Πληροφορίες

Το E. coli δεν αναπτύσσεται σε υγρό μέσο

Το E. coli δεν αναπτύσσεται σε υγρό μέσο


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Κάνουμε τακτικά μετασχηματισμό βακτηρίων και υποκαλλιέργεια από πλάκα σε υγρά μέσα για την εξαγωγή DNA. Αυτό συνήθως πηγαίνει πολύ καλά και είναι απλό, αλλά περιστασιακά, οι αποικίες που αναπτύχθηκαν καλά σε ένα πιάτο, δεν θα αναπτυχθούν σε υγρή καλλιέργεια (με τα ίδια αντιβιοτικά που υπήρχαν στο πιάτο). Αυτό έχει συμβεί τώρα σε τρία άτομα σε πολλαπλά πλασμίδια.

Για παράδειγμα, προσπαθούσα να συνδέσω ένα γονίδιο αντίστασης στην αμπικιλλίνη (με τον προαγωγέα του) μέσα στο πλασμίδιο pENTR4 (ήδη με αντοχή στην καναμυκίνη). Το πιάτο μου και το LB περιείχαν τα δύο αντιβιοτικά, αλλά οι αποικίες καταφέρνουν να γίνουν ελαφρώς θολές σε χρονικό σημείο 16 ωρών.

Η μόλυνση από φάγο είναι πολύ απίθανη και το αποτέλεσμα δεν μπορεί να οφείλεται σε τοξικότητα του παρεμβαλλόμενου θραύσματος, καθώς τόσο το ένθετο όσο και ο φορέας έχουν αναπτυχθεί σε αυτά τα ίδια βακτήρια πολλές φορές χωρίς πρόβλημα.

Βοήθεια?

EDIT1 - Χρησιμοποιούμε καρβενικιλλίνη στη θέση της αμπικιλλίνης στο πιάτο, αλλά όχι στα υγρά μέσα.

EDIT2 - Αφού κατάφερα να αναπτύξω μερικές αποικίες σε υγρό, κατάφερα να πάρω μια μικρή ποσότητα του πλασμιδίου (το προφίλ ήταν καλό, συγκέντρωση = 70 ng/ul). Το περίεργο είναι ότι όταν μετέτρεψα αυτό το DNA σε βακτήρια Stbl3, δεν είχα κανένα απολύτως πρόβλημα. Πιστεύετε ότι το απόθεμα βακτηρίων μπορεί να ευθύνεται;


Νομίζω ότι υπάρχουν περισσότερες από μία δυνατότητες για αυτό.

  1. Οι πλάκες που φέρουν αποικίες αποθηκεύονται για πολύ μεγάλο χρονικό διάστημα σε 4C (όπως προτείνει ο @mdperry). Αυτό αναγκάζει τις αποικίες να χάνουν το πλασμίδιο με την πάροδο του χρόνου καθώς το αντιβιοτικό στο τρυβλίο αποικοδομείται με την πάροδο του χρόνου. Υπάρχει μια μελέτη για αυτό και έχω μοιραστεί τον σύνδεσμο. (http://homepages.bw.edu/~mbumbuli/biotech/colin/index.html).
  2. Το ένθετο είναι τοξικό για τα κύτταρα και ο υποκινητής δεν είναι αρκετά ισχυρός. Υπάρχει μια διαρροή έκφραση που προκαλεί τον θάνατο των κυττάρων.
  3. Ελέγξτε τις αρμόδιες κυψέλες και την κατάσταση αποθήκευσής τους καθώς θα επηρέαζε πολύ την αποτελεσματικότητα του μετασχηματισμού. Κάντε μια εικονική μεταμόρφωση με απλό πλασμίδιο χωρίς ένθετο και απλώστε τα σε ένα αντιβιοτικό πιάτο.

Ταχεία συσσώρευση μεταλλάξεων που ενεργοποιούν την κινητικότητα σε υγρή καλλιέργεια σε ηρεμία Escherichia coli

Η έκφραση των γονιδίων κινητικότητας είναι μια δυνητικά ευεργετική αλλά δαπανηρή διαδικασία στα βακτήρια. Είναι ενδιαφέρον ότι πολλά απομονώνουν στελέχη του Escherichia coli διαθέτουν γονίδια κινητικότητας, αλλά έχουν χάσει την ικανότητα να τα ενεργοποιούν υπό συνθήκες στις οποίες η κινητικότητα είναι πλεονεκτική, εγείροντας το ερώτημα πώς ανταποκρίνονται σε αυτές τις καταστάσεις. Μέσω του προφίλ μεταγραφής των στελεχών στο Ε. coli Η συλλογή Keio με ένα νοκ-άουτ γονίδιο, παρατηρήσαμε δραστική αύξηση των γονιδίων κινητικότητας σε πολλά από τα στελέχη διαγραφής σε σύγκριση με τα επίπεδα του ασθενώς κινητικού γονικού στελέχους τους (BW25113). Δείχνουμε ότι αυτή η αλλαγή σε έναν κινητικό φαινότυπο δεν είναι άμεση συνέπεια των γονιδίων που έχουν διαγραφεί, αλλά οφείλεται σε μια ποικιλία δευτερογενών μεταλλάξεων που αυξάνουν την έκφραση του κύριου ρυθμιστή κινητικότητας, FlhDC. Είναι σημαντικό ότι βρίσκουμε ότι αυτός ο διακόπτης μπορεί να αναπαραχθεί με την ανάπτυξη κακής κινητικότητας Ε. coli στελέχη σε μη ανακινούμενο υγρό μέσο όλη τη νύχτα αλλά όχι σε ανακινούμενο υγρό μέσο. Μεμονωμένα στελέχη μετά τις μη ανακινούμενες ολονύκτια επωάσεις απέκτησαν διακριτές μεταλλάξεις ανάντη του flhDC οπερόνιο, συμπεριλαμβανομένων διαφορετικών στοιχείων αλληλουχίας εισαγωγής (IS) και, σε μικρότερο βαθμό, σημειακών μεταλλάξεων. Η ταχύτητα με την οποία οι γενετικές αλλαγές σαρώνουν τους πληθυσμούς που αναπτύχθηκαν χωρίς να ταλαντεύονται δείχνει ότι τα κακώς κινητικά στελέχη μπορούν γρήγορα να προσαρμοστούν σε έναν κινητικό τρόπο ζωής μέσω γενετικής επανακαλωδίωσης.ΣΗΜΑΣΙΑ Η ικανότητα συντονισμού της γονιδιακής έκφρασης σε περιόδους ανάγκης έξω από προκαθορισμένα ρυθμιστικά δίκτυα είναι μια ουσιαστική εξελικτική διαδικασία που επιτρέπει στους οργανισμούς να επιβιώσουν και να ανταγωνίζονται. Εδώ, δείχνουμε ότι κατά την ολονύκτια επώαση σε υγρό μέσο χωρίς ανακίνηση, πληθυσμοί σε μεγάλο βαθμό μη κινητές Escherichia coli βακτήρια μπορούν να συσσωρεύσουν γρήγορα μεταλλάγματα που έχουν ιδιοσυστατική κινητικότητα. Αυτό το φαινόμενο συμβάλλει σε εκτεταμένες δευτερεύουσες μεταλλάξεις στη βιβλιοθήκη νοκ-άουτ ενός γονιδίου, τη συλλογή Keio. Ως αποτέλεσμα, τα 49/71 (69%) των στελεχών Keio που δοκιμάστηκαν εμφάνισαν διάφορους βαθμούς κινητικότητας, ενώ το γονικό τους στέλεχος είναι ελάχιστα κινητικό. Αυτές οι παρατηρήσεις τονίζουν την πλαστικότητα της γονιδιακής έκφρασης ακόμη και ελλείψει προϋπάρχοντων κανονιστικών προγραμμάτων και θα πρέπει να ευαισθητοποιήσουν τις διαδικασίες για τον χειρισμό εργαστηριακών στελεχών Ε. coli.

Λέξεις-κλειδιά: Εξέλιξη συλλογής Keio ρύθμιση γονιδίου μαστιγίου Ρύθμιση γονιδίου κινητικότητας μαστιγίων.

Πνευματικά δικαιώματα © 2019 American Society for Microbiology.

Φιγούρες

Αναδιαμόρφωση μεταγραφώματος μεταξύ των στελεχών Keio.…

Αναδιαμόρφωση μεταγραφώματος μεταξύ στελεχών Keio. (Α) Ιεραρχική ομαδοποίηση δεδομένων γονιδιακής έκφρασης από…

Επιβεβαίωση έκφρασης γονιδίου κινητικότητας…

Επιβεβαίωση της έκφρασης γονιδίου κινητικότητας με χρήση αναφοράς GFP που καθοδηγείται από το fliC…

Συσχέτιση μεταξύ ενεργοποίησης γονιδίου κινητικότητας…

Συσχέτιση μεταξύ ενεργοποίησης γονιδίου κινητικότητας και φαινοτύπου κολύμβησης. (Α) Δοκιμασία κινητικότητας κολύμβησης σε…

Απουσία ενεργοποίησης κινητικότητας μετά από…

Απουσία ενεργοποίησης κινητικότητας μετά από μεταγωγή P1 διαγραφών ενός γονιδίου. (Α) επίπεδα mRNA…

Διάφορες δευτερογενείς μεταλλάξεις υπεύθυνες για…

Διάφορες δευτερεύουσες μεταλλάξεις υπεύθυνες για την ενεργοποίηση της κινητικότητας στη συλλογή Keio. (Α) Μεταλλάξεις σε…

Ταχεία συσσώρευση μεταλλάξεων που ενεργοποιούν την κινητικότητα…

Ταχεία συσσώρευση μεταλλάξεων που ενεργοποιούν την κινητικότητα σε υγρή καλλιέργεια σε ηρεμία. (Α) Δοκιμασία κολύμβησης με μαλακό άγαρ…

Ενεργοποίηση γονιδίου κινητικότητας σε στελέχη…

Ενεργοποίηση γονιδίου κινητικότητας σε στελέχη ανεπαρκή για αεροταξία και χημειοταξία. (Α) Αποτελέσματα μετασχηματισμού…


Τα μικρά RNA ανταποκρίνονται στο στρες κατά τη διάρκεια Ε. coli ανάπτυξη σε φιάλες ανακίνησης

Οι περισσότερες πληροφορίες σχετικά με τη συμμετοχή sRNAs σε απόκριση σε συνθήκες πίεσης ανάπτυξης ελήφθησαν από Ε. coli αυξάνεται σε χαμηλή πυκνότητα σε φιάλη ανακίνησης. Τα δεδομένα που ελήφθησαν από αυτές τις μελέτες εντόπισαν πολλά sRNA που ανταποκρίνονται στο στρες, συμπεριλαμβανομένης της θερμοκρασίας, της ωσμωτικότητας, του περιορισμού του σιδήρου, της συσσώρευσης φωσφορικής γλυκόζης, του pH και του οξυγόνου. Όλες αυτές οι μελέτες επικεντρώθηκαν μόνο στην κατανόηση της μοριακής απόκρισης του sRNA στο στρες, αλλά όχι στις πιθανές φυσιολογικές επιπτώσεις του χειρισμού της έκφρασης αυτών των sRNA. Οι πληροφορίες που είναι προς το παρόν γνωστές συνοψίζονται στον Πίνακα 1.

Θερμοκρασία

Δύο sRNA, τα MicC και MicF, ταυτοποιήθηκαν ότι εμπλέκονται στη ρύθμιση της μετάφρασης και της σταθερότητας των πορινών [49]. Και τα δύο βρέθηκαν να σχετίζονται με την απόκριση στις αλλαγές θερμοκρασίας. Το MicC εκφράστηκε σε χαμηλή θερμοκρασία (24°C) και αναγνωρίστηκε με ανάπτυξη Ε. coli K-12 (JM109) σε ελάχιστα μέσα LB και σε M9-γλυκερόλη σε διαφορετικές θερμοκρασίες σε σταθερές και εκθετικές φάσεις έως OD600 0,2 ή 0,4 [25]. Το MicF βρέθηκε να εκφράζεται σε υψηλότερες θερμοκρασίες (37 ή 42 °C) και αναγνωρίστηκε με ανάπτυξη Ε. coli K-12 JA221 ολονύκτια σε OD550 0,2 που ακολουθήθηκε από αύξηση της θερμοκρασίας ανάπτυξης στους 37 °C με προσθήκη ίσου όγκου μέσου στους 50 °C [32]. Ένα άλλο sRNA που ανταποκρίνεται στην αλλαγή θερμοκρασίας είναι το DsrA, αυτό το sRNA βρέθηκε ότι προκαλείται μι. coli Καλλιέργειες Κ-12 που αναπτύχθηκαν σε μέσο LB στους 24 °C σε OD600 από 0,4–0,6 [27]. Το DsrA είναι ένα sRNA που ρυθμίζει rpoS και hns mRNA [29]. Αυτό το sRNA αλληλεπιδρά με το mRNA του μεταγραφικού ρυθμιστή σ S (κωδικοποιείται από rpoS) και τον μεταγραφικό καταστολέα H-NS [50], ενεργοποιεί τη μετάφραση RpoS και αναστέλλει hns μετάφραση [29, 30].

Οσμωτικότητα

Το sRNA MicF, εκτός από την απόκρισή του στην αλλαγή θερμοκρασίας, έχει επίσης συσχετιστεί με συνθήκες υψηλής ωσμωτικότητας που δημιουργούνται με την προσθήκη 20% σακχαρόζης στα μέσα ανάπτυξης. Η έκφραση MicF αυξήθηκε όταν Ε. coli Το K-12 αναπτύχθηκε σε LB, μέσο χαμηλής περιεκτικότητας σε φωσφορικά, ή σε θρεπτικό ζωμό ή σε θρεπτικό μέσο Μ9 συμπληρωμένο με 0,4% γλυκόζη, η έκφραση του MicF αυξήθηκε όταν η καλλιέργεια εκτέθηκε σε συνθήκες υψηλής ωσμωτικότητας [26].

Ένα άλλο sRNA που ανταποκρίνεται σε αλλαγές στην οσμωτικότητα είναι το RprA, ένα sRNA 105nt που ενεργοποιεί τη μετάφραση RpoS όταν τα βακτήρια εκτίθενται σε οσμωτικό σοκ [33, 34]. Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν με καλλιέργεια Ε. coli K-12 (MG1655) σε LB σε στατική φάση (OD600 = 3,5) και την προσθήκη 0,12, 0,23, 0,46 ή 1,0 Μ σακχαρόζης για 20 λεπτά [34]. Η έκφραση RprA έχει επίσης προκληθεί από οσμωτικό σοκ σε ένα Ε. coli Κ-12 MC1061 στέλεχος που αναπτύχθηκε σε LB σε OD600 0,3 με προσθήκη 0,46 Μ σακχαρόζης [33].

Συγκέντρωση σιδήρου

Η μεταγραφή του RyhB, ενός sRNA 90 nt, βρέθηκε ότι σχετίζεται με τη διαθεσιμότητα σιδήρου στα μέσα. Το RyhB συνήθως καταστέλλεται σε συνθήκες πλούσιες σε σίδηρο [51] και εκφράζεται όταν η συγκέντρωση σιδήρου είναι χαμηλή, μειώνοντας έτσι την κατανάλωση σιδήρου μειώνοντας την έκφραση των πρωτεϊνών που περιέχουν σίδηρο και, ως αποτέλεσμα, αυξάνοντας τη συγκέντρωση του ελεύθερου ενδοκυτταρικού Fe 3+ [51, 52]. Αυτό μελετήθηκε με τη χρήση παραγώγων του Ε. coli K-12 MG1655 που αναπτύχθηκαν σε μέσα M63 συμπληρωμένα με 1 μM FeSO4 [52]. Άλλες μελέτες για την πρόσβαση στην επίδραση της υψηλής συγκέντρωσης σιδήρου διεξήχθησαν με καλλιέργεια Ε. coli K-12 MG1655 σε OD600 = 0,3 σε μέσα LB ή M63 συμπληρωμένα με 0,2% γλυκερόλη σε 50 μM FeSO4 [35]. Αυτά έδειξαν ότι η αυξημένη έκφραση RyhB πυροδότησε μειωμένη έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με τον κύκλο TCA και την αναπνευστική αλυσίδα όπως π. acnA (ακονιτάση), sdhCDAB (ηλεκτρική αφυδρογονάση), sodB (υπεροξειδική δισμουτάση), φούμιΑ (φουμαράση) και φερριτίνες bfr και ftnA [35, 36].

Το sRNA GadY έχει συνδεθεί με αυξημένη έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την απόκριση σε όξινες συνθήκες. Υπάρχουν τρία είδη του sRNA GadY: το πλήρους μήκους GadY στους 105 nt και δύο επεξεργασμένες μορφές στα 90 και 59 nt αντίστοιχα, όλα ανιχνεύονται όταν Ε. coli K-12 MC4100 και Ε. coli Το K-12 MG1655 αναπτύχθηκε σε αναδευόμενες φιάλες σε LB σε pH 5,8 [45]. Σε ένα διαφορετικό πείραμα, το GadY και οι επεξεργασμένες μορφές του εντοπίστηκαν στο Ε. coli αυξήθηκε σε OD600 2,0 σε μέσο LB-MES ρυθμισμένο σε ρΗ 5,5 με 100 mM 2- (Ν-μορφολινο) αιθανοσουλφονικό οξύ (MES) [46].

Η υπερέκφραση του GadY συσχετίστηκε με την ενεργοποίηση των γονιδίων αντίστασης σε οξύ gadA, gadB, και gadC (μέρος του συστήματος GDS-γλουταμινικής αποκαρβοξυλάσης), το οποίο με τη σειρά του ενεργοποίησε το GadX mRNA, προκαλώντας την έκφραση του GDS [45, 53, 54]. Το GadY βρέθηκε επίσης ότι ενεργοποιεί το σύστημα αποκαρβοξυλάσης της λυσίνης (LDS) σε pH 5,8 [55]. Δύο άλλα sRNAs RprA και DsrA έχουν συσχετιστεί με αντίσταση στα οξέα [47]. Τα RprA και DsrA εκφράστηκαν όταν Ε. coli Κύτταρα K-12 MG1655 αναπτύχθηκαν σε μέσα Μ9 συμπληρωμένα με 0,4% γλυκόζη. Η καλλιέργεια αραιώθηκε 1:10 ή 1:100 με Μ9 ελάχιστο μέσο συμπληρωμένο με 0,4% γλυκόζη και 1,5 mmol/L γλουταμικό, το οποίο ρυθμίστηκε σε pH 2,0 ή 3,0 με πυκνό HCl [47]. Το RprA επάγει την έκφραση του rpoS που προστατεύει από την αντίσταση στα οξέα [47]. Η υπερέκφραση του DsrA επάγει rpoS παρόμοια με το RprA sRNA [48].

Μεταφορά γλυκόζης και συσσώρευση φωσφορικής γλυκόζης

Η έκφραση του μεταφορέα γλυκόζης ptsG βρέθηκε ότι ρυθμίζεται σε μεταμεταγραφικό επίπεδο από το sRNA 227 nt SgrS που δεσμεύεται στο mRNA ptsG [40, 56]. Η επίδραση του SgrS παρατηρήθηκε όταν Ε. coli Το K-12 (MG1655) αναπτύχθηκε σε τρυβλία άγαρ ελάχιστου μέσου M63 συμπληρωμένα με 0,2% γλυκόζη και σε υγρό μέσο LB συμπληρωμένο με 1% γλυκόζη ή τη μη μεταβολισμένη γλυκόζη άλφα μεθυλγλυκοσίδη (αMG) [40, 57]. Διαπιστώθηκε ότι το SgrS εκφράζεται ως απόκριση στη συσσώρευση της 6-φωσφορικής γλυκόζης, αναστέλλοντας τη μετάφραση του ptsG mRNA, και ως αποτέλεσμα προκαλεί μείωση του μεταφορέα γλυκόζης IICB Glc και εισόδου γλυκόζης στα κύτταρα [58,59,60,61]. Το SgrS κωδικοποιεί επίσης το πολυπεπτίδιο SgrT 43 αμινοξέων που ρυθμίζει τη δραστηριότητα των προϋπαρχόντων μεταφορέων IICB Glc [41]. Αυτό το πολυπεπτίδιο σώζει κύτταρα που αναπτύσσονται παρουσία αΜG μειώνοντας τη μεταφορά γλυκόζης ανεξάρτητα από την αποικοδόμηση του mRNA [41, 62]. Άλλα sRNA που σχετίζονται με το μεταβολισμό του άνθρακα είναι το CyaR και το Spot42. Το CyaR ένα sRNA 87 nt, επάγεται σε χαμηλές συγκεντρώσεις γλυκόζης και ρυθμίζεται θετικά από τον παγκόσμιο ρυθμιστή Crp [42]. Αυτό μελετήθηκε με την ανάπτυξη Ε. coli σε φιάλη ανακίνησης ή πλάκες άγαρ που περιέχουν ζωμό Lennox ή ελάχιστο μέσο M63 συμπληρωμένο με 0,001% βιταμίνη Β1 και 0,2% γλυκόζη ή γλυκερίνη [42]. Η υπερέκφραση του CyaR μείωσε τουλάχιστον 25 επιπλέον γονίδια, υπεύθυνα για την έκφραση πρωτεϊνών της μεμβράνης, μεταφορέων και βασικών ενζύμων για την προσαρμογή των κυττάρων σε συνθήκες χαμηλής γλυκόζης [42]. Το Spot42 είναι ένα εξαρτώμενο από 109 nt Hfq sRNA που καταστέλλει γονίδια που εμπλέκονται στον κεντρικό και δευτερογενή μεταβολισμό, την εξισορρόπηση της οξειδοαναγωγής και την κατανάλωση διαφόρων μη προτιμώμενων πηγών άνθρακα με αποτέλεσμα την αργή ανάπτυξη [63]. Οι παραπάνω πληροφορίες ελήφθησαν με ανάπτυξη Ε. coli K-12 σε μέσα LB ή M9 συμπληρωμένο με 10 μg/mL θειαμίνης, 2 mM MgSO40,1 mM CaCl2και 0,2% καζαμινοξέα και διαφορετικές πηγές άνθρακα [63].

Οξυγόνο

Το sRNA OxyS, επάγεται ως απόκριση στην αυξημένη έκφραση του ρυθμιστή OxyR που πυροδοτήθηκε από την έκθεση Ε. coli Κ-12, που αναπτύχθηκε σε μέσο LB σε OD600 = 0,2, έως H2Ο2 [37]. Το OxyS δρα μετα-μεταγραφικά αναστέλλοντας το rpoS και ρυθμίζοντας την έκφραση της FhlA (ενεργοποιητής υδρογονολυάσης μορφής) που προστατεύει τα κύτταρα από μεταλλαξιογένεση [37, 64, 65].

Οι υψηλές συγκεντρώσεις οξυγόνου προκαλούν κυτταρική βλάβη επηρεάζοντας τα ένζυμα, τις πρωτεΐνες και το DNA μέσω του σχηματισμού αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS). Ε. coli προστατεύεται από το οξειδωτικό στρες ενεργοποιώντας τους ρυθμιστές SoxRS και OxyR [66, 67]. Πότε Ε. coli Το K-12, που αναπτύσσεται σε LB ή σε καθορισμένα μέσα, εκτίθεται σε υπεροξείδιο ή φάρμακα που ανακυκλώνουν οξειδοαναγωγικό οξύ, το ρυθμιστικό SoxR ενεργοποιεί soxS γονίδιο που δρα ως παράγοντας μεταγραφής, επάγοντας την έκφραση αρκετών γονιδίων από το ρυθμιστικό SoxRS. Μερικά από τα γονίδια που ενεργοποιούνται από την πρωτεΐνη SoxS είναι σόδα, acnA, fumC, micF, και zwf, αντικαθιστώντας τα ευαίσθητα ένζυμα όπως η ακονιτάση Β και οι φουμαράσες Α και Β με ανθεκτικά στο οξυγόνο ισοένζυμα ακονιτάση Α και φουμαράση C [68, 69].


Προετοιμασία Μέσων/Μέσου καλλιέργειας

Παρασκευή καλλιεργητικού μέσου | Συγγραφέας εικόνας: SouravBio (microbiologynote.com)

Στο εμπόριο όλα τα μέσα διατίθενται σε μορφή σκόνης. Η παρασκευή του μέσου καλλιέργειας ή των βακτηριολογικών μέσων μπορεί να γίνει με αυτά τα ακόλουθα βήματα

  1. Διαλύονται τα επιθυμητά συστατικά ή το πλήρες αφυδατωμένο μέσο σε κατάλληλο όγκο απεσταγμένου νερού.
  2. Στη συνέχεια, προσδιορίστε το pH του μέσου χρησιμοποιώντας ένα pHόμετρο και ρυθμίστε το εάν χρειάζεται.
  3. Προσθέστε άγαρ σε αυτό το μέσο και βράστε το για να διαλυθεί το άγαρ σε περίπτωση που απαιτείται στερεό μέσο.
  4. Στη συνέχεια διανείμετε το μέσο σε σωλήνες ή φιάλες.
  5. Μετά από αυτό τα αποστειρώθηκαν χρησιμοποιώντας αυτόκλειστο. Ορισμένα θερμικά ασταθή μέσα ή συγκεκριμένα συστατικά αποστειρώνονται με διήθηση.

Ο Πίνακας 2 δείχνει τα χαρακτηριστικά αποικίας οποιουδήποτε και Β σε σταθερό μέσο

Από τα πειραματικά αποτελέσματα, οι βακτηριακές αποικίες από το Α ήταν σχεδιασμένες με πόλους, αρνητικές κατά gram και είχαν απομονωμένο είδος διάταξης όταν παρατηρήθηκαν στο μικροσκόπιο. Απολαμβάνοντας τα χαρακτηριστικά της αποικίας, οι αποικίες από το Α εμφανίστηκαν στρογγυλές, άχρωμες, ημιδιαφανείς, ανασηκωμένες, λείες και διέθεταν αποικία μεγαλύτερου μεγέθους. Επιπλέον, η κορυφή της αποικίας Α ήταν επίπεδη και είχε ολόκληρα άκρα. Επομένως, κρίνοντας από τα χαρακτηριστικά της αποικίας, τη μορφολογία και τη φύση Gram των βακτηρίων, τα βακτήρια από την αποικία Α θα μπορούσαν να είναι E. coli. Από την άλλη πλευρά, οι αποικίες βακτηρίων από το Β ήταν θετικές κατά Gram, χυτευμένες σε κόκκους και είχαν σχηματοποιημένες ομάδες που μοιάζουν με σταφύλια. Οι αποικίες από το Β ήταν στρογγυλές, υπόλευκες, αδιαφανείς, κυρτές, κοκκώδεις και διακεκομμένες σε μέγεθος. Έτσι, οι αποικίες βακτηρίων από το Β ήταν πιθανώς S. epidermidis.

Όνομα: Wei Xiao Yang


Φαινοτυπικές Αλλαγές που εκτίθενται από Ε. coli Καλλιεργημένο στο Διάστημα

Τα βακτήρια θα συνοδεύουν τους ανθρώπους στην εξερεύνηση του διαστήματος, καθιστώντας σημαντική τη μελέτη της προσαρμογής τους στο περιβάλλον μικροβαρύτητας. Για τη διερεύνηση πιθανών φαινοτυπικών αλλαγών για βακτήρια που αναπτύσσονται στο διάστημα, Escherichia coli καλλιεργήθηκε στον Διεθνή Διαστημικό Σταθμό με ταιριαστά χειριστήρια στη Γη. Τα δείγματα προκλήθηκαν με διαφορετικές συγκεντρώσεις θειικής γενταμυκίνης για να μελετηθεί ο ρόλος της συγκέντρωσης του φαρμάκου στις εξαρτώμενες μεταβλητές στο διαστημικό περιβάλλον. Οι αναλύσεις περιελάμβαναν εκτιμήσεις του τελικού αριθμού κυττάρων, του μεγέθους των κυττάρων, του πάχους του κυτταρικού φακέλου, της υπερδομής των κυττάρων και της μορφολογίας της καλλιέργειας. Παρατηρήθηκε 13-πλάσια αύξηση στον τελικό αριθμό κυττάρων στο διάστημα σε σχέση με τους ελέγχους εδάφους και τα κύτταρα διαστημικής πτήσης μπόρεσαν να αναπτυχθούν παρουσία κανονικά ανασταλτικών επιπέδων θειικής γενταμυκίνης. Το μικροσκόπιο φωτός αντίθεσης και το μικροσκόπιο εστιασμένης δέσμης ιόντων/ηλεκτρονίου σάρωσης έδειξαν ότι, κατά μέσο όρο, τα κύτταρα στο διάστημα ήταν το 37% του όγκου των αντίστοιχων μαρτύρων τους, γεγονός που μπορεί να αλλάξει τον ρυθμό αλληλεπιδράσεων μορίου-κυττάρου σε ένα καθεστώς μεταφοράς μάζας περιορισμένης διάχυσης. αναμένεται να συμβεί στη μικροβαρύτητα. Οι εικόνες TEM έδειξαν αύξηση στο πάχος του φακέλου κυψέλης μεταξύ 25 και 43% στο διάστημα σε σχέση με την ομάδα ελέγχου της Γης. Τα κυστίδια της εξωτερικής μεμβράνης παρατηρήθηκαν στα δείγματα των διαστημικών πτήσεων, αλλά όχι στις καλλιέργειες της Γης. Ενώ Ε. coli Οι καλλιέργειες αιωρήματος στη Γη κατανεμήθηκαν ομοιογενώς σε όλο το υγρό μέσο, ​​στο διάστημα έτειναν να σχηματίσουν ένα σύμπλεγμα, αφήνοντας το περιβάλλον μέσο ορατά καθαρό από κύτταρα. Αυτή η συμπεριφορά συσσωμάτωσης κυττάρων μπορεί να σχετίζεται με ενισχυμένο σχηματισμό βιοφίλμ που παρατηρείται σε άλλα πειράματα διαστημικών πτήσεων.

Λέξεις-κλειδιά: συσσωμάτωση βακτηριακή ανάπτυξη βιοαστροναυτική κυτταρικό φάκελο μέγεθος κυττάρου κυστίδιο μικροβαρύτητας.

Φιγούρες

Ο αστροναύτης της NASA Rick Mastracchio εμφανίζεται…

Ο αστροναύτης της NASA Rick Mastracchio εμφανίζεται να κρατά ένα GAP στο δεξί του χέρι και…

Στο διάστημα, Ε. coli κύτταρα…

Στο διάστημα, Ε. Coli Τα κύτταρα είχαν 59% μήκος, 83% διάμετρο και…

Εστιασμένη δέσμη ιόντων/ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης…

Εικόνα εστιασμένης δέσμης ιόντων/ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης (FIB/SEM) δειγμάτων που προκλήθηκαν με 25 μg/mL…

Στο διάστημα, το πάχος του φακέλου των κυττάρων…

Στο διάστημα, το πάχος του περιβλήματος των κυττάρων αυξήθηκε κατά 25 και 43% στα 25…

Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης λεπτής τομής (TEM)…

Εικόνες με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης λεπτής τομής (TEM). Ε. coli . Αριστερά : δείγμα…

Εικόνες αντίθεσης φάσης του ΜΙ.…

Εικόνες αντίθεσης φάσης του Ε. coli καλλιεργείται στη Γη (επάνω εικόνα) και σε…


Αποτελέσματα

Η υπερέκφραση επτά διαφορετικών γονιδίων αποκαθιστά την ανάπτυξη ενός στελέχους Ε. coli έλλειψη PdxB σε M9/γλυκόζη

Το PdxB καταλύει το δεύτερο βήμα στο μονοπάτι σύνθεσης PLP (Εικόνα 1). Ένα στέλεχος στο οποίο pdxB διαγράφεται δεν μπορεί να αναπτυχθεί σε ελάχιστο μέσο στους 37°C γιατί δεν μπορεί να συνθέσει PLP. Ωστόσο, μπορεί να αναπτυχθεί αργά στους 30°C, υποδηλώνοντας ότι αρκετό PLP μπορεί να συντεθεί με διαφορετική οδό για να επιτρέψει την αργή ανάπτυξη (Lam and Winkler, 1990). Πραγματοποιήσαμε μια οθόνη καταστολής πολλαπλών αντιγράφων με σκοπό να εντοπίσουμε ένζυμα για τα οποία η υπερπαραγωγή παρέχει επαρκή ακατάλληλη δραστηριότητα αφυδρογονάσης 4PE για να αντικαταστήσει το PdxB. Μια βιβλιοθήκη εκφράσεων που περιέχει 3276 ORF από Ε. coli αλλά λείπει pdxB συναρμολογήθηκε χρησιμοποιώντας πλασμίδια που απομονώθηκαν από κλώνους στη συλλογή ASKA (Kitagawa et al, 2005 ) και εισάγεται σε ΔpdxBκαν στέλεχος (στο εξής θα αναφέρεται ως το ΔpdxB ένταση). Πλασμίδια από 28 αποικίες που αναπτύχθηκαν σε Μ9/γλυκόζη ανακτήθηκαν και το ORF που μεταφέρθηκε από καθεμία ταυτοποιήθηκε με αλληλούχιση. Αξιοσημείωτα, βρήκαμε ότι η υπερέκφραση επτά διαφορετικών γονιδίων αποκατέστησε την ανάπτυξη του ΔpdxB στέλεχος σε Μ9/γλυκόζη (βλέπε Πίνακα Ι, Συμπληρωματικό Σχήμα 1 και Συμπληρωματικό Πίνακα II). (Καθώς τρία από τα επτά γονίδια βρέθηκαν μόνο μία φορά, είναι πιθανό ότι ο πληθυσμός υποβλήθηκε σε υποδειγματοληψία και ότι πρέπει να ανακαλυφθούν επιπλέον γονίδια που αποκαθιστούν την ανάπτυξη.) Τρία από τα επτά γονίδια (hisB, php και yjbQ) επιτρέπουν την ανάπτυξη τόσο σε υγρό όσο και σε στερεό μέσο, ​​ενώ οι άλλες επιτρέπουν την ανάπτυξη μόνο σε στερεό μέσο.

Πρωτεΐνη Λειτουργία
PdxA Αφυδρογονάση/αποκαρβοξυλάση φωσφοϋδροξυθρεονίνης
AroB Δεϋδροκινική συνθάση
ThrB Ομοσερινική κινάση
YeaB a a Επίσης γνωστό ως NudL.
Προβλεπόμενη υδρολάση NUDIX
HisB Αφυδατάση ιμιδαζόλη-γλυκερόλη-φωσφορική/ιστιδινόλη φωσφατάση
Php Προβλεπόμενη μεταλλοϋδρολάση
YjbQ Αγνωστος

Μόνο δύο από τα επτά γονίδια που συμπληρώνουν το ΔpdxB στέλεχος κωδικοποιεί ένζυμα που έχουν δραστηριότητα αφυδρογονάσης. Η αφυδρογονάση της 4-υδροξυ-L-θρεονίνης (4ΗΤ) (PdxA) καταλύει μια αντίδραση αφυδρογόνωσης κατάντη της αντίδρασης που καταλύεται από το PdxB. Η δεϋδροκινική συνθάση (AroB) καταλύει μια πολύπλοκη αντίδραση στην οποία το στενά συνδεδεμένο NAD + ανάγεται και στη συνέχεια οξειδώνεται κατά τη διάρκεια της μετατροπής πολλαπλών σταδίων του 7-φωσφορικού 3-δεοξυ-D-αραβινο-επτουλοζονικού οξέος σε αφυδροκινικό ( Carpenter et al, 1998). Τέσσερα από τα πέντε εναπομείναντα ένζυμα είναι γνωστό ή προβλέπεται ότι καταλύουν αφυδάτωση, μεταφορά φωσφορυλίου ή υδρολυτικές αντιδράσεις. Το YjbQ παρουσιάζει δραστικότητα συνθάσης φωσφορικής θειαμίνης χαμηλού επιπέδου ( Morett et al, 2008), αν και δεν πιστεύεται ότι είναι αυτή η φυσιολογική του λειτουργία.

Δοκιμασίες για τη δράση της αφυδρογονάσης 4PE στα επτά διαφορετικά ένζυμα που, όταν υπερπαραχθούν, αποκαθιστούν την ανάπτυξη του ΔpdxB στέλεχος της γλυκόζης

Η δημιουργία ενός υψηλού επιπέδου ενός ενζύμου με ακατάλληλη δράση αφυδρογονάσης 4PE είναι ο πιο προφανής μηχανισμός με τον οποίο η υπερέκφραση ενός γονιδίου μπορεί να συμπληρώσει το ΔpdxB ένταση. Ωστόσο, τα ThrB, YeaB, HisB και Php δεν παρουσίασαν οξείδωση του 4PE ακόμη και μετά από παρατεταμένη επώαση. Το YjbQ δεν μπορούσε να προσδιοριστεί επειδή ήταν δύσκολο να ληφθεί διαλυτή πρωτεΐνη.

Το PdxA οξειδώνει το 4PE αργά, με α κΓάτα από 0,020±0,002 s −1 , α κΜ των 150±13 μM και α κΓάτα/κΜ 138±19 M −1 s −1, όπως μετράται με την ακόλουθη μείωση του NAD + . Το PdxB οξειδώνει το 4PE στο C-2. Περιμέναμε ότι το PdxA θα οξειδώσει το 4PE στο C-3 και όχι το C-2, με βάση τη σύγκριση των δομών της 4PE και της 4-φωσφοροϋδροξυθρεονίνης (4PHT), το κανονικό υπόστρωμα για το PdxA (Εικόνα 2Α και Β). Καθώς η αντίδραση είναι θερμοδυναμικά ανηφορική και το προϊόν δεν συσσωρεύεται σε επαρκείς συγκεντρώσεις για χαρακτηρισμό με NMR, προσδιορίσαμε τη θέση της οξείδωσης έμμεσα εξισορροπώντας το 4PE με NAD + παρουσία PdxA και περίσσεια [4R-2H]NADH ή [4S - 2 H]NADH. Η εμφάνιση δευτερίου σε 4ΡΕ λόγω μεταφοράς δευτεριδίου στο προϊόν στην αντίστροφη αντίδραση (βλ. Σχήμα 1) επέτρεψε την αναγνώριση της θέσης οξείδωσης. Μετά την επώαση του 4PE με [4R-2 H]NADH και PdxA, το σήμα που οφείλεται στο πρωτόνιο C-3 του 4PE μειώνεται και τα σήματα λόγω των πρωτονίων C-2 και C-4 αλλάζουν επειδή δεν διασπώνται πλέον από ένα πρωτόνιο στο C-3 (Εικόνα 2Ε). Κανένα από τα σήματα δεν μεταβάλλεται παρουσία NADH (Εικόνα 2D) ή [4S-2 H]NADH (Εικόνα 2F). Έτσι, η οξείδωση του 4PE συμβαίνει στο C-3 και όχι στο C-2, και επομένως αυτή η δραστηριότητα του PdxA δεν μπορεί να υποκαταστήσει τη δραστηριότητα του PdxB.

Το AroB οξειδώνει επίσης το 4PE, αλλά πραγματοποιεί μόνο έναν κύκλο εργασιών (τα δεδομένα δεν φαίνονται). Αυτό δεν προκαλεί έκπληξη κατά τη διάρκεια του κανονικού καταλυτικού κύκλου του AroB, το στενά συνδεδεμένο NAD + μειώνεται σε NADH. Μετά την απομάκρυνση του φωσφορικού από το οξειδωμένο ενδιάμεσο, το NADH μεταφέρει υδρίδιο πίσω στο υπόστρωμα, αναγεννώντας το NAD + στην ενεργό θέση ( Carpenter et al, 1998). Η οξείδωση του 4PE θα μείωνε το στενά συνδεδεμένο NAD +, αλλά δεν θα πρόσφερε μια ευκαιρία για επανοξείδωση και θα αδρανοποιούσε το ένζυμο. Δεν μπορούμε να προσδιορίσουμε τη θέση στην οποία το 4PE οξειδώνεται από το AroB χρησιμοποιώντας την προσέγγιση που περιγράφηκε παραπάνω επειδή το NADH δεν απελευθερώνεται από το ένζυμο και δεν μπορεί να αντικατασταθεί με NAD 2 H. Ωστόσο, αυτή η δραστηριότητα πιθανώς δεν είναι φυσιολογικά σχετική γενετικά πειράματα που θα περιγραφούν παρακάτω προτείνουν ότι η συμπλήρωση του ΔpdxB στέλεχος με υπερέκφραση του aroB δεν οφείλεται στην ικανότητά του να οξειδώνει 4PE.

Αυτά τα αποτελέσματα υποδηλώνουν ότι η αποκατάσταση της ανάπτυξης στο ΔpdxB Το στέλεχος όταν τα ThrB, YeaB, HisB, Php ή PdxA (και πιθανώς το AroB) υπερπαράγεται δεν μπορεί να αποδοθεί σε αντικατάσταση της δραστηριότητας του PdxB. Κατά συνέπεια, διερευνήσαμε την πιθανότητα η υπερπαραγωγή αυτών των ενζύμων να διευκολύνει ένα ή περισσότερα μονοπάτια που επιτρέπουν τη σύνθεση του PLP απουσία PdxB.

Τρεις ανώμαλες οδοί αποκαλύπτονται από προσπάθειες συμπλήρωσης στελεχών που δεν έχουν άλλα γονίδια στο μονοπάτι σύνθεσης PLP

Πειράματα καταστολής πολλαπλών αντιγράφων που χρησιμοποιούν στελέχη που δεν έχουν άλλα γονίδια στο μονοπάτι σύνθεσης PLP διεξήχθησαν για να προσδιοριστεί πού τροφοδοτούνται οι παθολογικές οδοί που διευκολύνονται από τα ένζυμα που αναφέρονται στον Πίνακα Ι στην κανονική οδό σύνθεσης PLP. Γενικά, τα στελέχη που στερούνται ενζύμων ανάντη του σημείου τομής θα πρέπει να αναπτύσσονται όταν λειτουργεί μια ανώμαλη οδός, αλλά τα στελέχη που δεν έχουν ένζυμα κατάντη του σημείου τομής δεν θα πρέπει. Αυτά τα πειράματα ήταν απλά για τα περισσότερα από τα στελέχη, αλλά ήταν πολύπλοκα από τις απαιτήσεις ανάπτυξης του ΔserCκαν στέλεχος (στο εξής θα αναφέρεται ως το ΔserC ένταση). Το SerC απαιτείται για τη σύνθεση τόσο του PLP όσο και της σερίνης. Επιπλέον, διαγραφή του serC μειώνει την έκφραση του αροΑ, το οποίο κωδικοποιείται από το ίδιο οπερόνιο (Duncan and Coggins, 1986). Κατά συνέπεια, το ΔserC Το στέλεχος απαιτεί προσθήκη σερίνης, πυριδοξίνης και προϊόντων της οδού σικιμικού (Lam and Winkler, 1990) για να αναπτυχθεί σε ελάχιστο μέσο. Για να εξεταστεί η ικανότητα των παθογόνων μονοπατιών να παράγουν PLP στο ΔserC στέλεχος, προσθέσαμε όλα αυτά τα συμπληρώματα εκτός από την πυριδοξίνη. Ως έλεγχος, εξετάσαμε την επίδραση αυτών των συμπληρωμάτων στη συμπλήρωση του ΔpdxB ένταση. Τα συμπληρώματα δεν έχουν καμία επίδραση στη συμπλήρωση του ΔpdxB με pdxB, hisB, yjbQ και php (Πίνακας II). hisB, php και yjbQ αποτυγχάνουν να συμπληρώσουν τα στελέχη που λείπουν serC, pdxA, pdxJ ή pdxH (Πίνακας II), υποδηλώνοντας ότι η οδός 2 σχηματίζει 2-οξο-3-υδροξυ-4-φωσφοβουτανοϊκό (OHPB) (Εικόνα 1). Ωστόσο, τα συμπληρώματα αναστέλλουν την ικανότητα του thrB, ναιΒ, pdxA και aroB για να συμπληρώσει το ΔpdxB ένταση. Αυτή η επίδραση βρέθηκε ότι οφείλεται αποκλειστικά στην παρουσία σερίνης (Συμπληρωματικός Πίνακας III). Μια πιθανή εξήγηση είναι ότι οι οδοί που διευκολύνονται από την υπερέκφραση αυτών των γονιδίων ξεκινούν με ενδιάμεσα στη βιοσύνθεση σερίνης που εξαντλούνται παρουσία σερίνης λόγω αλλοστερικής αναστολής του SerA, η οποία καταλύει το πρώτο βήμα στη βιοσύνθεση σερίνης ( Grant et al, 1996). Ωστόσο, η προσθήκη σερίνης έχει πλειοτροπικά αποτελέσματα (Hama et al, 1990 , 1991 Επιχορήγηση et al, 1996), οπότε σε αυτό το σημείο επιλέγουμε να χρησιμοποιήσουμε αυτόν τον φαινότυπο απλώς ως χαρακτηριστικό που κάνει διάκριση μεταξύ διαφορετικών παθογόνων μονοπατιών.

Γονίδιο ΔpdxB (JU283) ΔpdxB (JU283)+suppl. ένα L-Ser (1,0 mM), L-Phe (0,1 mM), L-Tyr (0,1 mM), L-Trp (0,1 mM), Π-υδροξυβενζοϊκό (1 μΜ), Π-αμινοβενζοϊκό (1 μΜ) και 2,3-διυδροξυβενζοϊκό (1 μΜ).
ΔserC (JWK0890)+παρ. ένα L-Ser (1,0 mM), L-Phe (0,1 mM), L-Tyr (0,1 mM), L-Trp (0,1 mM), Π-υδροξυβενζοϊκό (1 μΜ), Π-αμινοβενζοϊκό (1 μΜ) και 2,3-διυδροξυβενζοϊκό (1 μΜ).
ΔpdxA (JWK0051) ΔpdxJ (JWK2548) ΔpdxH (JWK1630)
pdxB ++++ β β Οι αποικίες έφτασαν σε διάμετρο 1 mm σε 1–2 ημέρες (++++), 3–5 ημέρες (+++) ή 6–8 ημέρες (++). Το (+) υποδηλώνει αποικίες που ήταν o1 mm μετά από 9 ημέρες.
++++
hisB ++++ ++++
yjbQ +++ +++
php ++++ ++++
thrB ++++ +
ναιΒ +++ +
pdxA +++ ++ ++++
aroB +++ + ++
  • Οι ονομασίες στελεχών ορίζονται στον συμπληρωματικό πίνακα I.
  • ένα L-Ser (1,0 mM), L-Phe (0,1 mM), L-Tyr (0,1 mM), L-Trp (0,1 mM), Π-υδροξυβενζοϊκό (1 μΜ), Π-αμινοβενζοϊκό (1 μΜ) και 2,3-διυδροξυβενζοϊκό (1 μΜ).
  • β Οι αποικίες έφτασαν σε διάμετρο 1 mm σε 1–2 ημέρες (++++), 3–5 ημέρες (+++) ή 6–8 ημέρες (++). Το (+) υποδεικνύει αποικίες που ήταν o1 mm μετά από 9 ημέρες.

ναιΒ και thrB συμπληρώνουν το ΔpdxB στέλεχος, αλλά δεν συμπληρώνουν στελέχη που στερούνται PdxA, PdxJ ή PdxH. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η ορεινή οδός 1 τροφοδοτείται στην κανονική οδό στο επίπεδο είτε της OHPB είτε της 4-φωσφοϋδροξυθρεονίνης (4PHT). Η ασάφεια προκύπτει επειδή η σερίνη που απαιτείται για την ανάπτυξη του ΔserC Το στέλεχος παρεμβαίνει στη συμπλήρωση του ΔpdxB στέλεχος από ναιΒ και thrB. Έτσι, δεν μπορούμε να προσδιορίσουμε από αυτά τα δεδομένα εάν η οδός 1 τροφοδοτείται πριν ή μετά την αντίδραση που καταλύεται από το SerC. Ωστόσο, βιοχημικά δεδομένα (βλ. παρακάτω) υποδηλώνουν ότι η οδός 1 δημιουργεί 4PHT.

aroB συμπληρώνει το ΔpdxA στέλεχος, αλλά αποτυγχάνει να συμπληρώσει τα στελέχη που λείπουν pdxJ ή pdxH. Καθαρίσαμε το AroB από ένα στέλεχος που στερείται PdxA και προσδιορίσαμε ότι το AroB δεν έχει ανιχνεύσιμη δράση αφυδρογονάσης 4PHT (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Συνεπώς, συμπλήρωση του ΔpdxA στέλεχος με υπερέκφραση του aroB δεν οφείλεται απλώς στην αντικατάσταση της δραστηριότητας του PdxA. Αυτά τα δεδομένα υποδηλώνουν ότι η οδός 3 σχηματίζει 1-αμινο-προπαν-2-ον-3-φωσφορικό.

Προσδιορισμός ενζύμων που μπορούν να καταλύουν αντιδράσεις στο μονοπάτι 1

Μια πιθανή αλληλουχία αντιδράσεων για την οδό 1 προτείνεται από τις παρατηρήσεις ότι η προσθήκη 3-υδροξυπυροσταφυλικού (3HP) (Shimizu and Dempsey, 1978), γλυκολαλδεΰδης (Tani and Dempsey, 1973) ή 4HT (Drewke et al, 1993) μπορεί να υποστηρίξει την ανάπτυξη ορισμένων Ε. coli μεταλλαγμένα που δεν έχουν την ικανότητα να παράγουν PLP. Πειράματα ισοτοπικής σήμανσης επιβεβαίωσαν ότι άτομα άνθρακα από γλυκολαλδεΰδη (Hill and Spenser, 1973 Hill et al, 1977), γλυκίνη (Hill et al, 1987) και 4HT (Hill et al, 1996) και άτομα αζώτου από γλυκίνη (Hill et al, 1987) ενσωματώθηκαν στην πυριδοξόλη. Για κάποιο χρονικό διάστημα, αυτές οι ενώσεις θεωρήθηκαν ως πιθανά ενδιάμεσα στην οδό σύνθεσης PLP (Shimizu and Dempsey, 1978 Duncan and Coggins, 1986), αν και τελικά η οδός που φαίνεται στο Σχήμα 1 επεξεργάστηκε. Επιβεβαιώσαμε ότι το Δ μαςpdxB Το στέλεχος αναπτύσσεται σε Μ9/γλυκόζη στους 37°C παρουσία 3ΗΡ, γλυκολαλδεΰδης και 4ΗΤ. Το στέλεχος μας αναπτύσσεται επίσης παρουσία 3PHP, ενός ενδιάμεσου στη βιοσύνθεση σερίνης (Συμπληρωματικός Πίνακας IV).

Το πρώτο βήμα της προτεινόμενης οδού 1 είναι η αποφωσφορυλίωση της 3PHP (Εικόνα 3). Ε. coli περιέχει 75 γνωστές ή προβλεπόμενες φωσφατάσες που μπορεί να καταλύσουν αυτή την αντίδραση. Μια ενδιαφέρουσα πιθανότητα προτάθηκε από την παρατήρηση ότι η υπερπαραγωγή του YeaB, μιας προβλεπόμενης υδρολάσης NUDIX, αποκαθιστά την ανάπτυξη του ΔpdxB ένταση. Οι υδρολάσες NUDIX τυπικά καταλύουν την υδρόλυση οργανικών πυροφωσφορικών (McLennan, 2006) και έτσι μπορεί να έχουν δραστικότητα φωσφατάσης χαμηλού επιπέδου. Εκφράσαμε το YeaB ως σύντηξη με πρωτεΐνη που δεσμεύει τη μαλτόζη (MalE) για να λάβουμε διαλυτή πρωτεΐνη. Η πρωτεΐνη σύντηξης MalE-YeaB έχει πράγματι δραστηριότητα φωσφατάσης 3PHP (Πίνακας III). Επειδή είχαμε περιορισμένο απόθεμα 3PHP, δεν μπορέσαμε να προσδιορίσουμε μια ακριβή κΜ για 3PHP καθώς το ένζυμο φαίνεται να είναι κορεσμένο σε 2 mM 3PHP, συμπεραίνουμε ότι το κΜ για 3PHP πρέπει να είναι <2 mM. Η δραστικότητα της φωσφατάσης 3PHP οφειλόταν στο YeaB και όχι στο MalE, καθώς μια πρωτεΐνη σύντηξης MalE-LacZ δεν έδειξε δραστηριότητα. Σημειώνουμε ότι ο μη ενζυματικός ρυθμός για τη μετατροπή του 3PHP σε 3HP είναι 7,2 × 10 −10 M −1 s −1 . Έτσι, παρόλο που το YeaB είναι ένα αναποτελεσματικό ένζυμο, αυξάνει τον ρυθμό πάνω από τον ρυθμό υποβάθρου κατά συντελεστή 4 × 10 7 .

Πρωτεΐνη Υπόστρωμα κΓάτα (s −1 ) κΜ (mM) κΓάτα/κΜ (M −1 s −1 )
Το MalE–YeaB a a YeaB εκφράστηκε ως πρωτεΐνη σύντηξης με πρωτεΐνη που δεσμεύει τη μαλτόζη (MalE) για τη βελτίωση της διαλυτότητάς της.
3PHP 5.7±0.7 × 10 −5 <2 >0,028±0,003
Dxs Pyruvate+ D-GAP bb (Kuzuyama et al, 2000).
345 0,096 (πυρουβικό) 3.6 × 10 6
0,24 ( D -GAP) 1.4 × 10 6
3 HP 0.026±0.001 0.050±0.008 5.2±0.4 × 10 2
SucA 3 HP 0.0139±0.0003 0.72±0.07 19.3±1.9
LtaE L -Ολοι- θρεονίνη 3.2±0.2 0.052±0.004 6.2±0.5 × 10 4
L-θρεονίνη 1.1±0.1 4.0±0.2 2.8±0.2 × 10 2
4HT 1.44±0.03 0.027±0.002 5.3±0.4 × 10 4
ThrB Homoserine 46±4 0.12±0.02 3.8±0.7 × 10 5
4HT 9.7±0.8 2.0±0.1 4.8±0.6 × 10 3
  • Τα υποστρώματα που εμπλέκονται στο μονοπάτι 1 επισημαίνονται με έντονη γραφή.
  • μια YeaB εκφράστηκε ως πρωτεΐνη σύντηξης με πρωτεΐνη που δεσμεύει τη μαλτόζη (MalE) για να βελτιωθεί η διαλυτότητά της.
  • β (Kuzuyama et al, 2000).

Αν και το YeaB είναι ένας αναποτελεσματικός καταλύτης για τη μετατροπή 3PHP σε 3HP, η ροή μέσω αυτού του σταδίου θα πρέπει να είναι επαρκής για την παροχή PLP. Η κυτταροπλασματική συγκέντρωση του MalB-YeaB είναι ~45 μM (με βάση την παραγωγή 4,7 mg καθαρής πρωτεΐνης από 2,2 g υγρών κυττάρων). YeaB appears to be saturated at 1 mM 3PHP, a reasonable assumption for its cytoplasmic concentration based upon the concentration of its immediate precursor, 3-phosphoglycerate, which is present at 1.5 mM in E. coli growing on glucose ( Bennett et al, 2009 ). Thus, the flux will be approximately kcat [E]=(4.8 × 10 −5 s −1 ) (45 μM)=7.8 μM h −1 ( Bennett et al, 2009 ). In the Supplementary information, we describe a calculation suggesting that the ΔpdxB strain synthesizes PLP at a rate of ∼5.5 μM h −1 when MalB–YeaB is overexpressed. Thus, the rate of conversion of 3PHP to 3HP by YeaB is comparable to the rate of synthesis of PLP.

We note that there is precedence for the ability of such an inefficient enzyme to supply sufficient flux to replace a critical metabolic enzyme. Patrick and Matsumura (2008) have shown that overexpression of a promiscuous enzyme (I198V glutamine 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate amidotransferase (PurF)) substitutes for a lack of phosphoribosylanthranilate isomerase (TrpF), which is required for tryptophan synthesis. The kcat/KM for the promiscuous TrpF activity of I198V PurF is estimated to be 0.012 M −1 s −1 ( Patrick and Matsumura, 2008 ) the kcat/KM for the 3PHP phosphatase activity of YeaB (>0.024 M −1 s −1 ) is greater than this.

If YeaB is the only enzyme that converts 3PHP to 3HP, a ΔpdxB ΔyeaB strain should not grow on minimal medium supplemented with 3PHP. However, this strain does grow slowly, producing colonies <1 mm in diameter after 9 days, on M9/glucose (Supplementary Table IV). These results suggest that at least one other enzyme can generate 3HP when 3PHP is present at high levels. As the ΔpdxB strain grows after 4 days when YeaB is overproduced, we conclude that overproduction of YeaB is the most efficient way to siphon material from the serine biosynthesis pathway into pathway 1, but YeaB is not the only enzyme that can produce 3HP from 3PHP.

3HP is proposed to be converted to glycolaldehyde in pathway 1. This conversion might occur by either of two routes. Direct decarboxylation of α-keto acids is catalyzed by enzymes that contain thiamine pyrophosphate (TPP). Alternatively, glycolaldehyde might be formed by initial isomerization of 3HP to the β-keto acid tartronate semialdehyde, followed by decarboxylation of tartronate semialdehyde. To search for enzymes in E. coli that catalyze decarboxylation of 3HP by either route, we attempted to measure acceleration of glycolaldehyde production from 3HP by crude extracts of E. coli K-12 BW25113 in the presence of NADH and alcohol dehydrogenase, which converts glycolaldehyde to ethylene glycol ( Barngrover et al, 1981 ). We were unable to detect any acceleration of the conversion of 3HP to glycolaldehyde. As we could not rule out inefficient catalysis that fails to rise significantly above the background rate, we examined the catalytic abilities of specific candidate enzymes that might convert 3HP to glycolaldehyde.

E. coli has 12 enzymes that are known or predicted to utilize TPP. We purified 10 of these: 1-deoxyxylulose-5-phosphate synthase (Dxs), pyruvate oxidase, transketolase A, transketolase B, glyoxalate carboligase and the predicted oxalyl CoA decarboxylase, as well as the TPP-dependent catalytic components of the multisubunit enzymes pyruvate dehydrogenase, α-ketoglutarate dehydrogenase and both isozymes of acetohydroxy acid synthase. YdbK and 2-succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadiene-1-carboxylate synthase (MenD) could not be expressed in soluble form. Only Dxs and SucA, the TPP-dependent catalytic component of the α-ketoglutarate dehydrogenase complex, had detectable 3HP decarboxylase activity (Table III).

To determine whether Dxs, SucA, YdbK or MenD is required for operation of pathway 1, we constructed double-knockout strains lacking pdxB and each of the genes encoding these enzymes. We also constructed a ΔpdxB Δdxs ΔsucA strain to determine whether glycolaldehyde formation is due to a combination of the activities of Dxs and SucA. Each of these strains grew on M9/glucose when YeaB or ThrB was overproduced at 37°C (data not shown). These results suggest that TPP-containing enzymes are not responsible for the formation of glycolaldehyde in pathway 1.

The E. coli genome encodes a hydroxypyruvate isomerase (Hyi) that converts 3HP to tartronate semialdehyde. This enzyme is expressed only when cells are grown on glyoxylate ( Ashiuchi and Misono, 1999 ). We ruled out the possibility that Hyi has a role in pathway 1 by constructing a ΔpdxB Δhyi strain. This strain grows on glucose when either yeaB ή thrB is overexpressed or when 3HP is supplied in the medium (data not shown).

We next considered the possibility that conversion of 3HP to glycolaldehyde in pathway 1 might be non-enzymatic. We measured the rate of formation of glycolaldehyde from 3HP by 1 H-NMR. 3HP is converted to glycolaldehyde, glycolic acid and erythrulose (by reaction with glycolaldehyde, followed by decarboxylation) (Figure 4). A control experiment showed that glycolaldehyde decomposed under these conditions to unidentified products with a first-order rate constant of 0.0062±0.0003 h −1 . The kinetic model shown below was used for numerical simulation of the rate constants for appearance of glycolaldehyde (k1=0.0153±0.0003 h −1 ), erythrulose (k2=0.0092±0.0005 mM −1 h −1 ) and glycolic acid (k3=0.0069±0.0003 h −1 ), assuming that k4=0.0062 h −1 , using DynaFit ( Kuzmič, 1996 ). Notably, addition of 0.1 mM TPP had no effect on the rate of formation of glycolaldehyde. Thus, glycolaldehyde formation must occur through the initial formation of tartronate semialdehyde. Decarboxylation of β-keto acids such as tartronate semialdehyde can be accelerated by metal ions ( Hedrick and Sallach, 1961 ). However, addition of Mg ++ or Ca ++ (1 mM) had no effect on the rate of glycolaldehyde formation. Addition of Cu ++ , Co ++ , Ni ++ , Zn ++ or Mn ++ (1 mM) actually decreased the rate of glycolaldehyde formation, while concomitantly increasing the rate of glycolate formation.

The observed rate of conversion of 3HP to glycolaldehyde appears to be sufficient to supply a significant portion of the glycolaldehyde needed for the production of PLP. We estimate that the ΔpdxB strain synthesizes PLP at a rate of 5.5 μM h −1 when yeaB is overexpressed (Supplementary information). We estimated above that the rate of production of 3HP from 3PHP should be ∼8 μM h −1 . At steady state, the rates of production and depletion of 3HP are balanced. As formation of erythrulose is negligible unless the glycolaldehyde concentration exceeds 1 mM, which is unlikely, we can calculate the steady state concentration of 3HP by assuming that the rates of formation and disappearance of 3HP are equal at the steady state. Using the relationship 8 μM h −1 =(k1+k3) [3HP]ss, we calculate that [3HP]ss is ∼360 μM. If the concentration of 3HP is 360 μM, the rate of formation of glycolaldehyde will be 5.5 μM h −1 . Glycolaldehyde will also be formed during conversion of 7,8-dihydro- D -neopterin to 6-hydroxymethyl-7,8-dihydropterin by FolB in the folate biosynthesis pathway. If folate is synthesized at a rate comparable with that of PLP, this reaction could supply glycolaldehyde at ∼5 μM h −1 . Although the amount of glycolaldehyde produced by FolB is clearly not sufficient to supply pathway 1 in the ΔpdxB strain, the combined generation of glycolaldehyde from 3HP and 7,8-dihydro- D -neopterin may well be sufficient when yeaB is overexpressed, even if some glycolaldehyde is lost by diffusion through the membrane.

The next step in pathway 1 is formation of 4HT, which is not a recognized metabolite in E. coli. 4HT can be formed by aldol condensation of glycine and glycolaldehyde ( Dempsey, 1987 ). The E. coli genome encodes an enzyme annotated as low-specificity threonine aldolase (LtaE). The physiological function of this enzyme is unknown it cleaves L -allo-threonine most efficiently among known substrates ( Liu et al, 1998 ), but L -allo-threonine is also not a recognized metabolite in E. coli. We assayed the rate of cleavage of L -allo-threonine, L -threonine and 4HT by LtaE (Table III). (The aldolase reaction is the reverse of the aldol condensation proposed in the latent pathway, but aldol condensation reactions are generally reversible.) Notably, cleavage of 4HT is nearly as efficient as cleavage of L -allo-threonine. We examined the products formed by the LtaE-catalyzed aldol condensation of glycolaldehyde and glycine by NMR (Supplementary Figure 2). The reaction forms 4HT and 4-hydroxy- L -allo-threonine (4-allo-HT) in a ratio of 1.0:0.7. (LtaE does not cleave the D -isomers of threonine and allo-threonine ( Liu et al, 1998 ), so we do not expect formation of 4-hydroxy- D -threonine and 4-hydroxy- D -allo-threonine.) These data show that LtaE catalyzes the aldol condensation of glycine and glycolaldehyde, but the stereochemistry of the reaction is not well controlled, and a substantial amount of the allo-isomer is produced. However, this does not necessarily divert material from pathway 1. As the aldol condensation is reversible and the equilibrium favors the substrates, material sequestered in 4-allo-HT will ultimately be drawn into the pathway as 4HT is converted to downstream products, as long as 4-allo-HT is not converted to any other products. The most obvious enzyme that might utilize 4-allo-HT is ThrB, which phosphorylates 4HT. However, ThrB does not phosphorylate 4-allo-HT (Supplementary Figure 3).

We confirmed that LtaE is responsible for the formation of 4HT by pathway 1 in vivo by constructing a ΔpdxB ΔltaE strain. This strain can grow on M9/glucose in the presence of pyridoxine, but does not grow when intermediates upstream of the proposed aldol condensation (3PHP, 3HP or glycolaldehyde) are supplied (Supplementary Table IV). It can, however, grow when 4HT is supplied. Furthermore, overproduction of YeaB does not complement the ΔpdxB ΔltaE strain (data not shown), confirming that LtaE and YeaB participate in the same pathway.

The last step in the proposed pathway 1 is phosphorylation of 4HT. We suspected that homoserine kinase (ThrB) might catalyze this reaction since it phosphorylates homoserine, which is structurally similar to 4HT. Furthermore, ThrB was previously shown to be required for the growth of a ΔpdxB strain on glucose at 37°C in the presence of glycolaldehyde or 4HT ( Zhao and Winkler, 1996a ). ThrB does indeed turn over 4HT, but with an efficiency nearly two orders of magnitude lower than that for homoserine (Table III). We confirmed that ThrB is responsible for phosphorylation of 4HT in vivo by constructing a ΔpdxB ΔthrB strain. This strain can grow on glucose in the presence of pyridoxine, but not when intermediates upstream of the proposed phosphorylation reaction are supplied (Supplementary Table IV).

Confirmation that pathway 1 diverts material from serine biosynthesis

We carried out two experiments to test the proposition that YeaB diverts 3PHP from serine biosynthesis into serendipitous pathway 1 in vivo. First, we generated a ΔpdxB ΔserA strain that cannot make 3PHP. Pathway 1 should not operate in this strain even if yeaB is overexpressed. As predicted, the ΔpdxB ΔserA strain cannot grow on M9/glucose supplemented with serine when yeaB is overexpressed, although it can grow when pdxB is overexpressed (see Table IV). Because addition of serine can cause inhibition of ThrA ( Hama et al, 1990 , 1991 ) and thus impair synthesis of threonine and methionine, we also assessed the growth of the ΔpdxB ΔserA strain on M9/glucose supplemented with both serine and homoserine. Under these conditions as well, the ΔpdxB ΔserA strain cannot grow when yeaB is overexpressed. These results are consistent with the hypothesis that the lack of growth is due to a lack of 3PHP, but do not rule out an additional unanticipated inhibitory effect of serine on pathway 1. To address this possibility, we constructed a ΔpdxB strain carrying an allele of serA that encodes a serine-insensitive enzyme (designated serA′) ( Grant et al, 2005 ). As SerA′ is insensitive to feedback inhibition by serine, addition of serine does not shut off flux through the serine biosynthesis pathway. Thus, we predict that this strain should grow on M9/glucose supplemented with serine and homoserine when yeaB is overexpressed if there is no other inhibitory effect of serine. Indeed, complementation of the ΔpdxB serA′ strain by yeaB is unaffected by the addition of serine and homoserine (Table IV). Together with the demonstration that YeaB catalyzes conversion of 3PHP to 3HP in vitro, these results provide strong support for the proposition that serendipitous pathway 1 diverts 3PHP from the serine biosynthesis pathway.

Supplements a a L-serine concentration was 1mM and L-homoserine concentration was 50 μM.
Strain and overexpressed gene
ΔpdxB (JU283) ΔpdxB ΔserA (JU425) ΔpdxB serA’ (JU430)
pdxB yeaB pdxB yeaB pdxB yeaB
None ++++ b b Colonies reached 1mm diameter in 1–2 days (++++), 3–5 days (+++) or 6–8 days (++). (+) indicates colonies that were o1mm after 9 days.
+++ ++++ ++
L -serine ++++ + +++ +++
L -serine+ L -homoserine ++++ + +++ ++++ ++
  • Strain designations are defined in Supplementary Table 1.
  • a L-serine concentration was 1mM and L-homoserine concentration was 50 μM.
  • b Colonies reached 1mm diameter in 1–2 days (++++), 3–5 days (+++) or 6–8 days (++). (+) indicates colonies that were o1mm after 9 days.

Complementation by PdxA depends on pathway 1

Our observation that overproduction of PdxA complements the ΔpdxB strain is curious. As described above, PdxA oxidizes 4PE at C-3 and therefore cannot substitute for PdxB. Overexpression of pdxA does not restore growth of the ΔpdxB ΔltaE strain on M9/glucose (data not shown), suggesting that complementation by pdxA depends on the presence of LtaE and therefore on pathway 1. We suspect that overproduction of PdxA increases the rate of consumption of 4PHT formed by the inefficient serendipitous pathway, effectively pulling material through the pathway by catalyzing the thermodynamically favorable conversion of 4PHT to 1-amino-propan-2-one-3-phosphate.

Pathway 1 can be elevated to physiological significance at 37°C by spontaneous mutations

Pathway 1 appears to operate even without the overproduction of YeaB or ThrB during growth on minimal medium at 30°C. Previous workers reported that a ΔpdxB strain grows slowly on glucose with mucoid morphology at 30°C, but not at 37°C ( Lam and Winkler, 1990 ). Our ΔpdxB strain, which differs somewhat from the strain used by Lam and Winkler (1990 ), also shows slow growth on M9/glucose at 30°C. As neither the ΔpdxB ΔltaE strain nor the ΔpdxB ΔthrB strain grows at 30°C (data not shown), pathway 1 can apparently generate sufficient PLP for slow growth at 30°C in the absence of PdxB.

Pseudorevertants of the ΔpdxB strain that grow on M9/glucose at 37°C arise frequently. We have deleted ltaE in one of these pseudorevertants (JK19). Deletion of ltaE slows growth at 37°C substantially small mucoid colonies can be seen after incubation for 5 days, whereas colonies of the pseudorevertant JK19 are much larger (Figure 5). (The variation in colony size seen in Figure 5A was observed repeatedly, even when plates were streaked from a single colony, suggesting that colony phenotype is influenced by some type of phase variation.) These results suggest that pathway 1 contributes significantly to PLP synthesis in pseudorevertant JK19, although is apparently not the only source of PLP. Efforts to identify the mutations responsible for the newly acquired ability of this pseudorevertant to grow at 37°C on M9/glucose are in progress.


Johndoeanonymous

Ampicillin Resistance in E. coli During DNA Transformation

The lab “DNA Transformation-Ampicillin Resistance” tested four different variables (“B1 Amp,” “B1 No Amp,” “B2 Amp,” and “B2 No Amp) , to show how a plasmid with a resistance gene to the antibiotic ampicillin can be used to place the resistance gene into an able strand of bacteria. Both microcentrifuge tubes (labeled “B1” and “B2”) contained the E. coli bacteria and calcium chloride solution. Microcentrifuge tube “B1” received a drop of a solution, which has a gene that is resistant to ampicillin. In the results, “B2 Amp” had no bacterial growth, “B1 Amp” had growth in the form of multiple small colonies, and “B2 No Amp” and “B1 No Amp” both had regular bacterial growth. These results explain how DNA transformation works, and how it can be used in medical science.

Ampicillin: A semisynthetic penicillin used to treat various infections.

Cell Suspension: Cells in culture in moving or shaking liquid medium, often used to describe suspension cultures of single cells and cell aggregates.

E. coli: A bacillus Escherichia coli a bacillus normally found in the human gastrointestinal tract and existing as numerous strains, some of which are responsible for diarrheal diseases. Other strains have been used experimentally in molecular biology.

Resistant: impervious to the action of corrosive substances.

Nonresistant: Not resistant, especially to a disease or an environmental factor, such as heat or moisture.

Transformation: genetic modification of a bacterium by incorporation of free DNA from another ruptured bacterial cell compare.

Agar: A moist support medium used to grow bacteria.

DNA transformation refers to “the uptake and expression of foreign DNA in a living cell. Originally defined as an inherited alteration of the phenotype of the transformed cell, see stable and transient”. This meaning taking DNA from one cell, and introducing it into another cell, that may give different phenotypic (physical) outcomes. In this lab, a plasmid DNA was given to the microcentrifuge tube “B1” which gave it a gene that is resistant to ampicillin. This means that the results should show “B1” having some sort of bacterial growth on the petri dishes. It is apparent that the transformation occurred if the plate labeled “B1 Amp” had growth in the form of colonies, which means that some of the bacterial DNA took up the plasmid DNA that was resistant to ampicillin, therefor making some of the bacteria resistant as well. The bacteria on the “B1” plate will show DNA transformation because the plasmid DNA will give the bacteria DNA a gene for resistance to the ampicillin.

To complete this experiment, the following supplies will be needed: four petri dishes containing agar, two microcentrifuge tubes labeled B1 and B2, four sterile toothpicks, four sterile paperclips, ice, two pipettes, and access to an incubator (needed to heat the petri dishes to 37°C for 24 hours).

Step 1: Use a sterile toothpick to add a very small (about the size of this 0) colony of E. coli into two microcentrifuge tubes (the ones labeled B1 and B2) along with two drops of calcium chloride (which helps the bacterial DNA accept the plasmid DNA). Gently mix the E. coli with the calcium chloride solution until it appears milky. Firmly close both microcentrifuge tubes and safely dispose of the toothpicks that were used into a container to be destroyed(not the trash).

Step 2: Place the microcentrifuge tubes into a tub of ice and wait approximately fifteen minutes. (Do not freeze the tubes, the chilled calcium chloride within the tubes are the correct conditions for DNA uptake.)

Step 1: Gently finger flick the microcentrifuge tubes to suspend the cells.

Step 2: Open the tube labeled “B1” and use the sterile pipette to place one drop of solution from the “P” tube into the “B1” tube. DO NOT add anything to the “B2” tube. (The plasmid DNA from the “P” tube that was added to “B1” has a gene resistance to the antibiotic ampicillin.)

Step 3: Place both tubes in ice again for fifteen minutes. (The cells are kept cold to prevent them from growing within the tubes while the plasmids are being absorbed.)

Step 4: Take both tubes out of the ice and put them into a 42°C water bath immediately for 90 seconds. (The temperature change causes the cells to readily absorb the plasmid DNA, that was placed into tube B1.)

Step 5: Use a sterile pipette to put five drops of a sterile nutrient broth into both tube “B1” and “B2”. Close the tubes tightly, and mix the solutions by tipping them gently. (The bacteria are now provided nutrients to help them recover from the calcium chloride and heatshock treatments.)

Step 6: Label the bottom of the four petri dishes with “B1 No Amp,” “B2 No Amp,” “B1 Amp,” and “B2 Amp.” Also, be sure to properly identify the person who is doing the experiment.

Step 7: Using another sterile pipette, place three drops of cell suspension from the tube labeled “B1” onto the two petri dishes labeled “B1”. Then use a sterile paperclip to gently and evenly spread the suspension across the agar, be sure not to touch the part of the paperclip that comes into contact with the agar, so as not to compromise the containment of the E. coli. Do the same thing for the cell suspension in tube “B2,” onto the petri dishes labeled “B2”.

Step 8: Incubate the four petri dishes upside down for at least 24 hours at 37°ΝΤΟ.

Step 9: Look over the results of the transformation on each of the four petri dishes.

The results of the lab are as follows:

B2 Amp B1 Amp B1 No Amp B2 No Amp

“B2 Amp” (Amp standing for ampicillin) shows no bacterial growth. This is because the bacteria are killed because they had no resistance to the antibiotic ampicillin. The ampicillin that was introduced to the bacteria killed every cell leaving none to reproduce and grow on the petri dish. The plate labeled “B1 Amp” showed some bacterial growth in the form of many little clusters, called colonies. The growth that is shown is from the bacteria that took up plasmids (that were added in step 2), and then became resistant to ampicillin. Since not all of the bacterium were resistant, only some grew, showing the colonies you see in the above photo labeled “B1 Amp”. On both plates “B1 No Amp” and “B2 No Amp” the bacteria grew normally. The antibiotic was not present therefore both the resistant and nonresistant bacteria grew normally.

The result of the experiment did prove that the hypothesis was correct. The procedure went as expected, and no unexpected results were encountered. The data that was collected from the results explain how DNA transformation works and supports the hypothesis. Some of variables that were in the experiment could have produced different results, are incorrect temperatures, inaccurate mixing methods, contamination of the petri dishes or the tools (such as the toothpicks, paperclips, or pipettes), or a breach of containment of the E. coli bacteria. The results directly support DNA transformation in that the plate labeled “B1 Amp” grew in colonies, stating that some of the bacterial DNA had the resistance gene and some did not, supporting the hypothesis in that DNA transformation gave the bacteria the ability to grow because of the gene in the plasmid DNA. The experiment went successfully and proves the hypothesis to be correct.

In this lab, DNA transformation was proved. The results depict a transformation occurring with the bacteria DNA and the plasma DNA where the bacteria DNA receives a gene from the plasmid DNA that is resistant to ampicillin. The plate “B1 Amp” shows growth in colonies where some of the bacteria was resistant and some was not. The bacteria that was not resistant, simply did not receive the resistant gene through transformation.

I would like to thank the Iowa State University for the clearly outlined lab instructions and equipment. I would also like to recognize my father, Alex Hefflefinger, for reading over this lab report and helping me along the way.


E. coli Strain ALS1059

From the laboratory of Mark A. Eiteman, PhD, University of Georgia.

Product Type: Bacteria Name: ALS1059 Cell Type: Bacteria Organism: Escherichia coli Strain: ALS1059 Genotype: Hfr zbi::Tn10 poxB1 &Delta(aceEF) rpsLpps-4 pfl-1 ldhA::Kan arcA726::(FRT) atpFH::Cam Antibiotic Resistance: Kanamycin, chloramphenicol Growth Conditions: TYA medium, 10g/L tryptone, 5g/L NaCl, 1g/L yeast extract, 1.36 g/L sodium acetate trihydrate Na(CH3COO)?3H2O, pH adjusted to 7.0, aerobic 37C Format: Lyophilized culture Storage: Room temperature as lyophilized culture Shipped: Ambient temperature

Protocol Notes

  1. Inject 1 mL of sterile DI water into vial and gently mix.
  2. Use small portions of vial (liquid) contents to inoculate a sterile, liquid culture to an initial OD of 0.03-0.1. For this liquid culture, use the specified growth medium with or without an antibiotic as appropriate.
  3. When culture has visibly grown in liquid medium, plate on solid (Agar) growth medium and incubate at 37C. Maintain strain.
Strain Phenotype
ALS974 Accumulates lactic acid
ALS929 Accumulates pyruvic acid
ALS1392 Does not metabolize arabinose, glucose nor xylose
ALS1391 Does not metabolize arabinose nor xylose
ALS1371 Does not metabolize arabinose nor glucose
ALS1370 Does not metabolize xylose nor glucose
ALS1074 Does not metabolize xylose but can accumulate lactic acid from glucose
ALS1073 Does metabolize glucose but can accumulate lactic acid from xylose
ALS1060 Does not metabolize xylose nor glucose
ALS1059 Accumulates pyruvic acid
ALS1058 Does not metabolize glucose
ALS1048 Does not metabolize glucose
ALS1038 Does not metabolize xylose
ALS1054 Accumulates pyruvic acid
ALS1122 Does not metabolize xylose nor glucose
  1. Y. Zhu, M. A. Eiteman, R. Altman, E. Altman, “High glycolytic flux improves pyruvate production by a metabolically engineered Escherichia coli strain,” Applied and Environmental Microbiology, 74(21):6649-6655 (2008) doi: 10.1128/AEM.01610-08
  2. A. Tomar, M. A. Eiteman, E. Altman, “The effect of acetate pathway mutations on the production of pyruvate in Escherichia coli,” Applied Microbiology and Biotechnology, 62, 76-82 (2003) doi: 10.1007/s00253-003-1234-6
  3. G. N. Vemuri, M. A. Eiteman, E. Altman, "Succinate production in dual-phase Escherichia coli fermentations depends on the time of transition from aerobic to anaerobic conditions," Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 28(6), 325-332 (2002) doi:10.1038/sj.jim.7000250
  4. Y. Zhu, M. A. Eiteman, S. A. Lee, E. Altman, “Conversion of glycerol to pyruvate by Escherichia coli using acetate- and acetate/glucose-limited fed-batch processes,” Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 37:307-312 (2010) doi: 10.10007/s10295-009-0675-z
  5. Y. Zhu, M. A. Eiteman, E. Altman, “Indirect monitoring of acetate exhaustion and cell recycle improve lactate production by non-growing Escherichia coli,” Biotechnology Letters, 30:1943-1946 (2008) doi: 10.1007/s10529-008-9775-5
  6. US Patent Numbers 7,749,740, 8,278,076 and 8,652,825.

If you publish research with this product, please let us know so we can cite your paper.


Watch the video: . Escherichia coli (Οκτώβριος 2022).