Πληροφορίες

Γιατί το 5S-rRNA διαφέρει από άλλα rRNA στη θέση της μεταγραφής και της χρήσης της RNA πολυμεράσης;

Γιατί το 5S-rRNA διαφέρει από άλλα rRNA στη θέση της μεταγραφής και της χρήσης της RNA πολυμεράσης;


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Ενώ η μεταγραφή των rRNAs συμβαίνει στον πυρήνα που μεσολαβεί η RNA Polymerase-I, βλέπουμε ότι το 5S-rRNA μεταγράφεται αλλού με RNA Polymerase-III. Ποια είναι η αιτία και γιατί;


Οι τρεις πολυμεράσες RNA (RNAPs) μοιάζουν πολύ μεταξύ τους, αλλά δεν είναι ίδιες. Όπως περιγράφεται σε αυτό το άρθρο, υπάρχουν υπομονάδες που είναι ειδικές για κάθε τύπο πολυμεράσης.

Εκτός από την παροχή μοναδικών υποστρωμάτων στα οποία δεσμεύονται οι ειδικές για την πολυμεράση υπομονάδες για να δώσουν σε κάθε ένα από τα RNAP τη συγκεκριμένη λειτουργικότητά τους, οι δύο μεγαλύτερες υπομονάδες διαμορφώνουν επίσης την σχισμή της ενεργού θέσης των ενζύμων όπου συμβαίνει η αντίδραση μεταγραφής.

Τα αποτελέσματα του συνδεδεμένου άρθρου ισχυρίζονται επίσης ότι παρόλο που οι βρόχοι σχισμής είναι διατηρημένες περιοχές, υπάρχουν σημαντικές διαφορές μήκους μεταξύ των τριών πολυμεράσεων.

Επίσης το γονίδιο rRNA είναι παρόμοιο με τα γονίδια tRNA και διαφέρουν από άλλα γονίδια στην στρατολόγηση των πολυμερασών. "Παραδοσιακοί" προαγωγείς βρίσκονται ανάντη στην αρχική θέση, ενώ το γονίδιο 5s rRNA και τα γονίδια tRNA έχουν ένα και δύο κουτιά αντίστοιχα που στρατολογεί το RNAPIII.

Τα γονίδια 5s rRNA και tRNA έχουν προαγωγείς εντός της κωδικοποιητικής περιοχής του γονιδίου.

πηγή: http://mol-biol4masters.masters.grkraj.org/html/Gene_Structure5C-Eukaryotic_Promoter_Structure_for_RNA_Polymerase_III.htm

Ακολουθούν δύο εικόνες από τη συνδεδεμένη σελίδα:

Επεξεργασία:

Σε αυτό το άρθρο περιγράφεται ότι τα γονίδια 5s RNA έχουν μετατοπιστεί σε σοβαρούς χρόνους καθ 'όλη τη διάρκεια της εξέλιξης και οι μηχανισμοί για αυτό θα μπορούσαν να είναι ανάλογοι με τη δεύτερη κατηγορία στοιχείων SINE, που περιέχουν εσωτερικούς υποκινητές RNAP III και προέρχονται από tRNA (αυτό θα μπορούσε υποδεικνύουν επίσης την παρόμοια δομή με τα γονίδια tRNA).

Από αυτήν την καλή κριτική Εξέλιξη πολυμονάδων RNA πολλών υπομονάδων στους τρεις τομείς της ζωής θα ήθελα να λάβω ένα σύντομο απόσπασμα που θα μπορούσε να βοηθήσει:

… Η δομή και η λειτουργία ορισμένων από αυτούς τους παράγοντες διατηρούνται στους τρεις τομείς, ενώ ορισμένοι μη ομόλογοι παράγοντες δείχνουν ένα ενδιαφέρον επίπεδο δομικής και λειτουργικής ομοιότητας, υποδηλώνοντας ότι η συγκλίνουσα εξέλιξη έχει οδηγήσει σε εναλλακτικά μέσα διευκόλυνσης της ίδιας διαδικασίας.


Αυτό το άρθρο προτείνει ότι το RNA Pol III σχηματίστηκε νωρίς στην εξέλιξη του ευκαρυωτικού και ενώ υπάρχει μεγάλη διατήρηση, οι συγκεκριμένες ενζυματικές υπομονάδες προκύπτουν από αποκλίνουσα εξέλιξη. Ένα άλλο άρθρο υποδηλώνει ότι η πραγματική αύξηση των υπομονάδων, ωστόσο, είναι αποτέλεσμα της μόνιμης πρόσληψης παραγόντων μεταγραφής στον πυρήνα του RNAP μελετώντας την ομολογία των υπομονάδων με τα υπάρχοντα TF. Αν λοιπόν ρωτούσατε γιατί άλλη πολυμεράση; Το άρθρο προτείνει συμβάντα διπλασιασμού γονιδίων. Υπάρχουν ομόλογα για κάθε υπομονάδα RNAPII στα αρχαία, και οι υπομονάδες μοναδικές για το RNAPI και III είναι ομόλογες με τους παράγοντες μεταγραφής για το RNAPII (TF's συμβολίζεται TFII… ). Επιπλέον καταλήγουν στο συμπέρασμα ότι,

Το πρώτο συμβάν(α) διπλασιασμού RNAP πιθανότατα οδήγησε σε δύο RNAP: το RNAPI και το προγονικό RNAPII/RNAPIII. Αυτό υποστηρίζεται από την ύπαρξη τριών ομόλογων πρωτεϊνών που βρίσκονται στα μεταγραφικά συστήματα RNAPII και RNAPIII αλλά χωρίς ομόλογα στο RNAPI. Οι δύο πρώτες πρωτεΐνες είναι οι TFIIE a και b που βρίσκονται στο RNAPII και οι οποίες είναι ομόλογες με τις RPC82 και RPC34 στο RNAPIII, αντίστοιχα. Αντίθετα, το RNAPI στερείται ομόλογου οποιασδήποτε υπομονάδας του TFIIE, υποδεικνύοντας απώλεια TFE σε αυτό το RNAP. Έτσι, το προγονικό TFE πιθανότατα χάθηκε κατά μήκος της γενεαλογίας RNAPI αλλά διατηρήθηκε τόσο στο RNAPII όσο και στο RNAPIII μετά από επανάληψη του προγόνου RNAPII/RNAPIII. Η τρίτη τέτοια πρωτεΐνη είναι η αρχαϊκή TFB, η οποία είναι κοινή τόσο στο RNAPII (όπου ονομάζεται TFIIB) όσο και στο RNAPIII (όπου ονομάζεται TFIIIB-BRF) αλλά απουσιάζει από το RNAPI (εικ. 4). Αυτά τα γεγονότα στρατολόγησης είχαν ως αποτέλεσμα την επέκταση του αριθμού των υπομονάδων RNAP από 12 στο προγονικό ευκαρυωτικό RNAP σε 14 στο RNAPI (Kuhn et al. 2007) και 16 στο RNAPIII (17 αν συμπεριλάβουμε την πρωτεΐνη RPC31 ειδική για τα φυτά και τα φυτά · Proshkina et al. 2006).

Έτσι, σε εικασίες, εάν έπρεπε να ρωτήσετε γιατί μια διαφορετική πολυμεράση, η εξέλιξη των δύο σειρών των RNAP υπαγόρευσε ένα διαφορετικό μοτίβο δέσμευσης/έναρξης για αυτά που είναι ίσως (ρετρο)ιικά ή (ρετρο)μεταθετά στοιχεία [τα γονίδια tRNA και 5s rRNA ]. Ωστόσο, αυτό είναι ακόμα υπό διερεύνηση.


Καλώς ήλθατε στον Ζωντανό Κόσμο

- Εδώ, η αδενίνη ζευγαρώνει με ουρακίλη αντί για θυμίνη.

- Ο Εξαρτάται από το DNA RNA πολυμεράση καταλύει τον πολυμερισμό μόνο στην κατεύθυνση 5 ’ 𔾷 ’.

- Το 3’𔾹’ λειτουργεί ως πρότυπο σκέλοςΤο Το RNA χτίζεται από αυτό.

- 5 ’ 𔾷 ’ ενεργεί ως κωδικοποιητικό σκέλος. Αυτό αντιγράφεται σε RNA.

3 ’-ATGCATGCATGCATGCATGCATGC-5 ’ κλώνος προτύπου.

5 ’-TACGTACGTACGTACGTACGTACG-3 ’ κωδικοποιητικό σκέλος.

- Κατά τη μεταγραφή, και οι δύο σκέλη δεν αντιγράφονται γιατί

◦ The ο κώδικας για τις πρωτεΐνες είναι διαφορετικός και στα δύο σκέλη. Αυτό περιπλέκει τη μετάφραση.

◦ Αν 2 μόρια RNA παράγονται ταυτόχρονα, αυτό θα ήταν φιλοφρονητικός ο ένας στον άλλον. Σχηματίζει ένα δίκλωνο RNA και εμποδίζει τη μετάφραση.

Μονάδα Μεταγραφής

- Είναι το τμήμα του DNA μεταξύ των θέσεων έναρξης και τερματισμού της μεταγραφής. Αποτελείται από 3 περιοχές:

Ένας προωθητής: Δεσμευτική τοποθεσία για RNA πολυμεράση. Βρίσκεται προς το 5'-άκρο (ανάντη).

Δομικό γονίδιο: Η περιοχή μεταξύ προαγωγέα και τερματισμού όπου πραγματοποιείται η μεταγραφή.

Ένας τερματιστής: Ο ιστότοπος όπου σταματά η μεταγραφή. Βρίσκεται προς το 3'-άκρο (κατάντη).

Μονάδα μεταγραφής και γονίδιο

Γονίδιο είναι μια λειτουργική μονάδα κληρονομικότητας. Είναι η αλληλουχία DNA που κωδικοποιεί ένα RNA (mRNA, rRNA ή tRNA).

Σίστρον είναι ένα τμήμα του DNA που κωδικοποιεί το α πολυπεπτίδιο κατά τη σύνθεση πρωτεϊνών. Είναι το μεγαλύτερο στοιχείο ενός γονιδίου.

Το δομικό γονίδιο σε μια μεταγραφική μονάδα είναι 2 τύποι:

> Monocistronic δομικά γονίδια (διαχωρισμένα γονίδια) : Φαίνεται στους ευκαρυώτες. Εδώ, ακολουθίες κωδικοποίησης (εξόνια ή εκφρασμένες ακολουθίες) διακόπτονται από εσώνια (ενδιάμεσες ακολουθίες).

Τα εξόνια εμφανίζονται σε επεξεργασμένο mRNA.

Τα ιντρόνια δεν εμφανίζονται στο επεξεργασμένο mRNA.

> Πολυκιστρονικό δομικά γονίδια : Φαίνεται σε προκαρυώτες. Εδώ, δεν υπάρχουν σπασμένα γονίδια.

Μεταγραφή σε προκαρυώτες

Στα βακτήρια (Προκαρυώτες), η σύνθεση όλων των τύπων RNA καταλύεται από ένα μόνο RNA πολυμεράση. Έχει 3 βήματα:

> Την έναρξη: Εδώ, το ένζυμο RNA πολυμεράσηδεσμεύεται στη θέση προαγωγέα του DNA. Αυτό προκαλεί την τοπική χαλάρωση της διπλής έλικας του DNA. Ενα παράγοντας έναρξης ( σ παράγοντας) παρόν σε RNA πολυμεράση ξεκινά τη σύνθεση του RNA.

> Επιμήκυνση: Η αλυσίδα RNA συντίθεται σε κατεύθυνση 5’-3’. Σε αυτή τη διαδικασία, ενεργοποιήθηκε τριφωσφορικά ριβονουκλεοζίδια (ATP, GTP, UTP & CTP) προστίθενται. Αυτό είναι συμπληρωματικό της αλληλουχίας βάσεων στο εκμαγείο DNA.

> Λήξη: ΕΝΑ συντελεστής τερματισμού ( ρ παράγοντας) δένει με το RNA πολυμεράση και τερματίζει τη μεταγραφή.

Μεταγραφή σε βακτήρια

Στα βακτήρια, η μεταγραφή και η μετάφραση μπορούν να συζευχθούν (η μετάφραση ξεκινά πριν μεταγραφεί πλήρως το mRNA) επειδή

Το mRNA · δεν απαιτεί καμία επεξεργασία για να γίνει ενεργό.

· Η μεταγραφή και η μετάφραση πραγματοποιούνται στο ίδιο διαμέρισμα (χωρίς διαχωρισμό κυτοσόλης και πυρήνα).

Μεταγραφή σε ευκαρυώτες

Στους ευκαρυώτες, υπάρχουν 2 επιπλέον πολυπλοκότητες:

1. Υπάρχουν 3 RNA πολυμεράσες:

· RNA πολυμεράση Ι: Μεταγράφει τα rRNA (28S, 18S & 5.8S).

· RNA πολυμεράση II: Μεταγράφει το ετερογενές πυρηνικό RNA (hnRNA). Είναι ο πρόδρομος του mRNA.

· RNA πολυμεράση III: Μεταγράφει tRNA, 5S rRNA και snRNA (μικρά πυρηνικά RNA).

2. Οι πρωτογενείς μεταγραφές (hnRNA) περιέχουν εξόνια και εσώνια και δεν είναι λειτουργικά. Επομένως, τα εσώνια πρέπει να αφαιρεθούν. Για αυτό, υποβάλλεται στις ακόλουθες διαδικασίες:

· Σύνδεση: Από το hnRNA, τα εσώνια αφαιρούνται (από το σπλίκοσωμα) και τα εξόνια συνδέονται (ενώνονται) μεταξύ τους.

· Κάλυψη: Εδώ, ένα νουκλεοτίδιο τριφωσφορική μεθυλο γουανοσίνη (καπάκι) προστίθεται στο τέλος 5 ’ του hnRNA.

· Ουρά (πολυαδενυλίωση): Εδώ, υπολείμματα αδενυλίου (200-300) προστίθενται στο 3 ’-τέλος.


Εισαγωγή

Ριβόσωμα, ο πυρήνας της μετάφρασης, στο Escherichia coli αποτελείται από τρία είδη rRNA (16S, 23S και 5S rRNAs) και ένα σύνολο 55 ειδών ριβοσωμικής πρωτεΐνης. Το rRNA παίζει θεμελιώδεις ρόλους ως δομικά και λειτουργικά συστατικά του ριβοσώματος. Το γονιδίωμα του μι. coli περιέχει επτά οπεόνια rRNA, καθένα από τα οποία περιέχει 16S, 23S και 5S rRNA με αυτή τη σειρά. Και τα επτά οπερόνια rRNA περιέχουν, εκτός από τρία γονίδια rRNA, συγκεκριμένα γονίδια tRNA μέσα στο διαχωριστικό μεταξύ των γονιδίων 16S και 23S rRNA και μετά το γονίδιο 23S rRNA. Η πλήρης ακολουθία γονιδιώματος του μι. coli προσδιορίστηκε αρχικά για δύο στελέχη Κ-12, MG1655 [1] και W3110 [2]. Και τα δύο περιέχουν τα ίδια επτά σύνολα rrn οπερόνια, αλλά λόγω της αναστροφής ενός μεγάλου τμήματος μήκους περίπου 783 Kbp εντός του γονιδιώματος W3110 [3], η ευθυγράμμιση επτά rrn τα οπερόνια διαφέρουν μεταξύ δύο καλά χαρακτηρισμένων μι. coli Γονιδιώματα Κ-12 (Το Σχήμα 1Α βλέπε επίσης S1 Εικ.). Τα επίπεδα της RNA πολυμεράσης (η βασική συσκευή της μεταγραφής) και των ριβοσωμάτων (ο βασικός μηχανισμός μετάφρασης) συσχετίζουν τον ρυθμό ανάπτυξης βακτηρίων [4–12]. Η παρουσία επτά οπερονίων rRNA στο μι. coli μπορεί να χρειαστεί για τη βέλτιστη προσαρμογή στις μεταβαλλόμενες φυσιολογικές συνθήκες [13,14]. Μετά από συστηματικές προσεγγίσεις κατασκευής μι. coli στελέχη με διαγραφή οπερονίων rRNA [13,15], το επίπεδο μείωσης της ανάπτυξης βρέθηκε να συσχετίζεται κατά προσέγγιση με τον διαγραμμένο αριθμό οπερονίων rRNA. Η παρουσία έστω και ενός μόνο οπερονίου rRNA στο γονιδίωμα είναι, ωστόσο, ικανή να παράγει έως και 56% των επιπέδων άγριου τύπου rRNA υποτίθεται ότι μέσω της ενισχυμένης έκφρασης του εναπομείνοντος οπερονίου rRNA [15]. Το ορισμένο επίπεδο συσχέτισης μεταξύ του αριθμού των rrn οπερόνια και ο ρυθμός κυτταρικής ανάπτυξης επιβεβαιώθηκε επίσης με τη χρήση ενός συνόλου παραλλαγών αριθμών αντιγράφων opeon με μηχανική μηχανική rRNA [16]. Αυτά τα ευρήματα έδειξαν επίσης ότι μι. coli φιλοξενεί ένα υπερβολικό επίπεδο ριβοσωμάτων, διατηρώντας ένα σημαντικό επίπεδο αποθήκευσης ριβοσωμάτων. Στην πραγματικότητα, τα αχρησιμοποίητα ριβοσώματα αποθηκεύονται σε ανενεργές μορφές σχηματίζοντας διμερή ριβοσώματος μετά από αλληλεπίδραση με παράγοντες διμερισμού όπως ο παράγοντας διαμόρφωσης ριβοσώματος RMF [17].

[A] Και τα δύο μι. coli Τα στελέχη K-12 3110 και K-12 MG1655 φέρουν επτά rrn οπερόνια, αλλά οι θέσεις τους στο γονιδίωμα είναι διαφορετικές σε δύο στελέχη λόγω της αναστροφής μεγάλων αποστάσεων στο στέλεχος W3110 μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού μεταξύ rrnD και rrnE οπερόνια (βλ. S1 Εικ.). [B] Η γονιδιακή οργάνωση του καθενός rrn Το οπερόνιο είναι ουσιαστικά το ίδιο μεταξύ των στελεχών W3110 και MG1655 εκτός από το ότι το rrnD το όπερον του W3110 αντιστοιχεί στο rrnE όπερον του MG1655 και του rrnE το όπερον του W3110 αντιστοιχεί στο rrnD όπερον του MG1655. [C] Επτά rrn Τα οπερόνια μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο τύπους σε σχέση με το γονίδιο tRNA εντός του διαχωριστή μεταξύ του γονιδίου 16S και 23S rRNA. Σε αυτή τη μελέτη, αναλύσαμε το γονίδιο riRNA στον τύπο Α rrn οπερόνια.

Επτά rrn Τα οπερόνια μπορούν να ταξινομηθούν σε δύο ομάδες. Τύπος Α rrn Τα οπερόνια περιλαμβάνουν το γονίδιο tRNA Glu εντός του διαγονιδιακού διαχωριστή μεταξύ των γονιδίων rRNA 16S και 23S ενώ ο τύπος Β rrn τα οπερόνια περιέχουν δύο γονίδια tRNA (tRNA Ile και tRNA Ala) (Εικόνα 1Β). Σε περίπτωση που μι. coli K-12 W3110 που χρησιμοποιήθηκε σε αυτή τη μελέτη, το rrnB, rrnC, rrnD και rrnG τα οπερόνια ανήκουν στον τύπο-Α ενώ τα rrnA, rrnE και rrnH Τα οπερόνια ανήκουν στον τύπο-Β (Σχήμα 1Β και 1Γ). Κατάντη των γονιδίων 23S RNA, υπάρχουν επιπλέον γονίδια tRNA σε τρία οπερόνια rRNA, Εγώ.μι., thrV κατάντη του rrnD οπερον και aspU κατάντη του rrnH οπερόν, και aspT και trpT κατάντη του rrnC οπερόνιο. Αυτά τα 3'-τερματικά γονίδια tRNA φαίνεται να μεταγράφονται από τους δικούς τους προαγωγείς [18]. Για να επιτευχθεί ο υψηλός ρυθμός ανάπτυξης, μι. coli μεγιστοποιεί τον ρυθμό σύνθεσης τόσο του rRNA όσο και του tRNA με συντεταγμένο τρόπο. Μετά τον προσδιορισμό της ισχύος του υποκινητή, βρέθηκαν επτά οπερόνια rRNA να ελέγχονται διαφορετικά ανάλογα με τις θρεπτικές συνθήκες, αυξάνοντας την πιθανότητα ακόμη αγνώστων διαφορικών ρόλων μεταξύ επτά οπερονίων rRNA [19]. Ο διαφορικός έλεγχος επτά οπερονίων rRNA μπορεί να αποδοθεί στη διαφορά στα είδη tRNA σε καθένα rrn οπερόνιο ή τους διαφορετικούς λειτουργικούς ρόλους των rRNAs [σημειώστε ότι περίπου 2% αλληλουχία του rRNA είναι διαφορετική μεταξύ επτά οπερονίων rRNA (Πίνακας S1)].

Μεταγραφή και των επτά rrn τα οπερόνια ξεκινούν από διαδοχικούς υποκινητές (ανάντη ισχυρό Ρ1 και κατάντη ασθενές Ρ2) σε περιοχή ελέγχου ανάντη του γονιδίου 16S rRNA [20,21]. Ο προαγωγέας Ρ1 παίζει σημαντικό ρόλο στην έκφραση υψηλού επιπέδου των οπερονίων του rRNA σε εκθετικά αναπτυσσόμενα κύτταρα, ενώ το Ρ2 παίζει ρόλο σύνθεσης του rRNA σε χαμηλό και βασικό επίπεδο. Η έναρξη της μεταγραφής από τον προαγωγέα P1 είναι υπό τον θετικό έλεγχο από τον Fis [22-24] και τον αρνητικό έλεγχο από τον H-NS [25,26], παίζοντας αρχιτεκτονικούς και ρυθμιστικούς ρόλους στο νουκλεοειδές, και δύο νουκλεοτίδια, τριφωσφορικά νουκλεοσίδια έναρξης (inNTPs). [9,12,27,28] και αυστηρό σήμα ελέγχου ppGpp (και pppGpp) [8,9,29,30]. Τα πρωτογενή αντίγραφα ή τα πρόδρομα rRNA στη συνέχεια υποβάλλονται σε επεξεργασία σε ώριμο 16S rRNA, μεμονωμένα tRNA, 23S rRNA και 5S rRNA από ένα σύνολο νουκλεασών επεξεργασίας [31,32].

Κατά τη διάρκεια της χαρτογράφησης των συστατικών προαγωγέων που αναγνωρίζονται από το ολοένζυμο RNA πολυμεράσης (RNAP) RpoD μόνο απουσία υποστηρικτικών παραγόντων μεταγραφής, βρήκαμε μια ισχυρή κορυφή δέσμευσης ολοενζύμου RpoD στο γονίδιο 16S rRNA [33,34]. Εδώ εντοπίσαμε τη θέση δέσμευσης του ολοενζύμου RNAP RpoD εντός του γονιδίου 16S rRNA για καθένα από τα επτά rrn οπερόνια. Ως προσπάθεια αναγνώρισης του φυσιολογικού ρόλου (ων) αυτών των εσωτερικών υποκινητών μέσα στα γονίδια 16S rRNA, αναλύσαμε στη συνέχεια την ακριβή θέση αυτού του ισχυρού εσωτερικού υποκινητή εντός του γονιδίου 16S rRNA στο rrnD όπερον του μι. coli K-12 W3110, το οποίο χρησιμοποιήθηκε ως αντιπρόσωπος του τύπου-Α rrn οπερόνιο, χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία μετατόπισης γέλης με διαφορετικούς ανιχνευτές DNA και την παρατήρηση AFM. Η δραστηριότητα του προαγωγέα στη συνέχεια εξετάστηκε από έναν in vitro δοκιμασία μεταγραφής και αν in vivo δοκιμασία αναφοράς χρησιμοποιώντας τον εσωτερικό προαγωγέα εντός του γονιδίου 16S rRNA από το rrnD οπερόνιο. Τα αποτελέσματα συνολικά έδειξαν ότι αυτός ο εσωτερικός προαγωγέας εντός του γονιδίου 16S rRNA βρέθηκε ότι κατευθύνει τη μεταγραφή της περιοχής διαχωρισμού μεταξύ 16S και 23S rRNA, δημιουργώντας ένα εσωτερικό RNA, που αναφέρεται στο riRNA σε αυτήν την αναφορά. Η σύνθεση του riRNA επιβεβαιώθηκε περαιτέρω in vivo με ανάλυση Northern blot. Δεδομένου ότι η δραστηριότητα του υποκινητή riRNA αυξάνεται, σε σχέση με τους κύριους προαγωγείς, στη στατική φάση, προτείνουμε την πιθανότητα η μεταγραφή του riRNA να λαμβάνει χώρα μόνο όταν η μεταγραφή από τους κύριους προαγωγείς rrn τα οπερόνια σιωπούν, επιτρέποντας τη σύνθεση διαστημικών tRNA ανεξάρτητα από τη σύνθεση του rRNA.


Η κυτταροσκελετική φιλαμίνη Α (FLNA) είναι μια σημαντική πρωτεΐνη που εμπλέκεται σε πολλαπλές κυτταρικές διεργασίες. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι το FLNA μπορεί να προάγει ή να αναστέλλει την ανάπτυξη και ανάπτυξη του καρκίνου, ωστόσο, οι μηχανισμοί που κρύβονται πίσω από αυτά τα συμβάντα δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Εδώ δείχνουμε ότι, τόσο στα κύτταρα 293T όσο και στα κύτταρα SaOS2, η καταστροφή του FLNA ενίσχυσε σημαντικά τη μεταγραφή των γονιδίων που μεταγράφονται με RNA πολυμεράση (pol) III, εκτός από ένα υποσύνολο γονιδίων tRNA. Αντίθετα, η εκ νέου έκφραση του FLNA σε κυτταρική σειρά μελανώματος με ανεπάρκεια FLNA (Α7) κατέστειλε τη μεταγραφή όλων των γονιδίων που έχουν μεταγραφεί από pol III, υποδηλώνοντας ότι το FLNA αναστέλλει τη μεταγραφή pol III με τρόπο συγκεκριμένο για τον τύπο κυττάρου. Οι δοκιμασίες ανοσοκαταβύθισης χρωματίνης αποκάλυψαν ότι η καταστολή της μεταγραφής του γονιδίου pol III από το FLNA συσχετίζεται με τη μειωμένη πληρότητα των μηχανημάτων μεταγραφής RNA pol III σε υποκινητές. Η μικροσκοπία ανοσοφθορισμού και οι δοκιμές συν-ανοσοκατακρήμνισης αποκάλυψαν ότι το FLNA μπορεί να συσχετιστεί με τον μηχανισμό μεταγραφής RNA pol III μέσω του τομέα δέσμευσης ακτίνης εντός των πυρήνων. Η μηχανιστική ανάλυση αποκάλυψε ότι το FLNA καταστέλλει τη μεταγραφή γονιδίου pol III περιορίζοντας την πρόσληψη του μηχανισμού μεταγραφής RNA pol III στους προαγωγείς των γονιδίων που είναι ευαίσθητα στην αλλοίωση της έκφρασης του FLNA. Αυτά τα ευρήματα όχι μόνο επεκτείνουν την κατανόηση της λειτουργίας του FLNA στα κύτταρα, αλλά παρέχουν και νέες ιδέες για τον μηχανισμό με τον οποίο το FLNA καταστέλλει τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.

Η εργασία αυτή υποστηρίχθηκε από το National Natural Science Foundation of China Project 31271395 (προς W. D.) και WorldWide Cancer Research Project 09-0208 (προς P. S.). Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν έχουν καμία σύγκρουση συμφερόντων με το περιεχόμενο αυτού του άρθρου.


Αποτελέσματα

RNA Splicing Endonuclease From Haloferax volcanii

Haloferax volcanii κωδικοποιεί μια ενδονουκλεάση που συνδέει RNA (HVO_2952, endA) σε ένα δικιστρόνιο οπερόν μαζί με μια συνθετάση τρυπτοφανυλο-tRNA (HVO_2951, trpS1) (Εικόνα 3), τα δύο γονίδια επικαλύπτονται από τέσσερα νουκλεοτίδια. Τόσο η βάση δεδομένων προκαρυωτικών οπερονίων (Taboada et al., 2012) όσο και το μεταγράφωμά μας (Berkemer et al., 2020), TSS (Babski et al., 2016) και δεδομένα λήξης μεταγραφής (TTS) (Berkemer et al., 2020) επιβεβαιώσει αυτήν τη γονιδιωματική οργάνωση. Σύμφωνα με τις μελέτες μας TSS (Babski et al., 2016), το γονίδιο για την ενδονουκλεάση ματίσματος φαίνεται να περιέχει δύο προαγωγείς για την κατάντη trpS1 γονίδιο (Εικόνα 3), επομένως το trpS1 το γονίδιο θα μπορούσε να μεταγραφεί ανεξάρτητα από το endA γονίδιο. Τα δεδομένα TSS δείχνουν επίσης ότι η μεταγραφή από το endA ο προαγωγέας είναι συγκριτικά χαμηλός. Επιπλέον, το endA Το mRNA δεν ανιχνεύεται στις κηλίδες Northern (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Όμως, τα δεδομένα πρωτεϊνών δείχνουν σαφώς ότι η ενδονουκλεάση συγκόλλησης υπάρχει στο πρωτεώμα (Jevti ć et al., 2019 Schulze et al., 2020).

Εικόνα 3. Γονιδιωματική τοποθεσία του endA ανάλυση γονιδίου και θέσης έναρξης μεταγραφής (TSS). ο endA το γονίδιο κωδικοποιείται στο μείον σκέλος και επικαλύπτεται κατάντη trpS1 γονίδιο από τέσσερα νουκλεοτίδια. Η ανάλυση dRNA-Seq πραγματοποιήθηκε για τον εντοπισμό των TSS σε H. volcanii (Babski et al., 2016). Πράσινα σήματα: το απομονωμένο RNA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τερματική εξωνουκλεάση (+TEX), κόκκινα σήματα: το RNA δεν υποβλήθηκε σε επεξεργασία με TEX (–TEX). Η σύγκριση των αναγνώσεων και από τα δύο κλάσματα μας επέτρεψε να προσδιορίσουμε τα TSS. Η αλληλουχία του γονιδιώματος εμφανίζεται στη μέση (με τη γονιδιωματική θέση στα νουκλεοτίδια, τα σχολιασμένα γονίδια εμφανίζονται σε μαύρες ράβδους). Οι πράσινες (+TEX) και οι κόκκινες (–TEX) περιοχές αντιπροσωπεύουν τις αναγνώσεις dRNA-Seq και το ύψος αντιστοιχεί στην κάλυψη (εμφανίζεται στα αριστερά).

Για να διερευνήσουμε τη βιολογική λειτουργία της ενδονουκλεάσης ματίσματος, στοχεύσαμε να καταστείλουμε την έκφρασή της χρησιμοποιώντας παρεμβολή CRISPR (CRISPRi) (Stachler and Marchfelder, 2016 Stachler et al., 2019). Η προσέγγιση CRISPRi χρησιμοποιεί το ενδογενές σύστημα CRISPR-Cas για την καταστολή της μεταγραφής (Stachler and Marchfelder, 2016 Stachler et al., 2019). Το σύμπλεγμα πρωτεϊνών Cas Cascade καθοδηγείται από ένα crRNA στην περιοχή προαγωγέα ή στην περιοχή έναρξης της μεταγραφής που οδηγεί στην παρεμπόδιση της έναρξης της μεταγραφής. Εάν καταστείλουμε την έναρξη της μεταγραφής στο endA προαγωγέας, οι προαγωγείς για trpS1 που βρίσκεται στο endA γονίδιο εξακολουθούν να υπάρχουν και ικανά να ξεκινήσουν τη μεταγραφή του trpS1 γονίδιο.

Νοκ ντάουν του endA Αποτελέσματα γονιδίου σε ελαττώματα ανάπτυξης και ατέλειες στη συγκόλληση tRNA

Ιστότοποι έναρξης μεταγραφής του Haloferax προσδιορίστηκαν σε προηγούμενη εργασία, επιτρέποντας τον προσδιορισμό των ανάντη τοποθεσιών προαγωγών (Babski et al., 2016). Σχεδιάσαμε τέσσερα crRNA για να στοχεύσουμε τον υποκινητή, τη θέση έναρξης της μεταγραφής και το ανοιχτό πλαίσιο ανάγνωσης του endA γονίδιο (Εικόνα 4Α). ο Haloferax το στέλεχος HV30 μετασχηματίστηκε με πλασμίδια που εκφράζουν αυτά τα crRNAs (Stachler and Marchfelder, 2016 Stachler et al., 2019) και τα μετασχηματισμένα που προέκυψαν αναλύθηκαν σε σχέση με την αναπτυξιακή τους συμπεριφορά, δείχνοντας ότι η έκφραση του crRNA SEa2 είχε την ισχυρότερη επίδραση στην ανάπτυξη ( Σχήμα 4Β και Συμπληρωματικό Σχήμα 2). Τα κύτταρα που εκφράζουν αυτό το crRNA έδειξαν ένα σοβαρό ελάττωμα ανάπτυξης. RNA εξήχθη από αυτά τα κύτταρα για να προσδιοριστεί πόσο ισχυρό είναι endA Το mRNA καταστέλλεται. Δεδομένου ότι το ποσό των endA Το mRNA που υπήρχε στο κύτταρο ήταν πολύ χαμηλό για να χρησιμοποιήσει στυπώματα Northern. Χρησιμοποιήσαμε ποσοτική RT-PCR (qRT-PCR) για να συγκρίνουμε τις συγκεντρώσεις mRNA (Εικόνα 4C).

Εικόνα 4. CRISPRi κατά του endA το γονίδιο έχει ως αποτέλεσμα τη μείωση endA συγκεντρώσεις mRNA. (ΕΝΑ) Θέση των CRRNA. Τέσσερα διαφορετικά crRNA (SEa1-SEa4) σχεδιάστηκαν έναντι του endA τοποθεσία έναρξης μεταγραφής και αρχή του ORF. Ο προωθητής υποδεικνύεται με ένα κόκκινο πλαίσιο και TATA η τοποθεσία έναρξης της μεταγραφής υποδεικνύεται με +1 το endA Το ORF υποδεικνύεται με κίτρινο και το ATG εμφανίζεται επίσης. Το TSS και το A του ATG είναι πανομοιότυπα, δείχνοντας ότι το endA Το mRNA είναι χωρίς οδηγό. Για μια πιο λεπτομερή προβολή, δείτε το Συμπληρωματικό Σχήμα 1. (ΣΙ) Η έκφραση του crRNA SEa2 επηρεάζει την ανάπτυξη. Η έκφραση του crRNA SEa2 οδηγεί σε μια σοβαρή φάση υστέρησης (ανοιχτό γκρι κύκλοι, SEa2). Ως έλεγχος, εκφράστηκε ένα CRRNA που δεν δεσμεύει κανένα στόχο στο κύτταρο (σκούρα γκρι διαμάντια, tele19). (ΝΤΟ) Μείωση των endA συγκεντρώσεις mRNA κατά την έκφραση του crRNA SEa2. Η qRT-PCR πραγματοποιήθηκε για τη μέτρηση των συγκεντρώσεων των endA mRNA σε άγριο τύπο (στήλη pTA232, κύτταρα HV30 × pTA232) και κύτταρα CRISPRi (στήλη SEa2, κύτταρα HV30 × pTA232SEa2). Η συγκέντρωση mRNA σε κύτταρα άγριου τύπου ορίστηκε στο 100%. Η καταστολή με το CRISPRi μειώνει τη συγκέντρωση mRNA στο 1,1% (ଐ.5) εκείνης του άγριου τύπου.

Η έκφραση του crRNA SEa2 μειώνει το endA συγκέντρωση mRNA έως 1,1% (ଐ,5%) του επιπέδου άγριου τύπου στην εκθετική φάση. Για τον προσδιορισμό της επίδρασης της κατώτερης έκφρασης του endA κατά την ωρίμανση του ιντρονίου που περιέχει tRNA, πραγματοποιήθηκαν στυπώματα Northern για την ανίχνευση των προδρόμων tRNA Trp, ενδιάμεσων επεξεργασίας και ώριμης μορφής. Οι αναλύσεις Northern blot έδειξαν ξεκάθαρα ότι η έκφραση του crRNA SEa2 οδηγεί σε συσσώρευση μη επιπλεγμένων tRNAs (Εικόνα 5).

Εικόνα 5. Η ωρίμανση του tRNA παρεμποδίζεται σοβαρά στα κύτταρα CRISPRi. Το RNA απομονώθηκε από κύτταρα ελέγχου (λωρίδα c, HV30 × pTA232) και κύτταρα που εκφράζουν crRNA SEa2 (λωρίδα SEa2, HV30 × pTA232SEa2) (λωρίδες e: τα κύτταρα αναπτύχθηκαν σε εκθετική φάση, λωρίδες s: κύτταρα αναπτύχθηκαν σε σταθερά φάση). Το RNA διαχωρίστηκε με 8% PAGE και μεταφέρθηκε σε νάιλον μεμβράνες. Οι κηλίδες υβριδοποιήθηκαν με έναν ανιχνευτή έναντι του εσωνίου tRNA που ανιχνεύει επίσης το ώριμο tRNA (άνω πάνελ κάτω πλαίσιο: το ίδιο στύπωμα υβριδοποιήθηκε με έναν ανιχνευτή έναντι του 5S rRNA). Η έκφραση του crRNA SEa2 έχει ως αποτέλεσμα τη συσσώρευση μη περιγραφόμενου tRNA και των ενδιάμεσων επεξεργασίας. Μόνο πολύ μικρές ποσότητες ώριμου tRNA μπορούν να ανιχνευθούν. Ένας δείκτης μεγέθους DNA δίνεται στα αριστερά. Οι πρόδρομες ουσίες, τα ενδιάμεσα προϊόντα επεξεργασίας και το ώριμο προϊόν εμφανίζονται σχηματικά στα δεξιά.

Η καταστολή της συναρμογής ενδονουκλεάσης αλλάζει τις σχετικές αφθονίες (προ) ριβοσωματικού RNA

Ριβοσωμικά πρόδρομα RNA σε H. volcanii περιέχουν δύο μοτίβα BHB (Εικόνα 6Α). Πρόσφατα, η δομική ακεραιότητα αυτών των μοτίβων BHB έχει αποδειχθεί ότι απαιτείται για τη σύνθεση ειδικών αρχαιοειδών κυκλικών-προ-rRNA ενδιάμεσων και ώριμου rRNA (Jüttner et al., 2020). Η παρουσία και η δομή αυτού του μοτίβου μέσα στους ριβοσωμικούς μίσχους επεξεργασίας διατηρείται στα περισσότερα αρχαιά που αναλύθηκαν μέχρι τώρα (J üttner et al., 2020 Qi et al., 2020). Η επίδραση στις συνολικές σχετικές αφθονίες (προ) rRNA σε endA Τα κύτταρα CRISPRi διερευνήθηκαν με qRT-PCR συνδυάζοντας διαφορετικά σύνολα εκκινητών, τα οποία έδειξαν ότι τα προ-rRNA που δεν διασπώνται στο μοτίβο ΒΗΒ συσσωρεύονται ελαφρώς (Εικόνα 6Β). Επιπλέον, η ποσότητα των κυκλικών προ-rRNA που κανονικά διασπώνται στο μοτίβο BHB και κυκλοφορούν από τη λιγάση μειώνεται έντονα, δείχνοντας ότι η διάσπαση του μοτίβου BHB από την ενδονουκλεάση ματίσματος (SE) είναι μειωμένη. Επιπλέον, η συνέπεια του endA Η καταστολή είναι μια συνολικά μειωμένη ποσότητα συνολικών 16R και 23S rRNA σε κύτταρα CRISPRi (Εικόνα 6). Συνολικά, αυτά τα αποτελέσματα διαπίστωσαν ότι η συγκόλληση ενδονουκλεάσης είναι απαραίτητη για αποτελεσματική ωρίμανση του rRNA in vivo.

Εικόνα 6. Ανάλυση της προ-rRNA ωρίμανσης σε κύτταρα που έχουν εξαντληθεί από την ενδονουκλεάση ματίσματος RNA. (ΕΝΑ) Σχηματική αναπαράσταση του H. volcanii Οπερόνιο rDNA. Ένα από τα δύο οπερόνια rDNA (οπερόνιο Α: HVO_3038-HVO_3042 και πλευρικές περιοχές) που υπάρχουν σε H. volcanii και χαρακτηρίζεται από ένα επιπλέον tRNA γονίδιο Cys στο 3′ άκρο του απεικονίζεται σχηματικά. Οι ανεστραμμένες επαναλήψεις που πλαισιώνουν τα ώριμα 16S/23S rRNA δημιουργούν δίκλωνες περιοχές RNA που περιέχουν μοτίβα διόγκωσης-έλικας-διογκώματος (BHB), υποθετικά υποστρώματα για την ενδονουκλεάση ματίσματος (SE, ψαλίδι). Εκκινητές που χρησιμοποιούνται για ποσοτική ανάλυση RT-PCR συνολικών 16/23S rRNA (εμφανίζονται με πορτοκαλί χρώμα), προκυκλικά 16R/23S rRNA (είδη μετά από διάσπαση προ-rRNA, μπλε) και 5 ′ προ-16S/23S rRNA που περιέχουν υποδεικνύονται περιοχές ανάντη της αντίστοιχης διόγκωσης 5 ′ (είδη pre-rRNA διάσπασης πριν από το BHB, πράσινο) (πράσινα βέλη). (ΣΙ) Προφίλ ωρίμανσης προ-rRNA κυττάρων που εξαντλούνται από SE αναλύθηκαν με qRT-PCR.

Ο trpS1 Το γονίδιο εκφράζεται μεμονωμένα

Τα δεδομένα μεταγραφής δείχνουν ότι το trpS1 γονίδιο που κωδικοποιείται κατάντη του endA επηρεάζεται μόνο ελαφρώς στο endA Το CRISPRi στελεχώνεται και δεν ρυθμίζεται προς τα κάτω αλλά ελαφρώς ρυθμίζεται προς τα πάνω (ανοδική ρύθμιση 0,8, τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Έτσι, καθοδική ρύθμιση της μεταγραφής στον προαγωγέα ανάντη του endA δεν καταστέλλει την έκφραση του TrpS1. Οι υποστηρικτές για trpS1 εντοπίστηκε στο endA γονίδιο (Εικόνα 3) φαίνεται να επαρκεί για επαρκή έκφραση TrpS1. Για να διερευνήσει εάν endA και trpS1 μεταγράφονται σε ένα δικιστρονικό mRNA, εκτελέσαμε RT-PCR χρησιμοποιώντας εκκινητές που στοχεύουν το endA γονίδιο και το trpS1 γονίδιο (Εικόνα 7Α). Ένα δισιστρονικό mRNA βρέθηκε σε RNA από κύτταρα άγριου τύπου, ωστόσο, μόνο χαμηλές ποσότητες τέτοιου mRNA υπήρχαν στο RNA από endA Κύτταρα CRISPRi (Εικόνα 7Β).

Εικόνα 7. trpS1 μπορεί να μεταγραφεί ανεξάρτητα από endAΤο Το RNA απομονώθηκε από κύτταρα ελέγχου (HV30 × pTA232, λωρίδες γ) και κύτταρα που εκφράζουν crRNA SEa2 (HV30 × pTA232SEa2, λωρίδες SEa2). Τα RNA μεταγράφηκαν αντίστροφα χρησιμοποιώντας τυχαίους εξαμερείς εκκινητές. Η PCR πραγματοποιήθηκε χρησιμοποιώντας εκκινητές που καλύπτουν την επικαλυπτόμενη περιοχή του endA και trpS1 (ΕΝΑ) ή μέρος του trpS1 (ΣΙ)Το Τα προϊόντα PCR διαλύθηκαν σε πηκτή αγαρόζης 0,8%. Ρ: Ενίσχυση από HV30 gDNA ως μάρτυρας PCR. Ν: έλεγχος χωρίς την προσθήκη προτύπου DNA. M: 1 kb συν DNA σκάλα, με τα μεγέθη να δίνονται στα αριστερά. RT –, προστέθηκε απομονωμένο RNA για να αποκλειστεί η μόλυνση DNA RT+, προστέθηκε πρότυπο cDNA (από κύτταρα ελέγχου ή κύτταρα CRISPRi). Σήματα κάτω από 100 bp στον πίνακα Β προέρχονται από εκκινητές.

Μείωση Αποτελεσμάτων Έκφρασης Σύνδεσης Ενδονουκλεάσης σε Αλλαγές στο Μεταγράφημα

Για να διερευνήσουμε τον αντίκτυπο της καταστολής της ενδονουκλεάσης στο κύτταρο, συγκρίναμε τα μεταγραφώματα άγριου τύπου και endA Κύτταρα CRISPRi. Το RNA απομονώθηκε από τριπλούν και των δύο στελεχών και δημιουργήθηκαν βιβλιοθήκες cDNA και υποβλήθηκαν σε RNA-Seq (για λεπτομέρειες βλέπε Υλικό και Μέθοδοι). Τα προκύπτοντα δεδομένα αλληλουχίας διερευνήθηκαν και το DESeq2 (Love et al., 2014) χρησιμοποιήθηκε για τον έλεγχο για διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια σε endA Κύτταρα CRISPRi σε σύγκριση με τα κύτταρα άγριου τύπου. Η διαφορική έκφραση δοκιμάστηκε για όλα τα σχολιασμένα γονίδια του HaloferaxΤο Συνολικά, 102 γονίδια βρέθηκαν να ρυθμίζονται προς τα πάνω και 41 ρυθμίζονται προς τα κάτω (όταν ένα όριο log2: 2/𢄢 εφαρμόστηκε) (Πίνακες 1, 2 και συμπληρωματικοί πίνακες 1, 2).

Τραπέζι 1. Γονίδια που ρυθμίζονται προς τα κάτω στο endA Στέλεχος CRISPRi.

Πίνακας 2. Γονίδια που ρυθμίζονται προς τα πάνω στο endA Στέλεχος CRISPRi.

Τα μεταγραφικά δεδομένα επιβεβαιώνουν σαφώς τη μείωση της ρύθμισης της ενδονουκλεάσης, καθώς είναι το πιο υπορυθμισμένο γονίδιο. Και τα τρία tRNA που περιέχουν ιντρόνιο ήταν επίσης κάτω από τη ρύθμιση (Πίνακας 1 και Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Εκτός από τα tRNA που περιέχουν ιντρόνια, επτά άλλα tRNA ρυθμίστηκαν επίσης προς τα κάτω (Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Τα rRNA δεν περιλήφθηκαν στην ανάλυση αφού το πρωτόκολλο RNA-Seq περιλάμβανε ένα βήμα αφαίρεσης rRNA.

Τα 10 tRNA που ρυθμίζονται προς τα κάτω, όλα αποκωδικοποιούν κατά προτίμηση χρησιμοποιούμενα κωδικόνια mRNA σύμφωνα με την προκατάληψη κωδικονίου που καθορίζεται για Haloferax (Nakamura and Sugiura, 2007) 4 , το οποίο μπορεί να οδηγήσει μαζί με τη μειωμένη παραγωγή rRNA σε γενική μείωση της πρωτεϊνικής σύνθεσης. Τα άλλα 31 γονίδια που ρυθμίστηκαν προς τα κάτω περιλάμβαναν 17 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και RNA με άγνωστη λειτουργία (Συμπληρωματικός Πίνακας 1).

Το πιο ρυθμισμένο γονίδιο κωδικοποιεί L-γαλακτική περμεάση. Αυτό το γονίδιο κωδικοποιείται σε ένα δικιστρόνιο οπερόν μαζί με το γονίδιο για την εξαρτώμενη από FAD οξειδορεδουκτάση (HVO_1697), η οποία επίσης ρυθμίζεται προς τα πάνω. Έξι από τα πιο ρυθμισμένα γονίδια βρίσκονται σε μια ομάδα σε pHV3 (HVO_B0042-HVO_B0047) και σχετίζονται με το μεταβολισμό του σιδήρου. Συνολικά, 11 πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη μεταφορά και 22 γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και RNA με άγνωστες λειτουργίες ρυθμίζονται εκ των υστέρων (Συμπληρωματικός Πίνακας 2).

Κυκλικά RNA που είναι προϊόντα της αντίδρασης SE

Ως πρόσθετη προσέγγιση για τον εντοπισμό όλων των υποστρωμάτων της ενδονουκλεάσης συγκόλλησης εμπλουτίσαμε και προσδιορίσαμε την αλληλουχία των κυκλικών RNAs H. volcanii (circRNA-seq). Το SE διασπά τα υποστρώματά του στα μοτίβα BHB και το προκύπτον ιντρόνιο κυκλοφορεί από μια λιγάση. Έτσι, το circRNA-seq προσδιορίζει μεταξύ άλλων, τα κυκλικά προϊόντα ματίσματος της SE. Συνολικά, αναγνωρίστηκαν επτά circRNAs πλαισιωμένα από ένα μοτίβο BHB (Πίνακας 3). Δύο ανήκουν στο γνωστό tRNA και τέσσερα στα προβλεπόμενα υποστρώματα rRNA SE το ένα είναι πρόσφατα αναγνωρισμένο. Το κυκλοποιημένο εσώνιο του τρίτου tRNA, tRNA Gln TTG, δεν βρέθηκε, το οποίο μπορεί να οφείλεται στο μικρό μήκος του (31 νουκλεοτίδια). Έχει αναφερθεί προηγουμένως ότι η μέθοδος circRNA-seq έχει προκατάληψη έναντι των βραχέων RNA (Danan et al., 2012). Οι αναλύσεις της θέσης ιντρονίου στο πρόσφατα προσδιορισμένο υπόστρωμα έδειξαν ότι βρίσκεται στο 5 ′ UTR του HVO_1309 (Εικόνα 8). Οι κωδικοί HVO_1309 για μια πεπτιδάση από την πρωτεΐνη της οικογένειας M24 και τα δεδομένα μεταγραφής δείχνουν ότι το HVO_1309 ρυθμίζεται προς τα κάτω στο endA Κύτταρα CRISPRi (Συμπληρωματικός Πίνακας 1). Αυτό υποδηλώνει ότι ενδέχεται να απαιτείται συγκόλληση για αποτελεσματική έκφραση ή σταθερότητα RNA.

Πίνακας 3. Κυκλικά RNA Αναγνωρίζονται από circRNA-seq.

Εικόνα 8. Ένα ιντρόνιο βρίσκεται στο 5′ UTR του HVO_1309. Το CircRNA-seq αναγνώρισε ένα κυκλικό RNA που πλαισιώνεται από ένα μοτίβο BHB που προέρχεται από το 5′UTR του γονιδίου HVO_1309. Η θέση του ιντρονίου σκιάζεται με κίτρινο χρώμα. Το TSS υποδεικνύεται με μαύρη γραμμή και +1. Τα TSS αναγνωρίστηκαν με ανάλυση dRNA-Seq (Babski et al., 2016). Πράσινο: RNA υπό θεραπεία με τελική εξωνουκλεάση (+TEX), κόκκινο: RNA που δεν έχει υποβληθεί σε θεραπεία με TEX (–TEX). Το ύψος των περιοχών αντιστοιχεί στην κάλυψη των μετρήσεων dRNA-Seq (οι αριθμοί ανάγνωσης δίνονται στα αριστερά). Οι συντεταγμένες του γονιδιώματος υποδεικνύονται στα νουκλεοτίδια στο κάτω μέρος. Το γονίδιο HVO_1309 εμφανίζεται ως μαύρη γραμμή.

Το Splicing Endonuclease επεξεργάζεται ένα Pre-16S και το Πρόσφατα Ταυτοποιημένο Υπόστρωμα mRNA in vitro

ο Haloferax η ενδονουκλεάση ματίσματος μπορεί να εκφραστεί σε Ε. Coli και επεξεργάζεται αποτελεσματικά τα tRNA που περιέχουν ιντρόνιο in vitro (Thompson and Daniels, 1990). Για να επιβεβαιώσουμε ότι οι πρόδρομοι ριβοσωμικού RNA είναι υποστρώματα για SE, επεξεργαστήκαμε έναν περικομμένο πρόδρομο 16S rRNA in vitro με ανασυνδυασμένο SE (Εικόνα 9). Για να επιβεβαιωθεί η δραστηριότητα του ανασυνδυασμένου SE, πραγματοποιήθηκε αντίδραση ελέγχου με το ιντρόνιο που περιέχει τον πρόδρομο tRNA Trp που έδειξε αποτελεσματική επεξεργασία (τα δεδομένα δεν παρουσιάζονται). Ο πρόδρομος πλήρους μήκους 16S rRNA έχει μήκος μεγαλύτερο από 1.600 νουκλεοτίδια και τέτοια μεγάλα πρόδρομα είναι μη βέλτιστα υποστρώματα για in vitro αναλύσεις επεξεργασίας. Ως εκ τούτου, δημιουργήσαμε ένα υπόστρωμα rRNA μήκους 568 nt, το οποίο είχε διαγράψει το μεγαλύτερο μέρος του ώριμου τμήματος rRNA, αφήνοντας μόνο τα 5 ′ και 3 ′ άκρα του 16S rRNA και του μοτίβου BHB (Εικόνα 9Α). Η επώαση με τον ανασυνδυασμένο SE έδειξε ότι αυτό το υπόστρωμα όντως επεξεργάζεται αποτελεσματικά (Εικόνα 9Β). Για να ελέγξουμε αν το πρόσφατα αναγνωρισμένο μοτίβο BHB που βρέθηκε στο 5 ′ UTR του HVO_1309 (Πίνακας 3) διασπάται από SE, επωάσαμε τον αντίστοιχο πρόδρομο σε ένα in vitro ανάλυση με ανασυνδυασμένο SE (Εικόνα 10), η οποία αποκάλυψε ότι αυτό το υπόστρωμα υποβλήθηκε σε επεξεργασία. Τα δύο προϊόντα που συνοδεύουν το BHB είναι ευδιάκριτα (26 nt και 29 nt). Το κεντρικό θραύσμα (47 nt) είτε τρέχει πιο αργά και είναι ορατό σε περίπου 65 νουκλεοτίδια (ένα θραύσμα αυτού του μεγέθους είναι επίσης ορατό στην αντίδραση ελέγχου) είτε αποικοδομείται.

Εικόνα 9. In vitro επεξεργασία κολοβωμένου προδρόμου 16S. (ΕΝΑ) Σχηματικό σχέδιο του κολοβωμένου προδρόμου 16S rRNA που χρησιμοποιείται για το in vitro αντίδραση: 1.450 νουκλεοτίδια του εσωτερικού τμήματος του 16S rRNA διαγράφηκαν. Arrows and dashed lines indicate the SE splice sites and processing products. The resulting fragment sizes are given in nucleotides. (ΣΙ) In vitro processing was performed with recombinant SE and the radioactively labeled substrate. Different amounts of SE protein were used (between 100 and 1,000 ng), as indicated at the top of the lanes. A DNA size marker is given on the left. The 568 nt long precursor is processed by the SE, resulting in three fragments: a 334 nt leader fragment, a 214 nt 16S rRNA loop fragment and a 20 nt trailer fragment. SE processing products can be observed beginning at 100 ng. Processing fragments are shown schematically on the right.

Figure 10. In vitro processing of the newly identified BHB containing RNA. (ΕΝΑ) Schematic drawing of the precursor substrate. As a substrate for the in vitro processing reaction, the 5′ UTR of HVO_1309 was used, encompassing the intron flanked by the BHB motif with additional nucleotides up- and downstream. (ΣΙ) Processing reaction. The substrate was transcribed in vitro and labeled throughout with [α−− 32 P]-UTP. In vitro processing was performed with recombinant SE, and RNAs were separated by 8% PAGE. Samples were incubated for 60 min. A DNA size marker is given at the sides, and sizes are shown in the middle (M). A control reaction without enzyme was performed at the beginning and end of the reaction time (indicated as NC0 and NC60 for 0 and 60 min of incubation, respectively). Samples with enzyme were incubated for 60 min (SE). Left panel: short exposure, right panel: long exposure. The precursor RNA has a length of 102 nucleotides, and the processing fragments are 26, 29, and 47 nucleotides long. Substrate and processing products are shown schematically at the side.


Biosynthesis

Στους Ευκαρυώτες

As the building-blocks for the organelle, production of rRNA is ultimately the rate-limiting step in the synthesis of a ribosome. In the nucleolus, rRNA is synthesized by RNA polymerase I using the specialty genes (rDNA) that encode for it, which are found repeatedly throughout the genome. The genes coding for 18S, 28S and 5.8S rRNA are located in the nucleolus organizer region and are transcribed into large precursor rRNA (pre-rRNA) molecules by RNA polymerase I. These pre-rRNA molecules are separated by external and internal spacer sequences and then methylated, which is key for later assembly and folding. After separation and release as individual molecules, assembly proteins bind to each naked rRNA strand and fold it into its functional form using cooperative assembly and progressive addition of more folding proteins as needed. The exact details of how the folding proteins bind to the rRNA and how correct folding is achieved remains unknown. The rRNA complexes are then further processed by reactions involving exo- and endo-nucleolytic cleavages guided by snoRNA (small nucleolar RNAs) in complex with proteins. As these complexes are compacted together to form a cohesive unit, interactions between rRNA and surrounding ribosomal proteins are constantly remodeled throughout assembly in order to provide stability and protect binding sites. This process is referred to as the "maturation" phase of the rRNA lifecycle. The modifications that occur during maturation of rRNA have been found to contribute directly to control of gene expression by providing physical regulation of translational access of tRNA and mRNA. Some studies have found that extensive methylation of various rRNA types is also necessary during this time to maintain ribosome stability.

The genes for 5S rRNA are located inside the nucleolus and are transcribed into pre-5S rRNA by RNA polymerase III. The pre-5S rRNA enters the nucleolus for processing and assembly with 28S and 5.8S rRNA to form the LSU. 18S rRNA forms the SSUs by combining with numerous ribosomal proteins. Once both subunits are assembled, they are individually exported into the cytoplasm to form the 80S unit and begin initiation of translation of mRNA.

Ribosomal RNA is non-coding and is never translated: rRNA is only transcribed from rDNA and then matured for use as a structural building block for ribosomes. rRNA is not translated into proteins of any kind. Transcribed rRNA is bound to ribosomal proteins to form the subunits of ribosomes and acts as the physical structure that pushes mRNA and tRNA through the ribosome to process and translate them.

Eukaryotic Regulation

Synthesis of rRNA is up-regulated and down-regulated to maintain homeostasis by a variety of processes and interactions:

  • The kinase AKT indirectly promotes synthesis of rRNA as RNA polymerase I is AKT-dependent.
  • Certain angiogenic ribonucleases, such as angiogenin (ANG), can translocate and accumulate in the nucleolus. When the concentration of ANG becomes too high, some studies have found that ANG can bind to the promoter region of rDNA and unnecessarily increase rRNA transcription. This can be damaging to the nucleolus and can even lead to unchecked transcription and cancer.
  • During times of cellular glucose restriction, AMP-activated protein kinase (AMPK) discourages metabolic processes that consume energy but are non-essential. As a result, it is capable of phosphorylating RNA polymerase I (at the Ser-635 site) in order to down-regulate rRNA synthesis by disrupting transcription initiation.
  • Impairment or removal of more than one pseudouridine or 29-O-methylation regions from the ribosome decoding center significantly reduces rate of rRNA transcription by reducing the rate of incorporation of new amino acids.
  • Formation of heterochromatin is essential to silencing rRNA transcription, without which ribosomal RNA is synthesized unchecked and greatly decreases the lifespan of the organism.

In Prokaryotes

Similar to eukaryotes, the production of rRNA is the rate-limiting step in the prokaryotic synthesis of a ribosome. Σε E. coli, it has been found that rRNA is transcribed from the two promoters P1 and P2 found within seven different rrn οπερόνια. The P1 promoter is specifically responsible for regulating rRNA synthesis during moderate to high bacterial growth rates. Because the transcriptional activity of this promoter is directly proportional to the growth rate, it is primarily responsible for rRNA regulation. An increased rRNA concentration serves as a negative feedback mechanism to ribosome synthesis. High NTP concentration has been found to be required for efficient transcription of the rrn P1 promoters. They are thought to form stabilizing complexes with RNA polymerase and the promoters. In bacteria specifically, this association of high NTP concentration with increased rRNA synthesis provides a molecular explanation as to why ribosomal and thus protein synthesis is dependent on growth-rate. A low growth-rate yields lower rRNA / ribosomal synthesis rates while a higher growth rate yields a higher rRNA / ribosomal synthesis rate. This allows a cell to save energy or increase its metabolic activity dependent on its needs and available resources.

In prokaryotic cells, each rRNA gene or operon is transcribed into a single RNA precursor that includes 16S, 23S, 5S rRNA and tRNA sequences along with transcribed spacers. The RNA processing then begins before the transcription is complete. During processing reactions, the rRNAs and tRNAs are released as separate molecules.

Prokaryotic Regulation

Because of the vital role rRNA plays in the cell physiology of prokaryotes, there is much overlap in rRNA regulation mechanisms. At the transcriptional level, there are both positive and negative effectors of rRNA transcription that facilitate a cell's maintenance of homeostasis:

  • An UP element upstream of the rrn P1 promoter can bind a subunit of RNA polymerase, thus promoting transcription of rRNA. factors such as FIS bind upstream of the promoter and interact with RNA polymerase which facilitates transcription.
  • Anti-termination factors bind downstream of the rrn P2 promoter, preventing premature transcription termination.
  • Due to the stringent response, when the availability of amino acids is low, ppGpp (a negative effector) can inhibit transcription from both the P1 and P2 promoters.

Ribosome production

The ribosome is a large RNA–protein machine that synthesizes all cellular proteins. Ribosomes consist of two subunits: the small [small ribosomal subunit (SSU) 18S rRNA and 33 ribosomal proteins (RPs)] and large [large ribosomal subunit (LSU) the 28S, 5.8S and 5S rRNAs and 46 RPs] ribosomal subunits [1]. The 28S (25S in yeast), 18S and 5.8S rRNAs are co-transcribed by RNA polymerase I as part of a long single precursor (47S or 35S pre-rRNA in yeast). Ribosomes are assembled on the 47 S precursor transcript as it undergoes multiple processing and modification steps [1] (Figure 1A). RNA polymerase I transcription appears rate-limiting for ribosome production, whereas RPs are produced in significant excess with the unused proteins being rapidly degraded by the proteasome [2]. In contrast, the 5S rRNA is transcribed by RNA polymerase III and is incorporated into the 5S RNP (ribonucleoprotein particle), a ribosome assembly intermediate that also contains the RPs RPL5 and RPL11, before being integrated into the ribosome. Most of the steps of ribosome production occur in the nucleolus, a sub-compartment of the nucleus, with later steps taking place in the nucleoplasm and the cytoplasm [1] (Figure 1A).

Ribosome biogenesis and p53 signalling

(ΕΝΑ) Schematic representation of ribosome biogenesis and the link between the 5S RNP and MDM2. Three of the rRNAs (18S, 5.8S and 28S) are transcribed by RNA polymerase I (Pol I) in the nucleolus, whereas the 5S rRNA is transcribed by RNA polymerase III (Pol III) in the nucleoplasm. The mature (18S, 5.8S, 28S and 5S) rRNAs and the precursor rRNAs (47S, 21S, 18SE, 32S and 7S) are indicated. The LSU ribosome biogenesis factors PAK1IP1 and PICT1 are shown. (σι) Illustration of the 5S RNP interaction with MDM2 and the regulation of p53 signalling in both unstressed and stressed cells Ub: ubiquitin.

(ΕΝΑ) Schematic representation of ribosome biogenesis and the link between the 5S RNP and MDM2. Three of the rRNAs (18S, 5.8S and 28S) are transcribed by RNA polymerase I (Pol I) in the nucleolus, whereas the 5S rRNA is transcribed by RNA polymerase III (Pol III) in the nucleoplasm. The mature (18S, 5.8S, 28S and 5S) rRNAs and the precursor rRNAs (47S, 21S, 18SE, 32S and 7S) are indicated. The LSU ribosome biogenesis factors PAK1IP1 and PICT1 are shown. (σι) Illustration of the 5S RNP interaction with MDM2 and the regulation of p53 signalling in both unstressed and stressed cells Ub: ubiquitin.

Ribosome biogenesis is the major consumer of cellular energy that is up-regulated in cancer, with changes in nucleolar morphology being a hallmark of transformed cells, and down-regulated during cell division and differentiation [3]. Furthermore, ribosome biogenesis is affected by many, if not all, forms of cellular stress including DNA damage, oncogene overexpression (oncogenic stress), hypoxia, oxidative stress and nutritional stress [4]. Not surprisingly, ribosome production is also regulated by oncogenes such as c-myc and tumour suppressors such as p53, retinoblastoma protein (Rb) and p14ARF [4]. More recently, it has emerged that ribosome biogenesis also controls multiple cellular signalling pathways and defects in this process can lead to disease.


The importance of ribosome biogenesis in human health and disease

Changes in ribosome biogenesis have been linked to a wide range of conditions including cardiovascular, neurodegenerative and skeletal disorders as well as cancer [31–34]. An ever-growing number of rare genetic diseases, termed ribosomopathies, have been attributed to defects in ribosome production [35,36]. These diseases arise due to mutations in genes encoding RPs or proteins important for ribosome production. Common clinical manifestations include macrocytic anaemia, skeletal defects, skin problems and, notably, a pre-disposition to cancer. In many cases, p53 levels have been shown to be de-regulated and, in some animal models, the clinical symptoms of the diseases have been shown to be p53-dependent. Evidence suggests that defects in ribosome production in these cases lead to 5S RNP accumulation and subsequent p53 activation. The most-studied ribosomopathies are Diamond–Blackfan anaemia (DBA), Shwachman–Diamond syndrome (SDS), 5q syndrome and Treacher Collins syndrome (TCS). Where the mutant gene has been identified, the majority of DBA patients have mutations in genes encoding RPs including RPS19, RPS24, RPS17, RPS7, RPL35A, RPL5 and RPL11, and defects in pre-rRNA processing are commonly used as a diagnostic tool for this disease [37]. DBA patients present with hypoplastic macrocytic anaemia together with heterogeneous anomalies including skeletal, urogenital and cardiac defects. In DBA animal models some, but not all of the symptoms have been shown to be p53-dependent and the anaemia is dependent on the interaction between the 5S RNP and MDM2 [38]. Like DBA, 5q syndrome presents with macrocytic anaemia and is a form of myelodysplastic syndrome (MDS) [39]. 5q syndrome is caused by deletion of chromosome 5q, which contains the gene encoding RPS14. The anaemia in 5q syndrome has been attributed to haploinsufficiency of RPS14 and is p53-dependent in mouse models [40]. SDS is caused by mutations in the SBDS gene, which encodes a protein important for the late, cytoplasmic stages of LSU maturation [41]. SDS patients present with endocrine pancreatic insufficiency, ineffective haematopoiesis and, occasionally, anaemia and skeletal defects. Mutations in TCOF1, and less commonly the RNA polymerase I and III subunits POLR1C and POLR1D, cause TCS. TCOF1 is important for both the transcription and 2′-Ο-methylation of the rRNA [34]. TCS presents with craniofacial anomalies due to proliferation defects of neural crest cells during early development. A mouse model successfully replicated the clinical phenotype by mutating the TCOF1 gene, and further work revealed the craniofacial defects to be p53-dependent [42].

For some time now, ribosome biogenesis has been known to be linked to cancer. Changes in nucleolar structure (as seen by Ag NOR staining) and an increase in ribosome production are two hallmarks of cellular transformation [4]. Strikingly, many anti-cancer chemotherapeutics, including actinomycin D and 5-fluorouracil, block ribosome biogenesis [43] making it a promising target for new cancer therapies [44]. The tumour suppressor p14 ARF , which needs the 5S RNP for its full capability to activate p53 [14], is also a suppressor of ribosome production [45]. However, the most striking link is seen with the highly abundant nucleolar protein nucleophosmin (NPM1), which is mutated in approximately 30% of leukaemias [46]. More recently, exome sequencing has revealed mutations in RPL5, RPL10, RPL11, RPL22, RPS15 and RPS20 in a variety of cancers but most notably leukaemias [47]. In particular, RPS15 mutations are associated with an aggressive, relapsed form of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) and frequently found associated with mutations in the p53 gene [48]. In many ribosomopathies, the patients are pre-disposed to multiple forms of cancer. For example DBA patients have a 5-fold higher risk of cancer than the general population with a 28- to 36-fold higher incidence of acute myeloid leukaemia (AML), osteosarcoma or colon cancer [47]. AML is the most common form of cancer associated with ribosomopathy patients. Solid tumours, such as head and neck tumours or osteosarcomas, are less common but also seen [49]. The increase in cancer rate in ribosomopathy patients appears counter-intuitive since they often have higher than normal levels of p53. However, it could be that the patient's cells become desensitized to p53 or that there is pressure to mutate or affect the p53 pathway when p53 levels are elevated.

Recent work has indicated a role for p53 in the regulation of cellular metabolism. This was highlighted in a mouse model carrying a cancer derived point mutation, C305F, in MDM2 [20]. This mutation blocks the 5S RNP–MDM2 interaction and renders the mouse cells insensitive to p53 activation when ribosome biogenesis is blocked using low levels of actinomycin D [23]. In addition, this mutation also increases the rate the mice develop c-myc-induced lymphomas. Interestingly, the MDM2–C305F mutation promotes fat accumulation in mice under normal conditions and hepatosteatosis under fasting conditions [20]. It was further shown that ribosome biogenesis, and the 5S RNP–MDM2 pathway, is the sensor responsible for p53-mediated remodelling of lipid homoeostasis in the liver in response to restricted nutrients. In a separate study, it was found that the protein nucleomethylin (NML) functions to repress rRNA transcription in the livers of mice fed a high-fat diet [50]. NML-null mice showed a reduced lipid accumulation in the liver and these mice did not become obese on a sustained high-fat diet. It is unclear whether NML-mediated suppression of rRNA transcription functions to control liver metabolism through p53, although it is likely that the livers in mice fed with a high-fat diet contain elevated levels of p53. It is therefore clear that the regulation of ribosome production is a major nutrient sensor and critical for the correct response to changes in diet that affect liver function.


From DNA to RNA The RNA world - PowerPoint PPT Presentation

Το PowerShow.com είναι ένας κορυφαίος ιστότοπος κοινής χρήσης παρουσίασης/παρουσίασης. Είτε η αίτησή σας είναι επιχείρηση, οδηγίες, εκπαίδευση, ιατρική, σχολείο, εκκλησία, πωλήσεις, μάρκετινγκ, διαδικτυακή εκπαίδευση ή απλώς για διασκέδαση, το PowerShow.com είναι ένας εξαιρετικός πόρος. Και, το καλύτερο από όλα, οι περισσότερες από τις δροσερές λειτουργίες του είναι δωρεάν και εύχρηστες.

Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε το PowerShow.com για να βρείτε και να κατεβάσετε παραδείγματα διαδικτυακών παρουσιάσεων ppt του PowerPoint σε σχεδόν οποιοδήποτε θέμα μπορείτε να φανταστείτε, ώστε να μάθετε πώς να βελτιώνετε τις δικές σας διαφάνειες και παρουσιάσεις δωρεάν. Or χρησιμοποιήστε το για να βρείτε και να κατεβάσετε υψηλής ποιότητας παρουσιάσεις ppt του PowerPoint με εικονογραφημένες ή κινούμενες διαφάνειες που θα σας διδάξουν πώς να κάνετε κάτι νέο, επίσης δωρεάν. Ή χρησιμοποιήστε το για να ανεβάσετε τις δικές σας διαφάνειες PowerPoint, ώστε να μπορείτε να τις μοιραστείτε με τους δασκάλους, την τάξη, τους μαθητές, τα αφεντικά, τους υπαλλήλους, τους πελάτες, τους πιθανούς επενδυτές ή τον κόσμο. Or χρησιμοποιήστε το για να δημιουργήσετε πραγματικά υπέροχες προβολές διαφανειών φωτογραφιών - με 2D και 3D μεταβάσεις, κινούμενα σχέδια και μουσική της επιλογής σας - που μπορείτε να μοιραστείτε με τους φίλους σας στο Facebook ή τους κύκλους του Google+. Όλα αυτά είναι επίσης δωρεάν!

Με μια μικρή χρέωση, μπορείτε να αποκτήσετε το καλύτερο διαδικτυακό απόρρητο του κλάδου ή να προωθήσετε δημόσια τις παρουσιάσεις και τις παρουσιάσεις σας με κορυφαίες κατατάξεις. Αλλά εκτός από αυτό είναι δωρεάν. Θα μετατρέψουμε ακόμη και τις παρουσιάσεις και τις προβολές παρουσίασης σε καθολική μορφή Flash με όλη την αρχική τους δόξα πολυμέσων, όπως κινούμενα σχέδια, εφέ μετάβασης 2D και 3D, ενσωματωμένη μουσική ή άλλο ήχο, ή ακόμα και βίντεο ενσωματωμένα σε διαφάνειες. Όλα δωρεάν. Οι περισσότερες από τις παρουσιάσεις και τα slideshow στο PowerShow.com είναι δωρεάν για προβολή, πολλές είναι ακόμη και δωρεάν για λήψη. (Μπορείτε να επιλέξετε αν θα επιτρέψετε στους χρήστες να κατεβάσουν τις αρχικές παρουσιάσεις του PowerPoint και τις προβολές διαφανειών φωτογραφιών σας επί πληρωμή ή δωρεάν ή καθόλου.) Δείτε το PowerShow.com σήμερα - ΔΩΡΕΑΝ. Υπάρχει πραγματικά κάτι για όλους!

παρουσιάσεις δωρεάν. Or χρησιμοποιήστε το για να βρείτε και να κατεβάσετε υψηλής ποιότητας παρουσιάσεις ppt του PowerPoint με εικονογραφημένες ή κινούμενες διαφάνειες που θα σας διδάξουν πώς να κάνετε κάτι νέο, επίσης δωρεάν. Ή χρησιμοποιήστε το για να ανεβάσετε τις δικές σας διαφάνειες PowerPoint, ώστε να μπορείτε να τις μοιραστείτε με τους δασκάλους, την τάξη, τους μαθητές, τα αφεντικά, τους υπαλλήλους, τους πελάτες, τους πιθανούς επενδυτές ή τον κόσμο. Or χρησιμοποιήστε το για να δημιουργήσετε πραγματικά υπέροχες προβολές διαφανειών φωτογραφιών - με 2D και 3D μεταβάσεις, κινούμενα σχέδια και μουσική της επιλογής σας - που μπορείτε να μοιραστείτε με τους φίλους σας στο Facebook ή τους κύκλους του Google+. Όλα αυτά είναι επίσης δωρεάν!


Συμπεράσματα

The above data support the formation of multifaceted initiation complexes for executing co-transcriptional processing of tRNA in human cells (Fig. 2). But why it matters to coordinate and couple processing with transcription for biosynthesis of tRNA? The human genome has > 500 tRNA genes, the majority of which are mapped in six chromosomes [ [158] ]. More than half of these genes are arranged in repeats on chromosomes 1 and 6. The tRNA gene cluster in chromosome 6 resides in a genetic region that constitutes a transcription hotspot opposing the extended major histocompatibility class I locus [ [158] ]. Remarkably, the tRNA gene cluster in chromosome 1 is transcribed as individual short transcripts and not as long polycistronic transcripts [ [159] ]. Therefore, the arrangement of tRNA genes in the human genome is nonrandom and necessitates a tethering regulatory mechanism in the nucleus. In this regard, it has been shown that there are

2000 foci of Pol III in the nucleus of a dividing HeLa cell and that each focus has

5 active polymerases [ [99] ]. Since these polymerases are supposed to act through facilitated recycling mode (one gene–one committed polymerase), it is plausible that several tRNA genes be clustered and transcribed in a focus, in which enzymes tethered to each other by assembling massive transcription complexes [ [99] ], possibly like the one described in Fig. 2. A similar clustering of rRNA gene repeats positioned in distinct chromosomes takes place in nucleolar organizer regions that aid in coordinating transcription and processing of the new transcripts [ [160] ]. In the budding yeast, tRNA genes are not arranged in tandem repeats, but they do cluster in the nucleolus that hosts RNase P and Pol III [ [88, 89] ]. But can Pol III carry out co-transcriptional processing, as this polymerase lacks a motif similar to the CTD shown to enable Pol II to recruit processing factors? In fact, the presence of a domain such as the CTD is not a prerequisite for coordinated transcription and processing of all RNAs. Thus, Pol I, which lacks this domain, facilitates partial co-transcriptional cleavages of precursor rRNA in the nucleolus, as described above. Additionally, the length of a precursor transcript is not a limiting factor for having co-transcriptional processing at one or more sites. Two classes of short RNAs, small nuclear RNAs and small nucleolar RNAs, are transcribed by Pol II and processed via co-transcriptional cleavage at the 3′ and 5′ end, respectively [ [161-164] ]. Accordingly, co-transcriptional processing of tRNA is possible and it matters for having high enzyme specificity and productivity in order to supply the cell with large amounts of mature tRNAs needed for growth and proliferation.


Δες το βίντεο: DNA vs RNA Updated (Φεβρουάριος 2023).