραμμα Canu 1.3 [53]. Τα μεμονωμένα contigs για κάθε μιτογόνο ταυτοποιήθηκαν με σύγκριση με τα μιτοχονδριακά γονιδιώματα των αντίστοιχων απομονώσεων που ελήφθησαν από δεδομένα αλληλουχίας Illumina, για να ληφθούν πλήρη κυκλικά DNA μετά την περικοπή των άκρων 3'.

Τόσο η πρόβλεψη γονιδίου όσο και ο σχολιασμός γονιδίων έγιναν αρχικά χρησιμοποιώντας το διαδικτυακό εργαλείο MFannot (http://megasun.bch.umontreal.ca/cgi-bin/mfannot/mfannotInterface.pl). Τα tRNA σχολιάστηκαν συνδυάζοντας τα αποτελέσματα των MFannot, tRNAscan-SE [54] και RNAweasel [55]. Τα διατηρημένα όρια γονιδίων και τα σημεία σύνδεσης εξονίου-ιντρονίου επιβεβαιώθηκαν με σύγκριση με αντίστοιχα γονίδια χωρίς ιντρόνια άλλων ελεγμένων απομονώσεων χρησιμοποιώντας το Clustal X [56].

Φυλογενετική ανάλυση του Τ. fuciformis απομονώνει

Να προσδιοριστούν οι εξελικτικές σχέσεις μεταξύ των 16 Τ. fuciformis απομονώσεις, συγχωνευμένες αλληλουχίες αμινοξέων 14 διατηρημένων γονιδίων (atp6, atp8, atp9, καλαμπόκι, cox1, cox2, cox3, nad1, nad2, nad3, nad4, nad4L, nad5, και nad6) συνολικά 4252 χαρακτήρες, χρησιμοποιήθηκαν για φυλογενετική ανάλυση, χρησιμοποιώντας Τ. mesenterica ως εξωομάδα. Οι ευθυγραμμίσεις αμινοξέων έγιναν χρησιμοποιώντας το Clustal W στο πρόγραμμα MEGA 6 [57] με ποινή ανοίγματος κενού και εκτεταμένες τιμές ποινής κενού 10 και 3, αντίστοιχα (όμοια με τις ευθυγραμμίσεις ανά ζεύγη και πολλαπλές στοίχιση). Κατασκευάστηκε ένα φυλογενετικό δέντρο χρησιμοποιώντας τη μέγιστη πιθανότητα στο MEGA 6 και δοκιμάστηκε με ανάλυση Booststrap με 500 επαναλήψεις. Τα κενά και τα δεδομένα που λείπουν στις ευθυγραμμίσεις αντιμετωπίστηκαν ως διαγραφές.

Ανάλυση PCR για επιβεβαίωση ειδικών προβλεπόμενων εσωνίων

Οι αναλύσεις PCR χρησιμοποιήθηκαν για να επιβεβαιώσουν τα προβλεπόμενα ιντρόνια. Τα Primers (Συμπληρωματικός Πίνακας 4) σχεδιάστηκαν χρησιμοποιώντας διαδικτυακό εργαλείο primer-blast από τον ιστότοπο του NCBI. Αυτοί οι εκκινητές στόχευαν περιοχές του cDNA από το ανάντη εξόνιο προς την Ν-τελική αλληλουχία, και σε ειδικές περιπτώσεις, περιοχές από το ανάντη εξόνιο έως τον Ν-τερματικό διπλασιασμό. Επιλέχθηκαν αντιπροσωπευτικές απομονώσεις για την εργασία PCR Τα mtDNA αυτών των απομονώσεων έπρεπε να περιλαμβάνουν όλα τα ιντρόνια και τις αντίστοιχες αλληλουχίες ελεύθερες ιντρονίων.

Τα κύτταρα ζυμομύκητα συλλέχθηκαν σε λογαριθμική φάση και το RNA εκχυλίστηκε χρησιμοποιώντας το κιτ φυτικού RNA Omega HP.Το cDNA μεταγράφηκε αντίστροφα χρησιμοποιώντας το κιτ PrimeScript™ RT-PCR (Takara, Dalian) και χρησιμοποιήθηκε ως πρότυπα PCR. Τα προϊόντα PCR αναλύθηκαν σε αλληλουχία στη Sangon Biotech (Σαγκάη).


Υλικά και μέθοδοι

Δειγματοληψία και εξαγωγή DNA

Το συμπτωματικό μυκήλιο του παθογόνου της ολισθηρής ουλής από Α. πολυτρίχα συλλέχτηκε από το Jintang, στην επαρχία Sichuan, στην Κίνα. Η απομόνωση του αιτιολογικού παθογόνου πραγματοποιήθηκε σύμφωνα με τον Peng et al. 1 Οι ύποπτοι μύκητες αρχικά καλλιεργήθηκαν σε μέσο PDA για 3 ημέρες και στη συνέχεια εμβολιάστηκαν σε σάκους καλλιέργειας με υγιή Α. πολυτρίχα μυκήλια. Οι ενοφθαλμισμένοι σάκοι καλλιέργειας καλλιεργήθηκαν στους 25°C για 20 ημέρες. Στη συνέχεια οι παθογόνοι μύκητες απομονώθηκαν εκ νέου από τους σάκους καλλιέργειας με μολυσμένους Α. πολυτρίχα, το οποίο παρουσίαζε τα συμπτώματα της ολισθηρής ουλής. Το στέλεχος αναγνωρίστηκε ως S. auriculariicola με βάση τα αξιώματα του Koch, τη μορφολογία και τις αλληλουχίες ITS. Το μυκήλιο του S. auriculariicola καλλιεργήθηκε σε υγρό μέσο δεξτρόζης πατάτας για 4 ημέρες και στη συνέχεια συλλέχθηκε για εκχύλιση DNA. Το συνολικό DNA εξήχθη από τα μυκήλια χρησιμοποιώντας το μυκητιακό DNA Kit D3390-00 (Omega Bio-Tek, Norcross, GA, ΗΠΑ) σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Η ποιότητα του εξαγόμενου DNA ελέγχθηκε με ηλεκτροφόρηση και το DNA αποθηκεύτηκε στους -20 °C μέχρι τον προσδιορισμό της αλληλουχίας. ο S. auriculariicola Το στέλεχος αποθηκεύτηκε στην Ακαδημία Γεωργικών Επιστημών Sichuan (Αρ. SAAS_Sau) και είναι διαθέσιμο από τους Cheng Chen και Daihua Lu της Ακαδημίας Γεωργικών Επιστημών Sichuan, Κίνα.

Αλληλουχία, συναρμολόγηση και σχολιασμός του μιτοχονδριακού γονιδιώματος

Καθαρισμένο DNA χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή βιβλιοθηκών προσδιορισμού αλληλουχίας ακολουθώντας τις οδηγίες του κιτ προετοιμασίας βιβλιοθήκης DNA NEBNext Ultra II (NEB, Πεκίνο, Κίνα). Η αλληλουχία του κυνηγετικού όπλου ολόκληρου του γονιδιώματος πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας μια πλατφόρμα Illumina HiSeq 2500 (Illumina, San Diego, CA, USA). Πραγματοποιήσαμε ποιοτικό έλεγχο και de novo συναρμολόγηση του μιτογόνου σύμφωνα με το Bi 52 . Για το οποίο χρησιμοποιήθηκε το λογισμικό SPAdes 3.9.0 53 de novo συναρμολόγηση του μιτογόνου, και το πρόγραμμα MITObim V1.9 54 χρησιμοποιήθηκε για την πλήρωση των κενών μεταξύ των contigs.

Τα εργαλεία MFannot (http://megasun.bch.umontreal.ca/cgi-bin/mfannot/mfannotInterface.pl) και MITOS 55 χρησιμοποιήθηκαν για τον σχολιασμό του μιτογόνου S. auriculariicola, και τα δύο βασίζονται στον Γενετικό Κώδικα 4. Αβέβαια αποτελέσματα προσαρμόστηκαν χειροκίνητα με ευθυγραμμίσεις αλληλουχίας με ορθόλογα γονίδια χωρίς εσώνιο από τα στενά συγγενικά είδη. Τα αρχικά σχολιασμένα γονίδια κωδικοποίησης πρωτεΐνης, rRNA ή tRNA γονίδια του S. auriculariicola τροποποιήθηκαν επίσης με ευθυγράμμιση με προηγούμενα δημοσιευμένα μιτογονογονίδια Leotiomycetes. Τα ORF σχολιάστηκαν λειτουργικά από το λογισμικό InterProScan 56 . Το πρόγραμμα tRNAscan-SE 2.0 χρησιμοποιήθηκε για την πρόβλεψη γονιδίων tRNA 57 . Τέλος, χρησιμοποιήσαμε το εργαλείο OrganellarGenomeDraw (OGDRAW) 58 για να σχεδιάσουμε έναν χάρτη του S. auriculariicola πλήρες μιτογόνο.

Ανάλυση της μιτογόνου οργάνωσης

Χρησιμοποιήσαμε το εργαλείο Lasergene v7.1 (DNASTAR http://www.dnastar.com/) με προεπιλεγμένες ρυθμίσεις για να αναλύσουμε τη σύνθεση βάσης του μιτογόνου S. auriculariicola. Η ασυμμετρία κλώνου του μιτογόνου αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τους ακόλουθους τύπους: λοξό AT = [A − T]/[A + T], και λοξό GC = [G − C]/[G + C] 59 . Υπολογίσαμε τη χρήση κωδικονίου χρησιμοποιώντας το λογισμικό Sequence Manipulation Suite 60 με βάση τον γενετικό κώδικα 4. Συγκρίναμε τη διάταξη των γονιδίων σε S. auriculariicola με εκείνα άλλων δημοσιευμένων ειδών Leotiomycetes. Η ανάλυση γονιδιωματικής συντενίας των μιτογόνων από έξι αντιπροσωπευτικά είδη εντός των Λεοιομυκήτων διεξήχθη με Mauve v2.4.0 61 .

Ανάλυση επαναλαμβανόμενων στοιχείων

Αναζητήσαμε ολόκληρο το μιτογόνο του S. auriculariicola από το BLASTn αναζητά τον εαυτό του χρησιμοποιώντας το Circoletto 62 (http://tools.bat.infspire.org/circoletto/) με τιμή E <10 −10, με στόχο τον εντοπισμό μεγάλων ενδογονιδιωματικών αντιγραφών αλληλουχιών και διάσπαρτων επαναλήψεων. Το Tandem Repeats Finder 63 (http://tandem.bu.edu/trf/trf.advanced.sub-mit.html) με προεπιλεγμένες ρυθμίσεις χρησιμοποιήθηκε για την ανάλυση των διαδοχικών επαναλήψεων. Αναζητήσαμε επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες συμπεριλαμβανομένων προς τα εμπρός, αντίστροφα, συμπληρωματικά και αντίστροφα συμπληρωματικές ακολουθίες σε S. auriculariicola χρησιμοποιώντας το εργαλείο REPuter 64 με E-values ​​<10 −5 .

Φυλογενετική ανάλυση

Για τη φυλογενετική ανάλυση, κατασκευάσαμε ένα φυλογενετικό δέντρο με βάση 15 κοινά μιτοχονδριακά γονίδια από S. auriculariicola και άλλα 15 είδη στους Λεοτιομύκητες, 8 είδη στους Δωθηδεομύκητες, 11 είδη στους Ευρωτιομύκητες και 3 είδη στους Σορδαριομύκητες (εξωομάδα). Ο αλγόριθμος MAFFT στην ηλεκτρονική πλατφόρμα 65 του TranslatorX χρησιμοποιήθηκε για την ευθυγράμμιση των 15 συντηρημένων γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Το πρόγραμμα Sequence Matrix 1.7.8 66 χρησιμοποιήθηκε για να συνδυάσει τα μεμονωμένα γονίδια σε μια συνδυασμένη μήτρα. Χρησιμοποιήσαμε το εργαλείο Modelgenerator v851 67 για να προσδιορίσουμε το καλύτερο εξελικτικό μοντέλο για τη φυλογενετική ανάλυση.

Η μέθοδος συμπερασμάτων Bayes (BI) χρησιμοποιήθηκε για φυλογενετική ανάλυση με βάση το συνδυασμένο σύνολο δεδομένων γονιδίων με το πρόγραμμα MrBayes 3.2.6 68. Πραγματοποιήθηκαν δύο ανεξάρτητες δοκιμές για δειγματοληψία 2 × 10 6 γενεών ανά 100 γενιές. Κάθε δοκιμή έγινε δειγματοληψία κάθε 100 γενιές. Η σταθερότητα θεωρήθηκε ότι επιτεύχθηκε όταν το εκτιμώμενο μέγεθος δείγματος (ESS) ήταν >100 και ο δυνητικός συντελεστής μείωσης κλίμακας (PSRF) πλησίασε το 1,0. Αφού η ανάλυση ήταν σταθερή, το πρώτο 25% των δέντρων που αποδόθηκαν απορρίφθηκαν ως καμένα και ένα δέντρο συναίνεσης με κανόνα πλειοψηφίας 50% με τιμές μεταγενέστερης πιθανότητας (PP) δημιουργήθηκε από τα υπόλοιπα δέντρα. Προκειμένου να συγκρίνουμε τη μιτοχονδριακή φυλογένεση με τη φυλογένεση των πυρηνικών πολλαπλών θέσεων, κατεβάσαμε το εσωτερικό μεταγραμμένο διαχωριστικό (ΤΟΥ), RNA πολυμεράση II δεύτερη μεγαλύτερη υπομονάδα (RPB2), παράγοντας επιμήκυνσης μετάφρασης-1 άλφα (EF1-α) και βήτα-τουμπουλίνη (β-TUB) γονίδια 38 ειδών από τη βάση δεδομένων NCBI. Τα φυλογενετικά δέντρα κατασκευάστηκαν χρησιμοποιώντας την ίδια μέθοδο με τα μιτοχονδριακά γονίδια. Χρησιμοποιήσαμε επίσης τη μέθοδο BI για να αναλύσουμε τις φυλογενετικές σχέσεις του S. auriculariicola και συναφή είδη που χρησιμοποιούν μεμονωμένα μιτοχονδριακά γονίδια (15 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες πυρήνα) σκοπός των οποίων είναι να ελεγχθεί εάν αυτά τα γονίδια ήταν χρήσιμα ως μοριακοί δείκτες για τη φυλογενετική ανάλυση των ειδών των λεοτιομυκήτων.


Δες το βίντεο: Όλη Η Αλήθεια Για Την Κρεατίνη (Νοέμβριος 2022).