Πληροφορίες

Ποια είναι η ποσότητα του mRNA που μεταφέρεται από εξωσώματα;

Ποια είναι η ποσότητα του mRNA που μεταφέρεται από εξωσώματα;


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Θα ήθελα να καταλάβω καλύτερα, αν είναι δυνατόν, τι είδους μόρια RNA μεταφέρουν τα εξωσώματα στα ανθρώπινα κύτταρα.

Το πείραμα πίσω από αυτή τη γενική ερώτηση είναι ο στόχος μας να κάνουμε έναν συνδυασμό mRNA-Seq και miRNA-Seq. Θα θέλαμε να είμαστε σε θέση να προετοιμάσουμε βιβλιοθήκες για τον προσδιορισμό αλληλουχίας από τα ίδια δείγματα για να μειώσουμε την πιθανή προκατάληψη όσο καλύτερα γίνεται. Γι 'αυτό θα θέλαμε να εξαγάγουμε τόσο RNA όσο και miRNA από τα εξωσώματα, αν είναι δυνατόν σε μία διαδρομή.

Υπάρχει τρόπος προσέγγισης της αναλογίας του πόσο μικρά μόρια RNA σε σύγκριση με το MRNA μεταφέρονται από εξωσώματα;

Πόσο από τα μικρά μόρια που μεταφέρονται από τα κυστίδια είναι πραγματικά απλώς κατακερματισμένο mRNA και όχι πραγματικό μικρό RNA (π.χ. miRNA, snRNA κ.λπ.);

Αν κάποιος γνωρίζει κάποια εργασία/έρευνα σχετικά με αυτήν την κατεύθυνση, θα εκτιμούσα την παράθεση.

ευχαριστώ Assa


Η κραυγή του Amedeo Avogadro: Τι είναι 1 μg εξωσωμάτων;

Οι συμβατικές απόψεις σχετικά με τον τρόπο με τον οποίο οι πρωτεΐνες και άλλα κυτταρικά συστατικά μπορούν να κυκλοφορούν μεταξύ των ευκαρυωτικών κυττάρων έχουν αμφισβητηθεί τα τελευταία χρόνια 1-7. Πέρα από την κλασική εκκριτική/εξωκυτταρική οδό, οι ρόλοι των εκκρινόμενων ή αποβαλλόμενων μικροκυστιδίων (MV) στη μεσοκυτταρική σηματοδότηση έχουν προσελκύσει μεγάλη προσοχή. Τα MV απελευθερώνονται από όλα τα κύτταρα που έχουν ερευνηθεί μέχρι σήμερα και υπάρχουν σχεδόν σε όλα τα σωματικά υγρά. Τα διαφορετικά εξωκυτταρικά κυστίδια ονομάζονται συλλογικά κυστίδια μεμβράνης 8 . Τα κυστίδια διαμέτρου 100 nm–1 mm αναφέρονται συχνά ως μικροσωματίδια ή MVs και δημιουργούνται με αποβολή από την πλασματική μεμβράνη. Τα κυστίδια μεγέθους 50-100 nm αναφέρονται ως εξωσώματα. Η εξωγενής βιογένεση διαφέρει από εκείνη των κυστιδίων μεμβράνης και εμφανίζεται σε δύο στάδια: (i) σχηματισμός πολυσυλλεκτικών σωμάτων (MVB) από ενδοσώματα, όταν τμήματα της μεμβράνης τους εισχωρούν και εμφανίζονται στον αυλό του διαμερίσματος για να σχηματίσουν ενδοαυλικούς κυστίδια (ILV) , και (ii) σύντηξη μεμβράνης MVB-πλάσματος, η οποία απελευθερώνει αυτά τα ILV στο εξωκυττάριο περιβάλλον ως εξωσώματα 9. Ωστόσο, δεν μπορεί να γίνει σαφής και αποφασιστική πειραματική διάκριση μεταξύ MV και εξωσωμάτων 10 . Εδώ, χρησιμοποιώ την ταξινόμηση βάσει μεγέθους παραπάνω.

Τα τελευταία χρόνια, τα εξωσώματα έχουν λάβει μεγάλη προσοχή 8, και τα χρησιμοποιώ για να δείξω την ανησυχία μου. Τα εξωσώματα περιέχουν ένα μεταβλητό φάσμα μορίων που περικλείονται μέσα στα κυστίδια και στη μεμβράνη τους, όπως πρωτεΐνες και υποδοχείς σήματος, πρωτεΐνες τελεστές, λιπίδια, DNA και φορτίο RNA. Το πρότυπό τους είναι συγκεκριμένο για το εκκριτικό γονικό κύτταρο. Τα εξωσώματα θεωρούνται συχνά ως «πακέτα» πληροφοριών που μπορούν να φτάσουν σε διάφορους στόχους, αντιπροσωπεύοντας μια νέα μορφή επικοινωνίας μεταξύ των κυττάρων. Στην «κλασική» διακυτταρική επικοινωνία, τα κύτταρα εκκρίνουν συγκεκριμένα μόρια που χρησιμεύουν ως σήματα για τα κύτταρα-στόχους. Αντίθετα, τα εξωσώματα μπορεί να είναι σε θέση να παρέχουν περισσότερα σήματα και περισσότερες πληροφορίες στα κύτταρα αποδέκτες, επιτρέποντας έτσι μια πιο περίπλοκη κυτταρική απόκριση 11-13. Μια σημαντική ιδέα είναι ότι τα εξωσώματα μπορούν να παρέχουν μια ανταλλαγή γενετικών πληροφοριών, κυρίως με τη μορφή mRNA ή microRNA 14 . Θεωρητικά, αυτές οι πληροφορίες μπορούν να μεταφερθούν σε μεγάλες αποστάσεις.

Ωστόσο, η φυσιολογική συνάφεια των εξωσωμάτων ήταν δύσκολο να εκτιμηθεί επειδή η προέλευσή τους, η βιογένεση και οι μηχανισμοί έκκρισης παραμένουν αινιγματικοί 8. Οι νέες έννοιες βασίζονται κυρίως σε μοριακά και κυτταρικά δεδομένα in vitro, αλλά δεν υπάρχουν άμεσα στοιχεία για το ρόλο των εξωσωμάτων in vivo. Για να αποδειχθεί αυτή η έννοια, πρέπει να υπάρχουν εργαλεία για την ειδική αναστολή ή αύξηση της έκκρισης ή της πρόσληψης εξωσωμάτων, χωρίς να επηρεάζεται η έκκριση άλλων κυστιδίων μεμβράνης και η γενική έκκριση πρωτεϊνών ή λιπιδικών μεσολαβητών 1, 9, 15. Μέχρι στιγμής τέτοιες προσπάθειες ήταν ανεπιτυχείς (δείτε τις κριτικές παραπάνω). Έτσι, κανένας τρόπος για την παραποίηση 16 δεν έχει βρεθεί ακόμη η υπόθεση σχετικά με τη μεταφορά πληροφοριών από εξωσώματα και όλες οι σχετικές πληροφορίες είναι απλώς μια συσσώρευση υποστηρικτικών δεδομένων. Παρά την αβεβαιότητα ορισμένων συγγραφέων για τον πραγματικό φυσιολογικό ρόλο των εξωσωμάτων 1, 8, 9, 17, η τρέχουσα επικρατούσα άποψη είναι ότι τα εξωσώματα μπορούν να φέρουν ένα «ενισχυμένο δυναμικό» στη ροή πληροφοριών μεταξύ των κυττάρων και να ανοίξουν μια «νέα εποχή» στη μελέτη της διακυτταρικής επικοινωνίας (βλέπε π.χ. 3, 10, 11, 18-21). Επιπλέον, έχουν προταθεί επίσης μεγάλες πρακτικές εφαρμογές 14.


Αφηρημένη

Τα εξωσώματα είναι κοινά νανοσωματίδια που συνδέονται με μεμβράνη και περιέχουν διαφορετικά βιομόρια, όπως λιπίδια, πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα. Τα εξωσώματα προέρχονται από κύτταρα μέσω εξωκυττάρωσης, προσλαμβάνονται από τα κύτταρα-στόχους και μπορούν να μεταφέρουν βιολογικά σήματα μεταξύ τοπικών ή απομακρυσμένων κυττάρων. Η έκκριση εξωσωμάτων είναι ένα συστατικό φαινόμενο που εμπλέκεται τόσο στις φυσιολογικές όσο και στις παθολογικές διεργασίες και καθορίζει τόσο τα εξωσωματικά μόρια της επιφάνειας όσο και το περιεχόμενο. Ως εκ τούτου, μπορούμε να εκμεταλλευτούμε τα εξωσώματα ως βιοδείκτες, εμβόλια και φορείς φαρμάκων και να τα τροποποιήσουμε ορθολογικά για θεραπευτικές παρεμβάσεις. Ωστόσο, εξακολουθεί να αποτελεί πρόκληση ο εντοπισμός, η απομόνωση και η ποσοτικοποίηση των εξωσωμάτων με ακρίβεια, αποτελεσματικότητα και επιλεκτικότητα. Περαιτέρω μελέτες για εξωσώματα θα διερευνήσουν τις δυνατότητές τους στη μεταφραστική ιατρική και θα παρέχουν νέους δρόμους για τη δημιουργία αποτελεσματικών κλινικών διαγνωστικών και θεραπευτικών στρατηγικών, η χρήση εξωσωμάτων σε αυτές τις εφαρμογές μπορεί να ονομαστεί εξωσωματική θερανοστατική. Αυτή η ανασκόπηση περιγράφει τις θεμελιώδεις διαδικασίες σχηματισμού και πρόσληψης εξωσωμάτων. Επιπλέον, οι φυσιολογικοί και παθολογικοί ρόλοι των εξωσωμάτων στη βιολογία απεικονίζονται επίσης με έμφαση στο πώς τα εξωσώματα μπορούν να αξιοποιηθούν ή να κατασκευαστούν ως ισχυρά εργαλεία στη μεταφραστική ιατρική.

Λέξεις -κλειδιά: εξώσωμα, εξωκυτταρικό κυστίδιο, μεταφραστική ιατρική, βιοδείκτης, χορήγηση φαρμάκου.


Αποτελέσματα

Μια πρωτεΐνη που δεσμεύει το RNA και βρίσκεται στην κυτταρική επιφάνεια

Για να προσδιοριστεί εάν η κινητοποίηση των λευκοκυττάρων ZC3H12D + προκλήθηκε από πρωτογενείς όγκους, διεξήχθη ανοσοϊστοχημική (IHC) εξέταση των πνευμόνων ποντικών που φέρουν όγκο. Οι όγκοι τους προέρχονται από κύτταρα καρκίνου του μαστού E0771 ή κύτταρα καρκίνωμα πνεύμονα Lewis (LLC). Ο αριθμός των κυττάρων ZC3H12D + CD45 + στους πνεύμονες αυξήθηκε με την πρωτογενή ανάπτυξη όγκου (Συμπληρωματικό Σχ. S1a: δεδομένα E0771). Zc3h12d έκφραση σε λευκοκύτταρα που προέρχονται από ποντίκια που φέρουν όγκο ενισχύθηκε από πνεύμονες που φέρουν όγκο σε ένα σύστημα συγκαλλιέργειας in vitro (Συμπληρωματικό Σχήμα S1b). Επειδή ZC3H12D αναγνωρίστηκε ως γονίδιο καταστολής όγκων σε θυλακοειδή λέμφωμα και ασθενείς με καρκίνο του πνεύμονα 18,19, ο ρόλος του ZC3H12D στη μετάσταση εξετάστηκε περαιτέρω. Ο πρωτογενής όγκος που σχηματίστηκε από την εμφύτευση Ε0771 στο Zc3h12d–/– ποντίκια 19,20 εμφάνισαν παρόμοιο ρυθμό ανάπτυξης με ποντίκια άγριου τύπου (Συμπληρωματικό Σχήμα S1c), υποδεικνύοντας ότι το ZC3H12D στα κύτταρα ξενιστές μπορεί να είναι ανεπαρκής κατασταλτικός όγκου της ταχείας ανάπτυξης πρωτογενούς όγκου. Ωστόσο, η μετάσταση στους πνεύμονες ήταν πιο σοβαρή σε Zc3h12d-/-παρά σε ποντίκια άγριου τύπου (Συμπληρωματικό Σχ. S1c), υπονοώντας ότι το ZC3H12D λειτούργησε ως μόριο καταστολής όγκων σε μετάσταση.

Για να διευκρινιστεί το πρότυπο εντοπισμού ZC3H12D σε ανοσοκύτταρα που διεγείρονται από έναν όγκο, η πρωτεΐνη ZC3H12D παρατηρήθηκε σε μονοπύρηνα κύτταρα περιφερικού αίματος (PBMCs) που προέρχονται από ποντίκια χωρίς όγκους και ποντίκια που φέρουν όγκο χρησιμοποιώντας κυτταρόμετρο ροής. Το ZC3H12D ανιχνεύθηκε στην κυτταρική επιφάνεια των PBMC από ποντίκια χωρίς όγκους (Εικ. 1β, επάνω). Σημειώστε ότι η ειδικότητα αυτού του αντισώματος ZC3H12D επικυρώθηκε χρησιμοποιώντας ένα νοκ άουτ δείγμα. Αντίθετα, σε PBMC από ποντικούς που φέρουν όγκο, το ZC3H12D ανιχνεύθηκε στην ενδοκυτταρική σφαίρα αλλά όχι στην κυτταρική επιφάνεια (Εικ. 1b, κάτω μέρος). Αυτή η διαμεσολαβούμενη από όγκο αλλαγή στο πρότυπο εντοπισμού ZC3H12D επιβεβαιώθηκε περαιτέρω χρησιμοποιώντας δύο άλλα αντισώματα αντι-ZC3H12D (Συμπληρωματικό Σχ. S1d). Μέσο όγκου-προσαρμοσμένο (TCM), που χρησιμοποιείται ως καλλιέργεια καρκινικών κυττάρων καθώς αναμένεται να περιέχει στοιχεία που εκκρίνονται από κύτταρα όγκου, ρυθμίζοντας το ZC3H12D προς τα πάνω 30 λεπτά μετά τη διέγερση σε λευκοκύτταρα σπληνός (Εικ. 1γ). Τρεις ώρες αργότερα, η πρωτεΐνη ZC3H12D μετακινήθηκε εντελώς μέσα στο κύτταρο (Εικ. 1γ). Επειδή το ZC3H12D θεωρείται μια πρωτεΐνη που δεσμεύει το RNA 21,22, υποψιάστηκε ότι το νουκλεϊκό οξύ ήταν ο επεξηγηματικός παράγοντας σε αυτό το φαινόμενο. Εντυπωσιακά, η προκατεργασία του TCM με RNase (TCM + RNase) δεν επηρέασε το πρότυπο εντοπισμού του ZC3H12D (Εικ. 1δ, πίνακας wt). Η προσθήκη RNA που απομονώθηκε από TCM είχε ως αποτέλεσμα το ίδιο φαινόμενο (Εικ. 1δ, πίνακας wt, στήλη RNA-TCM). Αυτά τα δεδομένα πρότειναν ότι το RNA οδηγεί τη μετατόπιση του ZC3H12D. Αντίθετα, αυτό δεν παρατηρήθηκε όταν τα σπληνικά λευκοκύτταρα από Zc3h12d-/ - χρησιμοποιήθηκαν ποντίκια (Εικ. 1δ).

ένα Περίληψη του μοντέλου πρόσληψης RNA στο οποίο το ZC3H12D συλλαμβάνει και μεταφέρει το nex-mRNA στον πυρήνα. σι Ανάλυση FACS της επιφανειακής και ενδοκυτταρικής πρωτεΐνης ZC3H12D σε PBMC που προέρχονται από ποντίκια χωρίς όγκους ή ποντίκια που φέρουν όγκο. Χρησιμοποιήθηκαν αρκετά αντισώματα αντι-ZC3H12D (με έντονη γραμμή Νο. 1 στο Σχ. 1 και Νο. 2 και 3 στο Συμπληρωματικό Σχήμα S1d) και ένα αντίσωμα ισοτύπου ελέγχου (διακεκομμένη γραμμή). ντο Κινητική της έκφρασης ZC3H12D σε σπληνικά λευκοκύτταρα μετά από διέγερση από TCM. Μπάρα, 5 μm. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Η επικύρωση του αντισώματος anti-ZC3H12D παρουσιάζεται στο Συμπληρωματικό Σχ. S10 (στρατηγική επικύρωσης και περιστροφής). ρε Κυτταρομετρική ανάλυση ροής του ZC3H12D στην επιφάνεια των σπληνικών λευκοκυττάρων που προέρχονται από άγριου τύπου και Zc3h12d–/– ποντίκια 3 ώρες μετά τη διέγερση του TCM που έλαβαν θεραπεία με DNase ή RNase. NoCM, CM ελέγχου χωρίς κύτταρα όγκου. Η προσθήκη RNase A στο TCM δεν προκάλεσε ενδοκυτταρική είσοδο του ZC3H12D (TCM + RNase). Μείωση της επιφάνειας ZC3H12D μετά την εφαρμογή καθαρισμένου RNA από TCM (RNA-TCM). Το σήμα ZC3H12D εισέρχεται Zc3h12d-/ - λευκοκύτταρα ποντικού οφείλονταν σε μη ειδική σύνδεση αντισώματος. μι Σύστημα ανίχνευσης του IL1β-mRNA χρησιμοποιώντας δύο εκκινητές RT και έναν ανιχνευτή qPCR TaqMan (πάνω). Ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο IL1β-mRNA σε πνευμονική CM καλλιεργημένη με διάφορα TCM, όπως LLC-TCM, E0771-TCM και B16-TCM, που παρουσιάζονται ως LTCM, ETCM και BTCM, αντίστοιχα (ν = 8, 8, 7 και 8 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα για NoCM, LTCM, ETCM και BTCM, αντίστοιχα). Αχνή ανίχνευση του IL1β-mRNA σε CM ήπατος που καλλιεργείται με διάφορα TCM (ν = 9 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα). φά Σχήμα απομόνωσης RNA από TCM και CM EC πνεύμονα. qPCR ανίχνευση της hIL1β-mRNA σε TCM μετά την επώαση των ανθρώπινων καρκινικών κυττάρων του μαστού, συμπεριλαμβανομένων των MCF7, MDAMB231, T47D και HCC1954 (κάτω αριστερά, ν = 3, 5, 3, 3 και 5 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα για όχι, MCF7, T47D, HCC1954 και MDAMB231, αντίστοιχα). Έκκριση του hIL1β-mRNA από EC του ανθρώπινου πνεύμονα που διεγείρεται από διάφορα TCM (κάτω δεξιά, ν = 4, 3, 6, 6, και 8 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα για όχι, MCF7, T47D, HCC1954 και MDAMB231, αντίστοιχα). «Όχι», μηδενικά καρκινικά κύτταρα. σολ Απεικόνιση απομόνωσης εξωσωματικού και εξωσώματος RNA. η Αναλογία μη εξωσωματικού RNA (εξωεξοσωματικό RNA) σε σύγκριση με εξωσωμικό RNA σε MDAMB231-TCM. Εγώ Αναλογία εξωσωματικού RNA σε σύγκριση με RNA εξωσώματος σε μέσο καλλιέργειας πνεύμονα ποντικού με CM ή TCM ελέγχου. ι Ανάλυση qPCR μετά από άμεση παγίδευση μη ειδικού mRNA από σφαιρίδια πρωτεΐνης ZC3H12D. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται στο γράφημα. Επαναλαμβανόμενα δεδομένα πειράματος που σχετίζονται με ρε και ηι φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχ. S9. Στα γραφήματα, μέσοι όροι ± SEM και τα αποτελέσματα του Student's t-Εμφανίζονται δοκιμαστικές ή μονόδρομες ANOVA. ο Π οι τιμές φαίνονται στο σχήμα. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

Μη ειδική ιντερλευκίνη-1β (IL1β) -mRNA ανιχνεύθηκε σε TCM πνεύμονα

Το περιβάλλον που σχετίζεται με τον όγκο περιέχει εξωκυτταρικό RNA (exRNA) που σχετίζεται με μικροκυστίδια, εξωσώματα και ριβονουκλεοπρωτεΐνες (RNPs) 23,24. Με βάση τα δεδομένα ότι το TCM προκάλεσε την απόκριση που εξαρτάται από το RNA της θέσης ZC3H12D (Εικ. 1δ), υποτέθηκε ότι κάποιο συγκεκριμένο exRNA 23 συνδέεται με το ZC3H12D. Επειδή το exRNA θα πρέπει να εκτεθεί σε πρωτεΐνη ZC3H12D στα λευκοκύτταρα, οι συγγραφείς προσπάθησαν να εξετάσουν ποιο μη φυσαλιδώδες exRNA (nex-RNA) αυξήθηκε στο μικροπεριβάλλον του πνεύμονα που διεγείρεται από έναν όγκο. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση μικροσυστοιχίας στο EC TCM του πνεύμονα. Τα 20 κορυφαία ταξινομημένα γονίδια παρατίθενται στον Συμπληρωματικό Πίνακα S2. Οι συγγραφείς έψαξαν στη συνέχεια για διαφορές mRNA στην έκφραση μεταξύ άγριου τύπου και Zc3h12d–/– σπλήνες ποντικιού. Οι σπλήνες επιλέχθηκαν επειδή είχαν την υψηλότερη έκφραση ZC3H12D σε σύγκριση με άλλα όργανα που δοκιμάστηκαν σε αυτή τη μελέτη. Το σκεπτικό ήταν ότι τα αποτελέσματα εξάντλησης του ZC3H12D θα μπορούσαν να γίνουν αντιληπτά συγκρίνοντας άγριου τύπου και Zc3h12d–/– δεδομένα σπλήνας. Αυτή η σύγκριση αποκάλυψε ότι ανοσοσφαιρίνη κ μεταβλητή (Igkv), resistin like-γ (Retnlg), IL1β, και μεταλλοπεπτιδάση μήτρας 8 (Mmp8) τέθηκαν σε υπερρύθμιση στο Zc3h12d-/ - δείγμα (Συμπληρωματικός Πίνακας S3). Μεταξύ των γονιδίων που ρυθμίζονται προς τα πάνω, αυτή η μελέτη επικεντρώθηκε σε IL1β-mRNA επειδή αυτό το γονίδιο εμφάνισε σχετικά υψηλή έκφραση nex-RNA που προέρχεται από πνευμονικά κύτταρα που διεγείρονται από TCM (Συμπληρωματικός Πίνακας S2). Επίσης, βακτίνη επιλέχθηκε ως αρνητικός έλεγχος σε αυτή τη μελέτη επειδή βρέθηκε άφθονα στους πνεύμονες που διεγείρονται από TCM (Συμπληρωματικός Πίνακας S2) και τα επίπεδα έκφρασης δεν άλλαξαν μεταξύ άγριου τύπου και Zc3h12d-/ - ποντίκια (Συμπληρωματικός Πίνακας S3). Πρώτον, αυτή η μελέτη εξέτασε εάν IL1βΤο -mRNA ανιχνεύθηκε σε TCM πνεύμονα που παρασκευάστηκε από τη συγκαλλιέργεια δειγμάτων πνεύμονα με διάφορα TCM χρησιμοποιώντας κύτταρα μελανώματος LLC, E0771 ή B16. Για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης του IL1β-mRNA, ένας ειδικός για το γονίδιο εκκινητής (GSP) χρησιμοποιήθηκε για τη σύνθεση του πρώτου κλώνου σε ποσοτική αλυσιδωτή αντίδραση ανάστροφης μεταγραφής-πολυμεράσης (RT-qPCR Σχήμα 1e, πάνω). Στο Σχ. 1e, τα TCM πνεύμονα περιείχαν μεγαλύτερες ποσότητες IL1β-mRNA από το μη διεγερτικό CM των πνευμόνων, ενώ τα TCM του ήπατος είχαν χαμηλότερες ποσότητες από τα TCM των πνευμόνων. Για τον ποσοτικό προσδιορισμό του εξωκυτταρικού ανθρώπου (h)IL1β-mRNA, CMs συλλέχθηκαν από ανθρώπινα κύτταρα καρκίνου του μαστού, συμπεριλαμβανομένων των MCF7, MDAMB231, T47D και HCC1954 (Εικ. 1f, αριστερά). Μαζί με αυτά τα δείγματα, hIL1β-Το mRNA αναλύθηκε επίσης σε CM από ECs ανθρώπινων πνευμόνων που διεγέρθηκαν από τα προαναφερθέντα TCM (Εικ. 1f, δεξιά) επειδή το μέσο πνευμονικής καλλιέργειας ποντικού που διεγέρθηκε με TCM περιείχε ποντίκι (m)IL1β-mRNA (Σχ. 1ε). Στη συνέχεια, αυτή η μελέτη διερεύνησε εάν υπάρχει μη φυσαλιδώδης IL1β-mRNA στον ανθρώπινο καρκίνο του μαστού TCM επειδή αναφέρθηκε ότι η καλλιέργεια βλαστικών κυττάρων ανθρώπινου γλοιώματος περιείχε mRNA σε EVs και μη εξωσωματικά RNPs 24. Οι συνθήκες απομόνωσης για μη φυσαλιδώδη (που ονομάζονται εξωσωσωμικά) και κλάσματα εξωσώματος (Εικ. 1g) ορίσαμε αρχικά και τα αποτελέσματα επικυρώθηκαν από τα RPLP2, RPS8 και RPS27 TaqMan που βασίζονται σε ανιχνευτή qPCR (Εικ. 1h). Το MDAMB231-TCM περιλάμβανε περισσότερα hIL1β-mRNA στο εξωσωμικό κλάσμα παρά στο κλάσμα εξωσώματος (Εικ. 1h). Εξωσωματική mIL1β-Το mRNA στον πνεύμονα ποντικού TCM αυξήθηκε (Εικ. 1i) και θεωρήθηκε ότι είναι PolyA(+), καθώς μεταγράφηκαν αντίστροφα χρησιμοποιώντας ολιγο(dT) εκκινητή (Συμπληρωματικό Σχήμα S1e). Το GSP-RT-qPCR επιβεβαίωσε επίσης αύξηση mIL1β-mRNA στον πνεύμονα TCM (Συμπληρωματικό Σχ. S1e). Επίσης, μη φυσαλιδώδης mIL1β-Το mRNA σε ποντίκια που διεγέρθηκαν με TCM συνελήφθη απευθείας από σφαιρίδια πρωτεΐνης ZC3H12D (Εικ. 1j). Αντίθετα, το mRNA του βακτίνη, gapdh, retnlg, mmp8, και Igkv δεν εμπλουτίστηκαν με πτυσσόμενη χάντρα (Εικ. 1j mmp8 και Igkv δεν εντοπίστηκαν).

Το ZC3H12D συνδέεται με nex-IL1β-mRNA

Το αν το nex-mRNA θα μπορούσε να συνδεθεί με το ZC3H12D στην κυτταρική επιφάνεια εξετάστηκε στη συνέχεια. Το ZC3H12D χρησιμοποιήθηκε επειδή εκφράζεται σε ποντίκι RAW 264.7 κύτταρα μακροφάγου 21,25 και ανθρώπινα κύτταρα THP1 26. Για να απεικονίσετε την αλληλεπίδραση μεταξύ IL1β-mRNA και ZC3H12D πρωτεΐνη, μια mZC3H12D που υπερεκφράζει την κυτταρική σειρά RAW (ZC + RAW), και επισημάνθηκε με ισοθειοκυανική φθορίνη (FITC) IL1β-Εφαρμόστηκε mRNA. Τριάντα λεπτά μετά τη διέγερση με TCM, τα σήματα συσυντονισμού στα κύτταρα ZC + RAW ήταν πιο εμφανή (Pearson's R = 0.47 ± 0.04 ν = 3) από τα κύτταρα που διεγείρονται από το NoCM ελέγχου (Εικ. 2α, βέλος και Συμπληρωματικό Σχ. S2a). Σε κύτταρα ZC3H12D + THP1 που απομονώθηκαν με χρήση διαλογέα κυττάρων και αντισώματος anti-ZC3H12D, παρόμοια σήματα συσυντονισμού παρατηρήθηκαν μετά την εφαρμογή IL1β-mRNA-FITC (Συμπληρωματικό Σχ. S2b Pearson’s R = 0.62 ± 0.08 ν = 3). Αν υπήρχε άμεση αλληλεπίδραση μεταξύ IL1β-Διερευνήθηκε επίσης το mRNA σε πνευμονική TCM και πρωτεΐνη ZC3H12D. Μετά την εφαρμογή TCM πνεύμονα σε κύτταρα ZC + RAW, τα κύτταρα υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με υπεριώδη (UV) ακτινοβολία για να σταθεροποιηθεί το RNA στις πρωτεΐνες. Στη συνέχεια, απομονώθηκε η πρωτεΐνη ZC3H12D με ετικέτα FLAG χρησιμοποιώντας μαγνητικά σφαιρίδια anti-FLAG και η ποσότητα IL1β-Το mRNA συνδεδεμένο με τα σφαιρίδια ZC3H12D-FLAG ποσοτικοποιήθηκε με RT-qPCR. Τα δεδομένα έδειξαν ότι η πρωτεΐνη ZC3H12D εμπλουτίστηκε IL1β-mRNA σε κύτταρα ZC + RAW (Εικ. 2β). Αντίθετα, το gapdh- και βακτίνη-ο έλεγχος mRNA έδειξε λίγο εμπλουτισμό στην κατάσταση (Εικ. 2β). Άμεσες αλληλεπιδράσεις μεταξύ της πρωτεΐνης ZC3H12D και IL1β-Το mRNA διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας φασματοσκοπία συσχέτισης φθορισμού (FCS). Αυτή η τεχνική έχει χρησιμοποιηθεί για να αποδείξει μια άμεση αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-RNA in vitro 27. Οι καμπύλες συσχέτισης του επισημασμένου με φθορισμό ZC3H12D δημιουργήθηκαν παρουσία του βακτίνη- ή IL1β-mRNA (Εικ. 2γ). Η προσαρμογή της καμπύλης αποκάλυψε ότι τα δεδομένα FCS είναι ένα μείγμα τριών στοιχείων: πρωτεΐνη ZC3H12D, σύμπλεγμα ZC3H12D-RNA και συστατικό ταχείας αποσύνθεσης. Η αναλογία συμπλόκου πρωτεΐνης-RNA αξιολογήθηκε με βάση την αναλογία των στοιχείων (Εικ. 2δ). Τα δεδομένα FCS δείχνουν ότι η σταθερά διάστασης για το ZC3H12D- βακτίνη- και IL1β-Το mRNA ήταν της τάξης του 1 ηΜ. Επιβεβαιώθηκε επίσης ότι το 3′-UTR του IL1β-Το mRNA είχε άμεση αλληλεπίδραση με την πρωτεΐνη ZC3H12D (Εικ. 2e, f). Επειδή το 3′-UTR του IL1β-Το mRNA είχε διαφορετική αλληλουχία από βακτίνη-mRNA, η σύνδεση μπορεί να περιλαμβάνει μη ειδικές και ειδικές για την αλληλουχία αλληλεπιδράσεις in vitro.

ένα Αντιπροσωπευτικές εικόνες που δείχνουν τον εντοπισμό του IL1β-mRNA-FITC και ZC3H12D σε κύτταρα RAW που υπερεκφράζουν ZC3H12D (ZC + RAW) 30 λεπτά μετά τη διέγερση TCM. Η εικόνα μετά τη διέγερση από το NoCM ως μάρτυρα φαίνεται στο Συμπληρωματικό Σχήμα S2a. Εμφανίστηκαν συγχωνευμένα δεδομένα με δείκτη νήματος ακτίνης, φαλλοειδίνη και DAPI. Μπάρες, 5 μm.Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. σι Ανάλυση στυπώματος Western RAW και ZC + RAW. Αντισώματα Anti-ZC3H12D και anti-FLAG που ανιχνεύθηκαν με επισήμανση FLAG (C-term) ZC3H12D και ανοσοκαταβυθισμένο ZC3H12D μετά από εφαρμογή TCM συν UV-crosslink εμφανίζεται (επάνω). Το δέσιμο του IL1β-Το mRNA στο TCM του πνεύμονα (κάτω) έως το ZC3H12D-FLAG ανιχνεύθηκε με αναλύσεις qPCR. Οι μέσοι όροι δύο ανεξάρτητων πειραμάτων εμφανίζονται στα γραφήματα. Επαναλαμβανόμενα δεδομένα πειράματος που σχετίζονται με IL1β-RNA φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχ. S9. ντο, μι Καμπύλες αυτοσυσχέτισης που ελήφθησαν με μετρήσεις FCS της επισημασμένης πρωτεΐνης ZC3H12D απουσία και παρουσία μη επισημασμένου RNA. Η πρωτεΐνη ZC3H12D με σήμανση Alexa Fluor 488 (1 nM, διακεκομμένη γραμμή) αναμίχθηκε με διάφορες συγκεντρώσεις ποντικού IL1β-RNA (10 ηΜ, συμπαγής (κόκκινη) γραμμή) ή βακτίνη-RNA (10 nM, συμπαγής (μπλε) γραμμή) (ντο), και IL1β(3'-UTR)-RNA (5 ηΜ, στερεά (ματζέντα) γραμμή) ή IL1β(3′-UTR) -RNA (10 nM, συμπαγής (μοβ) γραμμή) (μι). ρε, φά Κλάσματα του συμπλόκου ZC3H12D-RNA σε σχέση με το συνολικό περιεχόμενο του ZC3H12D που ελήφθησαν με ανάλυση τριών συστατικών των δεδομένων αυτοσυσχέτισης. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

ZC3H12D μεταφέρει τη σύνδεσηIL1β-mRNA στον πυρήνα

Για τον προσδιορισμό της ενδοκυτταρικής κινητικής του IL1β-mRNA που συνελήφθη από το ZC3H12D, πραγματοποιήθηκαν τρισδιάστατες (3D) αναλύσεις κυττάρων χρησιμοποιώντας μια σειρά z-στοίβαξη εικόνων ομοεστιακής μικροσκοπίας. Το 5'-Cap και το 3'-Poly(A) είναι χαρακτηριστικές δομές του ευκαρυωτικού mRNA 28,29 επομένως, το γυμνό με σήμανση FITC IL1β-Το mRNA και το προϊόν προσθήκης του 5'-Cap και 3'-Poly(A) δοκιμάστηκαν σε αυτή τη δοκιμασία. Παραδόξως, και τα δύο παρατηρήθηκαν στον πυρήνα των κυττάρων ZC + RAW 3 ώρες μετά την εφαρμογή. IL1β-mRNA-Cap (+) PolyA (+)-FITC παρατηρήθηκε σαφέστερα από IL1β-mRNA-FITC στον πυρήνα, ενώ ο έλεγχος βακτίνη-mRNA-Το Cap(+)PolyA(+)-FITC δεν έδωσε σχεδόν κανένα σήμα (Εικ. 3α αριστερά). Να αξιολογήσει αν είναι εξωγενές IL1β-Το mRNA μεταφράστηκε για να τροποποιήσει λειτουργικά το κύτταρο, IL1β-mRNA με ανόητες μεταλλάξεις (IL1β-να σταματήσει-mRNA) παρασκευάστηκε. Αυτό το RNA έχει τρεις μεταλλάξεις κωδικονίου τερματισμού στην αλληλουχία κωδικοποίησης πρωτεΐνης (CDS) για να μην δημιουργήσει την πρωτεΐνη IL1β. Με ενδιαφέρο, IL1β-να σταματήσει-Το mRNA μεταφέρεται σαφώς στον πυρήνα (Εικ. 3α, δεξιά). Το ZC3H12D φάνηκε να μετακινείται σε στίγματα με βάση τα ανοσοχρώματα που έδειξαν ότι το ZC3H12D έδειξε σχετικά κυρίαρχο κόστος με SC35, έναν δείκτη στίγματος 30, και όχι με άλλους δείκτες πυρηνικού σώματος, όπως προμυελοκυτταρική λευχαιμία (PML), ινιδιαλρίνη και SFPQ για σώμα PML, πυρήνα, και paraspeckle, αντίστοιχα (Συμπληρωματικό Σχ. S2c, d). Επίσης, η κυτταρομετρική ανάλυση ροής κυττάρων THP1 αποκάλυψε ότι η έκφραση κυτταρικής επιφάνειας ZC3H12D παρατηρήθηκε στο 0,3% των κυττάρων με διέγερση CM. Αντίθετα, ο πληθυσμός μειώθηκε στο 0,1% παρουσία διέγερσης TCM. Αυτή η μείωση υποδηλώνει ότι το TCM διέγερσε την ενδοκυτταρική εσωτερικοποίηση του ZC3H12D από την κυτταρική επιφάνεια. Κύτταρα ZC3H12D + THP1 ενσωματωμένα IL1β-mRNA και IL1β-να σταματήσει-mRNA στον πυρήνα, αν και τα σήματα ήταν ασθενέστερα από ό, τι στα κύτταρα ΝΚ (Συμπληρωματικό Σχ. S3a). Για την ποσοτικοποίηση της ποσότητας του εξωτερικού RNA που μεταφέρεται στον πυρήνα, ένα χιμαιρικό IL1β-Το mRNA συντέθηκε με συνδυασμό 5′-ωIL1β-mRNA και 3′-mIL1β-mRNA (Εικ. 3β). Σημειώστε ότι ο αισθητήρας qPCR σχεδιάστηκε για να ενισχύει το hIL1β-mRNA που βρίσκεται στην περιοχή 5' αλλά όχι ενδογενή μεταγραφήματα ποντικού (πάνω, Εικ. 3β βλ. Συμπληρωματικό Σχήμα S3b για περισσότερες λεπτομέρειες). Αυτά τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι το χιμαιρικό RNA μεταφέρθηκε στον πυρήνα ανεξάρτητα από την τροποποίηση Cap ή Poly(A) (Εικ. 3b, κάτω αριστερά), αν και ανιχνεύθηκαν μικρές ποσότητες στο κυτταρόπλασμα (Εικ. 3b, κάτω δεξιά). Για να επιβεβαιωθεί η εμπλοκή του ZC3H12D σε αυτό το φαινόμενο, αυτός ο προσδιορισμός επαναλήφθηκε χρησιμοποιώντας κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + 16,31 που προέρχονται από διεγερμένα με TCM άγριου τύπου και Zc3h12d–/– ποντίκια. Ο εντοπισμός του IL1β-mRNA-FITC και IL1β-να σταματήσει-mRNA-Το FITC στον πυρήνα κυττάρων ποντικού άγριου τύπου ήταν εμφανές 3 ώρες μετά την εφαρμογή (Εικ. 3γ). Αντίθετα, υπήρχαν ελάχιστα σήματα στους πυρήνες αυτών των κυττάρων από Zc3h12d–/– ποντίκια (Εικ. 3γ).

ένα Εστιακή μικροσκοπία φθορισμού ZC + RAW μετά από εφαρμογή 10 ng/mL μη επισημασμένη IL1β-mRNA, επισημασμένο με FITC βακτίνη-mRNA, και IL1β-mRNA με ή χωρίς Cap-Poly (A) (CP). Εμφανίζονται τρισδιάστατες εικόνες (αριστερά). Ποσοτική ανάλυση του RNA-FITC στον πυρήνα (δεξιά). IL1β-να σταματήσει-Το mRNA έχει τρεις μεταλλάξεις κωδικών κωδικών στο CDS (πάνω). Το μη επισημασμένο IL1β-Το mRNA χρησιμοποιήθηκε ως βασικός έλεγχος για το σήμα FITC (ν = 5, 5, 5, 4 και 5 κελιά για μη επισημασμένα IL1β-RNA, επισημασμένο με FITC βακτίνη-RNA, gapdh-RNA, IL1β-RNA, και IL1β-stop-RNA αντίστοιχα). Δεδομένα επαναλαμβανόμενων πειραμάτων φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα S9. σι Σύστημα ανίχνευσης εξωτερικών IL1β-mRNA χρησιμοποιώντας χίμαιρα ανθρώπου-ποντικού IL1β-mRNA (IL1β-χίμαιρα) ακολουθούμενη από αντίστροφη μεταγραφή με 3′-mGSP και ανιχνευτή 5′-ανθρώπου στην ανάλυση RT-qPCR (περισσότερες λεπτομέρειες στην Συμπληρωματική Εικ. S3b). Ανίχνευση του IL1β-χημική-RNA είσοδος στο ZC + RAW. Πυρηνικό RNA και κυτταροπλασματικό Ζεστός αέρας και βακτίνη κανονικοποιημένο πυρηνικό RNA και κυτταροπλασματικό RNA, αντίστοιχα (ν = 7, 8, 8, 8 και 8 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα για 0, 30 και 120 λεπτά με IL1β-χίμαιρα, 30 και 120 λεπτά με IL1β-χίμαιρα-CP, αντίστοιχα). ντο Τρισδιάστατες εικόνες που εμφανίζονται IL1β-mRNA-FITC και IL1β-stop-mRNA-Η πρόσληψη FITC στον πυρήνα των κυττάρων B220 + CD11c + NK1.1 + που προέρχονται από άγριου τύπου διεγερμένα από TCM και Zc3h12d–/– ποντίκια 3 ώρες μετά την εφαρμογή 10 ng/mL RNA (πάνω). Ποσοτική ανάλυση των RNA-FITC στον πυρήνα των κυττάρων B220 + CD11c + NK1.1 + από ποντίκια άγριου τύπου (κάτω αριστερά, ν = 6, 4, 6, 6 και 6 κελιά για μη επισημασμένα IL1β-RNA, επισημασμένο με FITC βακτίνη-RNA, gapdh-RNA, IL1β-RNA, και IL1β-stop-RNA αντίστοιχα) και από Zc3h12d-/ - ποντίκια (κάτω δεξιά, ν = 6, 6, 6, 6 και 5 κελιά για μη επισημασμένα IL1β-RNA, επισημασμένο με FITC βακτίνη-RNA, gapdh-RNA, IL1β-RNA, και IL1β-stop-RNA αντίστοιχα). ρε Εστιακή μικροσκοπία φθορισμού ZC + RAW μετά την προσθήκη επισημασμένης με FITC βακτίνη-mRNA, πλήρους μήκους, CDS ή 3'-UTR του IL1β-mRNA (πάνω). Ποσοτική ανάλυση 10 ng/mL IL1β-Πρόσληψη πυρήνα που εξαρτάται από την περιοχή mRNA (κάτω ν = 10, 10, 11, 10 και 10 κελιά για μη επισημασμένα IL1β-RNA, επισημασμένο με FITC βακτίνη-RNA, πλήρους μήκους, CDS, και 3’UTR του IL1β-RNA, αντίστοιχα). Σε αυτήν την ανάλυση, ελήφθησαν 15 στοιβαγμένες τρισδιάστατες εικόνες από το κάτω μέρος στο πάνω μέρος του πυρήνα. Μπάρα, 5 μm. Στα γραφήματα, εμφανίζονται οι μέσοι όροι ± SEM και τα αποτελέσματα μονόδρομης ANOVA με διόρθωση Bonferroni. ο Π οι τιμές φαίνονται στο σχήμα. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

Το ZC3H12D αναγνωρίζει το 3′-UTR του IL1β-mRNA

Μια ειδική για την αλληλουχία πρόσληψη μέσω της πρωτεΐνης ZC3H12D διερευνήθηκε χρησιμοποιώντας IL1β-mRNA. Για το σκοπό αυτό, δύο επιμέρους IL1β-mRNA, ένα CDS και ένα 3′-UTR, παρασκευάστηκαν πρώτα. Το πρώτο αποτελείται από ένα σύντομο 5′-UTR και ένα CDS για να δώσει 897 nt το δεύτερο έχει μήκος 451 nt. Αυτά τα RNA δοκιμάστηκαν σε μια δοκιμασία πρόσληψης κυττάρων (Εικ. 3d). Η απορρόφηση της σήμανσης FITC IL1β-(3-UTR) -mRNA σε ZC + RAW ήταν μεγαλύτερο από αυτό του IL1β-(CDS) -mRNA (Εικ. 3δ). Επιπλέον, προεπώαση με IL1β-(3′-UTR) -mRNA εμπόδισε την πρόσληψη πλήρους μήκους με σήμανση FITC IL1β-mRNA στον πυρήνα, αλλά κανένα από τα δύο IL1β-(CDS) -mRNA ούτε βακτίνηΤο -mRNA είχε αυτό το αποτέλεσμα (Συμπληρωματικό Σχήμα S3c). Μαζί, το 3′-UTR μέσα IL1β-mRNA αναγνωρίζεται από κύτταρα ZC + RAW με τρόπο συγκεκριμένο για την περιοχή.

Ορισμένες πρωτεΐνες που δεσμεύουν RNA αναγνωρίζουν στοιχεία πλούσια σε AU (AREs) και/ή δομές βρόχου στελέχους στο 3'-UTR για τον έλεγχο της σταθερότητας του mRNA στόχου 32 . Σε αυτή τη μελέτη, μια δοκιμασία ηλεκτροφορητικής μετατόπισης κινητικότητας (EMSA) αποκάλυψε ότι το ZC3H12D συνδέεται με συγκεκριμένες θέσεις μονόκλωνου RNA (ssRNA) με 50 nt στο 3′-UTR του IL1β-mRNA (Εικ. 4a, Νο. 5 ανιχνευτής στο Σχήμα 4b και Συμπληρωματικό Σχήμα S4a). Αυτή η σύνδεση επιβεβαιώθηκε με δοκιμασία αναστολής χρησιμοποιώντας ολιγονουκλεοτίδιο ψυχρού RNA (Εικ. 4α, γ). Αυτά τα δεδομένα δείχνουν ότι το ZC3H12D αλληλεπιδρά με σχετικά μεγάλα στοιχεία γύρω από τα ARE μέσα IL1β-mRNA χωρίς τυπική ακολουθία βρόχου στελέχους. Μεταγενέστερες δοκιμασίες ανταγωνισμού αποκάλυψαν ότι η θέση σύνδεσης του ZC3H12D περιέχει μια τυπική ακολουθία πλούσια σε AU (UAUUUAU) αλλά ότι τα σύντομα θραύσματά της (20 nt) παρουσίασαν πολύ χαμηλότερες συνάφειες από το ολιγονουκλεοτίδιο 50 nt (Εικ. 4α, δ και Συμπληρωματικό Σχ. S4b) Το Στον πυρήνα, η σύνδεση αναμένεται να χαθεί υπό συνθήκες με άλλες πρωτεΐνες δέσμευσης ARE, όπως το HuR 33.

ένα Σχέδιο προσδιορισμού θέσης δέσμευσης ZC3H12D σε mIL1β-mRNA (NM_008361) 3'-UTR. Κάθε αριθμός υποδηλώνει θέση νουκλεοτιδίου. σι EMSA. ΜIL1β ανιχνευτές (ανιχνευτές EMSA 1-9 βλέπε Συμπληρωματικό Σχ. S4a για αλληλουχίες. Οι θέσεις νουκλεοτιδίων κάθε ανιχνευτή εμφανίζονται στην κορυφή) αναλύθηκαν με ή χωρίς πρωτεΐνη ZC3H12D. Οι ανιχνευτές 1–9 έχουν μήκος 50 nt και το άκρο 3' είναι σημασμένο με βιοτίνη. Το βέλος υποδεικνύει τη μετατόπιση ζώνης λόγω της δέσμευσης του hZC3H12D στον ανιχνευτή 5. ντο Δοκιμασία ανταγωνισμού EMSA. Η πρωτεΐνη ZC3H12D και ο επισημασμένος με βιοτίνη ανιχνευτής 5 (50 nM) αναμίχθηκαν με 100 φορές περίσσεια ποσότητα μη επισημασμένων ανιχνευτών 1-9 (5 μΜ). ρε Δοκιμασία ανταγωνισμού EMSA. Η πρωτεΐνη ZC3H12D και ο επισημασμένος με βιοτίνη ανιχνευτής 5 (50 nM) αναμίχθηκαν με 100 φορές περίσσεια ποσότητα των μη επισημασμένων ανιχνευτών 5-1-5-7 (5 μΜ). Οι ανταγωνιστές έχουν μήκος 20 nt και μέρος του καθετήρα 5 (Συμπληρωματικό Σχ. S4b). Το γράφημα υποδεικνύει τη σχετική ένταση της κορυφαίας ζώνης [= επάνω ζώνη / (επάνω ζώνη + κάτω ζώνη) × 100]. Η θέση της επάνω ζώνης σημειώνεται με ένα βέλος. Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

Η πρόσληψη RNA ενδέχεται να μην υποστηρίζεται από το Regnase-1

Πολλές πρωτεΐνες ZF εμπλέκονται στον ενδοκυτταρικό μεταβολισμό του RNA στην έμφυτη ανοσία 32. Μεταξύ της οικογένειας ZC3H12, το ZC3H12A (επίσης γνωστό ως Regnase-1) ρυθμίζει IL6-mRNA με δέσμευση στον βρόγχο στελέχους στο 3'-UTR 34,35,36. Επίσης, το ZC3H12D αλληλεπιδρά δυνητικά με το ZC3H12A 21. Αν το ZC3H12A είχε συνεργατική λειτουργία στην εξαρτώμενη από το ZC3H12D πρόσληψη του IL1β-Το mRNA συνεπώς διερευνήθηκε. Στα δεδομένα μικροσυστοιχίας (Συμπληρωματικός πίνακας S3), Zc3h12a επίπεδα έκφρασης στο Zc3h12d–/– ο σπλήνας ήταν κοντά σε εκείνους του άγριου τύπου σπλήνα. Εξετάστηκαν επίσης τα προφίλ γονιδιακής έκφρασης των κυττάρων B220 + CD11c + NK1.1 + NK σε πνεύμονες και ήπαρ που φέρουν όγκους. Τα στοιχεία έδειξαν ότι Zc3h12d ρυθμίστηκε σημαντικά προς τα πάνω κατά τη μετακίνηση των κυττάρων από το ήπαρ στους πνεύμονες, ενώ Zc3h12a η έκφραση ήταν σταθερή (Συμπληρωματικός Πίνακας S1) αυτό υποδηλώνει ότι δεν υπάρχει άμεση συσχέτιση μεταξύ της έκφρασης του Zc3h12a και Zc3h12dΤο Το σήμα του ZC3H12D αποκάλυψε ένα παρόμοιο μοτίβο σε κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + NK που προέρχονται από Zc3h12a –/– (Regnase-1-/-) ποντίκια και ποντίκια άγριου τύπου (Συμπληρωματικό Σχ. S5a). Ομοίως, εμφανίστηκαν κύτταρα ΝΚ που προέρχονται και από τους δύο γονότυπους IL1β-πρόσληψη mRNA στον πυρήνα (Εικ. 5α, δεξιά Συμπληρωματικό Σχ. S5b) όταν αυτά τα κύτταρα προέρχονται από Zc3h12d-/ - τα ποντίκια έχασαν ξανά την πρόσληψη (Εικ. 5α, αριστερά Συμπληρωματικό Σχ. S5b). Αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι το ZC3H12A ενδέχεται να μην εμπλέκεται στο εξαρτώμενο από το ZC3H12D σύστημα πρόσληψης σε κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + NK.

ένα Πρόσληψη RNA σε κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + που προέρχονται από άγριου τύπου, Zc3h12d-/-, και Regnase-1–/– (Zc3h12a –/–) ποντίκια 3 ώρες μετά την εφαρμογή 10 ng/mL βακτίνη-mRNA-CP-FITC και IL1β-mRNA-CP-FITC. Εμφανίζονται οι ποσοτικοποιήσεις του σήματος FITC στον πυρήνα κυττάρων B220 + CD11c + NK1.1 + (αριστερά, ν = 14, 17, 8 και 15 κύτταρα από άγριου τύπου και Zc3h12d-/ - ποντίκια για βακτίνη-RNA και IL1β-RNA, αντίστοιχα. σωστά, ν = 7, 21, 7 και 21 κύτταρα από άγριου τύπου και Regnase-1-/ - ποντίκια για βακτίνη-RNA και IL1β-RNA, αντίστοιχα 15 εικόνες στοίβας z ανά κελί). Ηλικίες του Regnase-1–/– τα ποντίκια ήταν κοντά Zc3h12d–/– ποντίκια. σι Αντιπροσωπευτική ανοσοχρώση για φωσφο-Η2ΑΧ στον πυρήνα των κυττάρων B220 + CD11c + NK1.1 + 3 ώρες μετά την πρόσληψη IL1β-mRNA-CP (κορυφή). Ποσοτική ανάλυση φωσφο-H2AX σε κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + που προέρχονται από άγριου τύπου και Zc3h12d-/ - ποντίκια 3 ώρες μετά την πρόσληψη του βακτίνη-mRNA-CP gapdh-mRNA-CP IL1β-mRNA-CP και IL1β-να σταματήσει-mRNA-CP (ν = 3 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα). Μπάρα, 5 μm. ντο Χρονική πορεία δευτερογενούς νέκρωσης σε κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + που προέρχονται από άγριου τύπου διεγερμένα από TCM και Zc3h12d-/ - (Homo) ποντίκια στην εφαρμογή 20 ng/mL RNA. βακτίνη-mRNA-CP, IL1β-mRNA-CP, και IL1β-στάση-Το mRNA-CP απεικονίστηκε ως actb, IL1b και IL1b-stop, αντίστοιχα. Η παρακολούθηση της χρωστικής φθοροσκεΐνης-DNA σε πραγματικό χρόνο υποδηλώνει την απώλεια της ακεραιότητας της μεμβράνης με αποτέλεσμα την απόπτωση όψιμου σταδίου. ρε Σύστημα ανίχνευσης παρασυρμένων πρώηνIL1β-Το mRNA δεσμεύτηκε στο Pol II σε κύτταρα ZC + RAW (αριστερά). Ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο IL1β-χίμαιρα-mRNA που σχετίζεται με το Pol II στον πυρήνα. Το αντίσωμα κατά της λουσιφεράσης (Luc) είναι ο έλεγχος (ν = 3 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα). μι ποσοτικοποιήσεις που προέρχονται από qPCR IL1rn και Dusp1 έκφραση σε πυρηνικό RNA του ZC + RAW μετά την εφαρμογή του IL1β-χίμαιρα-mRNA (ν = 5 και 6 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα στα 30 και 120 λεπτά, και ν = 12 βιολογικά ανεξάρτητα δείγματα στα 30 και 120 λεπτά για IL1rn και Dusp1, αντίστοιχα). φά ποσοτικοποιήσεις που προέρχονται από qPCR IL1rn και Σούρουπο 1 έκφραση σε κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + μετά την εφαρμογή του βακτίνη-mRNA και IL1β-mRNA. Αντιπροσωπευτικά δεδομένα φαίνονται στο γράφημα. Τα επαναλαμβανόμενα πειραματικά δεδομένα φαίνονται στο Συμπληρωματικό Σχήμα S9. Στα γραφήματα, μέσοι όροι ± SEM και τα αποτελέσματα του Student's t-Εμφανίζεται η δοκιμή (διπλής όψης) ή η μονόδρομη ANOVA με διόρθωση Bonferroni. ο Π οι τιμές φαίνονται στο σχήμα. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

Εγκλωβισμένος IL1β-mRNA στον πυρήνα μπορεί να έχει λειτουργίες

Πότε IL1β-mRNA με ή χωρίς Cap(+)PolyA(+) εφαρμόστηκε σε κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 +, IL1β-mRNA-Το Cap(+)PolyA(+)-FITC ανιχνεύθηκε με μεγαλύτερη σαφήνεια από ό IL1β-mRNA-FITC στον πυρήνα των κυττάρων B220 + CD11c + NK1.1 + από ποντίκια άγριου τύπου. Σε αντίθεση, IL1β-Το mRNA-FITC συγκεντρώθηκε έξω από τους πυρήνες του Zc3h12d-/ - ποντίκια. Είναι ενδιαφέρον ότι ορισμένα κύτταρα άγριου τύπου έδειξαν έναν ακανόνιστο πυρήνα 6 ώρες μετά την εφαρμογή 20-100 ng/mL Cap(+)PolyA(+) (Συμπληρωματικό Σχήμα S5c, 100 ng/mL). Για να αφαιρεθεί η πιθανότητα ότι αυτό το ακανόνιστο σχήμα πυρήνα οφείλεται στην προσθήκη τροποποιημένων με FITC ουσιών, παρατηρήθηκε το ίδιο φαινόμενο με τη χρήση μη ετικετοποιημένων IL1β-mRNA. Σε αυτή την περίπτωση, παρατηρήθηκε αύξηση στη φωσφορυλίωση της ιστόνης H2AX, δείκτης στρες/βλάβης του DNA 37 , στον πυρήνα των κυττάρων B220 + CD11c + NK1.1 + από ποντίκια άγριου τύπου, αλλά δεν παρατηρήθηκε σε Zc3h12d-/ - ποντίκια (Εικ. 5β). B220 + CD11c + NK1.1 + κύτταρα που προέρχονται από Regnase-1-/ - ο ποντικός παρουσίασε φωσφορυλίωση Η2ΑΧ κατά την ενσωμάτωσή του με IL1β-mRNA- Cap(+)PolyA(+) (Συμπληρωματικό Σχ. S5d). Σημειώστε ότι το H2AX εκτελεί τόσο δομικούς όσο και λειτουργικούς ρόλους στη ρύθμιση της χρωματίνης πέρα ​​από έναν ειδικό δείκτη διπλού κλώνου DNA 37. Στη συνέχεια, αυτή η μελέτη προσπάθησε να προσδιορίσει εάν η συμπαράσταση του IL1β-Το mRNA στον πυρήνα προκαλεί τον κυτταρικό θάνατο λόγω της αύξησης του κυτταρικού στρες (Εικ. 5γ). Η χρονική πορεία του κυτταρικού θανάτου μετά τη θεραπεία με βακτίνη-mRNA, IL1β-mRNA και IL1β-να σταματήσει-Το mRNA αξιολογήθηκε. Σε αυτόν τον προσδιορισμό, τα κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + NK που προέρχονται από άγριου τύπου διεγερμένα από TCM και Zc3h12d–/– τα ποντίκια εμφάνισαν μια ελαφρά αύξηση των σημάτων νέκρωσης (Εικ. 5γ). Όταν 20 ng/mL IL1β-mRNA και IL1β-να σταματήσει-Το mRNA εφαρμόστηκε σε κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + NK από άγριου τύπου, οι εντάσεις σήματος καταστέλλονται σε σύγκριση με εκείνα με βακτίνη-mRNA (Εικ. 5γ). B220 + CD11c + NK1.1 + NK κύτταρα από Zc3h12d–/– τα ποντίκια δεν έδειξαν σχεδόν καμία απόκριση για οποιοδήποτε RNA (Εικ. 5γ). Αυτό δείχνει ότι η ενσωμάτωση του IL1β-Το mRNA στον πυρήνα μπορεί να συμβάλλει στην επιβίωση των ΝΚ κυττάρων.

Είτε ενσωμάτωση του IL1β-Στη συνέχεια εξετάστηκε το mRNA στον πυρήνα που επηρεάζει τις ενδοπυρηνικές δραστηριότητες, όπως η μεταγραφή. Αυτή η μελέτη εξέτασε αρχικά αν μεταφέρθηκε πυρηνικά IL1β-Το mRNA συσχετίστηκε με την RNA πολυμεράση II (Pol II), ρυθμίζοντας την έναρξη και την επιμήκυνση της μεταγραφής του mRNA 38. Για τη διάκριση των εφαρμοσμένων IL1β-mRNA από ενδογενές IL1β-mRNA, ένας ανιχνευτής qPCR που αναστέλλει αλληλουχίες ειδικά για τον άνθρωπο σχεδιάστηκε. Μετά την εφαρμογή της χίμαιρας IL1β-mRNA σε ZC + RAW, τη μεταφερόμενη χίμαιρα IL1β-Το mRNA σταθεροποιήθηκε με υπεριώδη ακτινοβολία και καταβυθίστηκε ταυτόχρονα με αντίσωμα αντι-ΡοΙ II (Εικ. 5δ). Αυτή η μελέτη έψαξε στη συνέχεια για τις αλλαγές γονιδιακής έκφρασης που επηρεάζονται από IL1β-Πρόσληψη mRNA στα ίδια δεδομένα μικροσυστοιχίας (Συμπληρωματικός Πίνακας S3). Επιλέχθηκαν επτά γονίδια με βάση τα ακόλουθα κριτήρια που υποδηλώνουν ότι η συμπεριφορά τους είναι παρόμοια με αυτή του IL1β: ταξινομήθηκαν ως σχετιζόμενοι με τον πυρήνα από τη Gene Ontology και έδειξαν σχετικά υψηλότερο επίπεδο έκφρασης σε Zc3h12d-/-από ποντίκια άγριου τύπου στο σύνολο δεδομένων μικροσυστοιχίας (Συμπληρωματικός Πίνακας S4). Τα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης αυτών των επτά γονιδίων συγκρίθηκαν μεταξύ των κυττάρων RAW και ZC + RAW μετά από θεραπεία με IL1β-mRNA. Το qPCR αποκάλυψε ότι Σούρουπο 1 39,40 και IL1rn εκφράστηκαν σε υψηλότερα επίπεδα στο ZC + RAW από ότι στο RAW ελέγχου (Συμπληρωματικό Σχήμα S6) και το περιεχόμενο αυτών των μεταγραφών στο πυρηνικό RNA αυξήθηκε σε συνδυασμό με την πρόσληψη IL1β-mRNA (Εικ. 5ε). Επί πλέον, Σούρουπο 1 και IL1rn η έκφραση ρυθμίσθηκε προς τα πάνω σε κύτταρα Β220 + CD11c + ΝΚ1.1 + ΝΚ μετά την εφαρμογή του IL1β-mRNA (Εικ. 5στ).

ZC3H12D παγίδευση του IL1β-Το mRNA επάγει αντιμεταστατική δράση

Αν IL1β-Το mRNA προκαλεί δραστηριότητα μετανάστευσης σε κύτταρα ZC3H12D + NK επειδή διερευνήθηκε αυτά τα κύτταρα που μετανάστευσαν από το ήπαρ στους πνεύμονες σε ποντίκια που φέρουν όγκο. Τα κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + NK που προέρχονται από ποντίκια άγριου τύπου παρουσίασαν δραστηριότητα μετανάστευσης με IL1β-mRNA, αλλά όχι βακτίνη-mRNA, και αυτή η δραστηριότητα μετανάστευσης απουσίαζε στο Zc3h12d–/– κελιά ποντικιού (Εικ. 6α). Για να αποδειχθεί ότι η πρωτεΐνη ZC3H12D μπορεί να συλλάβει φυσικά παραγόμενη IL1β-mRNA, προσδιορισμοί μετανάστευσης πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας nex-RNA που απομονώθηκε από TCM. Για να επιβεβαιωθεί η επίδραση της πρωτεΐνης ZC3H12D, οι δοκιμασίες μετανάστευσης επαναλήφθηκαν χρησιμοποιώντας TCM που πέρασε από την ετικέτα ZC3H12D-FLAG συνδεδεμένη στα σφαιρίδια anti-FLAG. Σε αυτό το πείραμα, παρασκευάστηκαν TCM που πέρασαν μέσω σφαιριδίων συνδεδεμένων με πρωτεΐνη ZC3H12D [που ορίζονται ως στήλη ZC3H12D(+)] και περασμένα μέσω σφαιριδίων anti-FLAG [που ορίζονται ως στήλη ZC3H12D(–), που χρησιμοποιείται ως έλεγχος]. Το nex-RNA απομονώθηκε και από τα δύο TCM και χρησιμοποιήθηκε για τον προσδιορισμό μετανάστευσης. Αυτή η δοκιμασία μετανάστευσης αποκάλυψε ότι το nex-RNA που υπέστη επεξεργασία με τη στήλη ZC3H12D ( +) είχε μειωμένη χημειοτακτική δραστηριότητα σε σύγκριση με εκείνη της nex-RNA που υποβλήθηκε σε επεξεργασία με τη στήλη ZC3H12D (-) σε κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + NK (Συμπληρωματικό Σχ. S7a), υποδεικνύοντας ότι IL1β-Οι αλληλεπιδράσεις mRNA-ZC3H12D παίζουν ζωτικό ρόλο στη δραστηριότητα μετανάστευσης κυττάρων.

ένα Μετανάστευση κυττάρων B220 + CD11c + NK1.1 + που προέρχονται από άγριου τύπου και Zc3h12d-/ - ποντίκια έως 10 ng/mL βακτίνη-mRNA, gapdh-mRNA, IL1β-mRNA, και IL1β-να σταματήσει-mRNA (ν = 3 πηγάδια ανά ομάδα). σι Επαγωγή IFN-γ σε κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + από άγριου τύπου διεγερμένα από TCM και Zc3h12d-/ - ποντίκια μετά από επώαση με IL1β-mRNA και IL1β-να σταματήσει-mRNA. Η ποσοτική αναλογία IHN-θετικών κυττάρων IHC (ν = 3 πηγάδια ανά ομάδα). ντο Ογκοκτόνος προσδιορισμός in vitro μετά από συνεπώαση καρκινικών κυττάρων με 10 ng/mL εκκινημένα με mRNA κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 +. Η αναλογία των επισημασμένων με ροδαμίνη κυττάρων E0771 που έγιναν Zombie + νεκρά κύτταρα στον προσδιορισμό. Τα νεκρά κύτταρα E0771 αυξήθηκαν μετά από καλλιέργεια με IL1β-mRNA- και IL1β-στάση-κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + με εκκίνηση mRNA από ποντίκια άγριου τύπου που διεγείρονται από TCM και όχι κύτταρα από Zc3h12d-/ - ποντίκια (ν = 3 πηγάδια ανά ομάδα). ρε Σύστημα ογκοκτόνων προσδιορισμών. Ογκοκτόνος προσδιορισμός in vitro μετά από σύζευξη κυττάρων όγκου με κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + μετά από καλλιέργεια με BMDM που έχουν αρχίσει με IL1β-mRNA (πάνω). Για να αποκλειστούν οι άμεσες επιπτώσεις του IL1β-mRNA σε κύτταρα ΝΚ, τα BMDMs πλύθηκαν με βασικό μέσο μετά την εκκίνηση. Η αναλογία των επισημασμένων με ροδαμίνη κυττάρων E0771 που έγιναν Zombie + νεκρά κύτταρα στην ανάλυση (κάτω, ν = 4 φρεάτια ανά ομάδα). μι Αντιμεταστατικό σύστημα ανάλυσης in vivo. IL1β-Κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + που έχουν εκκινήσει με mRNA από σπλήνες ποντικού που διεγείρονται με TCM και στη συνέχεια εφαρμόζονται σε άλλο ποντικό διεγερμένο με TCM. Τα καρκινικά κύτταρα επισημασμένα με ροδαμίνη εγχύθηκαν για να εκτιμηθεί η μετάσταση. φά Μεταστατικοί αριθμοί κυττάρων LLC στους πνεύμονες με ή χωρίς προεπεξεργασία IL1β-mRNA-εκκινητοποιημένα κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + από άγριου τύπου και Zc3h12d-/ - εμφανίζονται τα ποντίκια (ν = 12 ποντίκια ανά ομάδα). Το B220 + CD11c + NK1.1 + εμφανίζεται ως Tri NK. Στα γραφήματα, μέσοι όροι ± SEM και τα αποτελέσματα του Student's t-Εμφανίζεται η δοκιμή (διπλής όψης) ή η μονόδρομη ANOVA με διόρθωση Bonferroni. ο Π οι τιμές φαίνονται στο σχήμα. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

Αυτή η μελέτη προσπάθησε να αξιολογήσει την επίδραση του IL1β-mRNA για παραγωγή IFN-γ σε κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + NK. Τα κύτταρα που προέρχονται από ποντίκια άγριου τύπου διεγέρθηκαν σαφώς από IL1β-mRNA, αλλά παρατηρήθηκε μόνο μια ασθενής επαγωγή σε κύτταρα από Zc3h12d-/ - ποντίκια (Εικ. 6β). Επιπλέον, για τον προσδιορισμό των ογκοκτόνων επιδράσεων των κυττάρων B220 + CD11c + NK1.1 + NK, τα επισημασμένα με ροδαμίνη κύτταρα Ε0771 συγκαλλιεργήθηκαν με IL1β-ΝΚ κύτταρα γεμάτα με mRNA για την καταμέτρηση νεκρών κυττάρων όγκου βαμμένα με Zombie, μια πράσινη φθορίζουσα βαφή. Σε αυτό το σύστημα δοκιμασίας, για να ληφθούν υπόψη τα αποτελέσματα της εκκίνησης RNA στα κύτταρα όγκου, τα κύτταρα ΝΚ πλύθηκαν πριν εφαρμοστούν σε κύτταρα όγκου. Αυτά τα δεδομένα αποκάλυψαν ότι IL1β-Η προετοιμασία mRNA αύξησε την ογκοκτόνο δράση των κυττάρων ΝΚ που προέρχονται από ποντίκια άγριου τύπου αλλά όχι από Zc3h12d-/ - ποντίκια (Εικ. 6γ). Και πάλι, κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + NK από Zc3h12d+/– τα ποντίκια είχαν παρόμοια ογκοκτόνο δράση (Συμπληρωματικό Σχ. S7b). Για να ελέγξετε αν IL1β-Τα μακροφάγα που έχουν αρχίσει με mRNA ενισχύουν αυτή τη δραστηριότητα, τα κύτταρα ΝΚ συζευγνύονται με μακροφάγα που προέρχονται από μυελό των οστών (BMDMs) που διεγείρονται από IL1β-mRNA (Εικ. 6d, επάνω). Και τα δυο IL1β-BMDM που έχουν εκκινήσει με mRNA που προέρχονται από άγριου τύπου και Zc3h12d-/ - τα ποντίκια δεν είχαν πρόσθετα αποτελέσματα στην ογκοκτόνο δράση in vitro (Εικ. 6δ, χαμηλότερα).

Καθώς το ZC3H12D αναγνώρισε το 3'-UTR του IL1β-mRNA, η λειτουργική περιοχή στο 3'-Το UTR εξετάστηκε περαιτέρω. Για να ορίσετε το λειτουργικό στοιχείο στο 3'-UTR του IL1β-mRNA, χωρίστηκε περαιτέρω σε τέσσερα θραύσματα που περιείχαν 150 nt, όπου κάθε θραύσμα είχε τουλάχιστον μία επικάλυψη 50 nt με τα γειτονικά του θραύσματα. Το τρίτο θραύσμα έδειξε υψηλότερη δραστηριότητα από τα άλλα στη δοκιμασία μετανάστευσης των κυττάρων B220 + CD11c + NK1.1 + NK που προέρχονται από ποντίκια άγριου τύπου, αλλά παρέμειναν απαρατήρητα από Zc3h12d–/– ποντίκια (Συμπληρωματικό Σχ. S7c). Στη συνέχεια, εξετάστηκε η ενεργοποίηση ΝΚ μέσω ZC3H12A 32,34,35, μιας υποοικογένειας πρωτεϊνών ZC3H12. Σε δοκιμασία μετανάστευσης, πλήρους μήκους και 3′-UTR IL1β-mRNA προκάλεσε χημειοτακτική δραστηριότητα σε κύτταρα ΝΚ από ποντίκια άγριου τύπου και Zc3h12a –/– (Regnase-1-/ -) ποντίκια 34, ενώ CDS IL1β-mRNA παρήγαγε σχεδόν τα ίδια επίπεδα δραστηριότητας με αυτά από το RNA ελέγχου (Συμπληρωματικό Σχ. S7d). Επιπλέον, επαγωγή IFN-γ από IL1βΤο -mRNA ήταν παρόμοιο σε κύτταρα που προέρχονταν και από τους δύο γονότυπους (Συμπληρωματικό Σχήμα S5e). Έτσι, αυτά τα δεδομένα έδειξαν ότι μια κεντρική περιοχή του 3′-UTR στο IL1β-mRNA αναγνωρίζεται με τρόπο που εξαρτάται από την πρωτεΐνη ZC3H12D.

Στον καρκίνο, η πρωτεΐνη IL1β επικρατεί στην προώθηση του όγκου σε συνδυασμό με προφλεγμονώδη ανοσοκύτταρα 41. Αν IL1β-Τα κύτταρα B220 + CD11c + NK1.1 + NK που έχουν αρχίσει με mRNA έχουν αντιμεταστατική ικανότητα in vivo διερευνήθηκε. Σε αυτό το σύστημα ανάλυσης, τα κύτταρα ΝΚ ελήφθησαν από σπλήνες ποντικού που διεγέρθηκαν με TCM και ασταρώθηκαν με συνθετικό IL1β-mRNA. Αυτά τα ΝΚ κύτταρα στη συνέχεια εφαρμόστηκαν σε άλλο διεγερμένο με TCM ποντίκι πριν από την έγχυση καρκινικών κυττάρων επισημασμένων με ροδαμίνη μέσω της φλέβας της ουράς. Για την αξιολόγηση της μετάστασης των πνευμόνων, οι πνεύμονες απομονώθηκαν μετά την ένεση και οι αριθμοί κυττάρων στους πνεύμονες μετρήθηκαν (Εικ. 6ε, μοντέλο). IL1β-mRNA-τα κύτταρα άγριου τύπου B220 + CD11c + NK1.1 + μείωσαν τον αριθμό των μεταστατικών καρκινικών κυττάρων που φθάνουν στους πνεύμονες (Εικ. 6στ). Σε αντίθεση, IL1β-αρχικοποιημένα με mRNA κύτταρα ΝΚ από Zc3h12d–/– τα ποντίκια έχουν μόνο ένα ελαφρύ αντικαρκινικό αποτέλεσμα (Εικ. 6στ, γράφημα).

Το ανθρώπινο κύτταρο ΝΚ έχει ZC3H12D-IL1β-άξονα mRNA

Το αν το hZC3H12D παίζει σημαντικό ρόλο στο σύστημα πρόσληψης mRNA ερευνήθηκε. Το hZC3H12D έχει δύο εναλλακτικά ματισμένα γονιδιακά προϊόντα 26: το ένα είναι μακράς μορφής (58 kDa: hZC58), η πρωταρχική δομή του οποίου είναι πολύ παρόμοια με εκείνη της πρωτεΐνης ποντικού και το άλλο είναι βραχείας μορφής (36 kDa: hZC36), η οποία στερείται τομέα τερματικού C. Αυτές οι δύο ισομορφές μοιράζονται τους τομείς σύνδεσης RNA και ZF, αλλά η περιοχή πλούσια σε προλίνη, η οποία θεωρείται θέση αλληλεπίδρασης για την πρωτεΐνη ZC3H12A, είναι μοναδική για το hZC58 (Εικ. 7α, πάνω). Για μια δοκιμασία πρόσληψης mRNA, τα κύτταρα 786-Ο, ανθρώπινα νεφρικά καρκινώματα που εκφράζουν σταθερά hZC58 ή hZC36, δημιουργήθηκαν για πρώτη φορά. Αυτές οι αναλύσεις IHC αποκάλυψαν ότι το ZC3H12D ήταν ευρέως κατανεμημένο στην κυτταρική μεμβράνη και το κυτταρόπλασμα των κυττάρων hZC58, ενώ βρέθηκε σε σχετικά περιορισμένη περιοχή στα κύτταρα hZC36 (Εικ. 7α, κάτω μέρος). Αυτά τα κύτταρα επωάστηκαν με επισημασμένη με FITC hIL1βIL1β-mRNA), και οι εικόνες που προέκυψαν έδειξαν ότι hIL1β-Το mRNA-FITC ανιχνεύθηκε συχνότερα στον πυρήνα των κυττάρων hZC58 παρά στα κύτταρα hZC36 (Εικ. 7β), υποδεικνύοντας ότι ο C-τερματικός τομέας του hZC58 που περιέχει την περιοχή πλούσια σε προλίνη παίζει ζωτικό ρόλο στη μεταφορά του mRNA στον πυρήνα Το Η πρόσληψη hIL1β-Το mRNA σε ανθρώπινα κύτταρα CD56 + CD3 - NK 42,43 που απομονώθηκαν από ανθρώπινα PBMCs (hPBMCs) εξετάστηκε στη συνέχεια. Σε κυτταρομετρική ανάλυση ροής, το ZC3H12D ανιχνεύθηκε στην κυτταρική επιφάνεια του 46% των κυττάρων CD56 + CD3 - NK. Με σήμανση FITC hIL1β-mRNA, αλλά όχι ελέγχου hβακτίνη-mRNA, ενσωματώθηκε στον πυρήνα των κυττάρων CD56 + CD3 - ΝΚ (Εικ. 7c). Μικρή παρέμβαση RNA (siRNA) με τη μεσολάβηση του ZC3H12D σε κύτταρα CD56 + CD3 - NK πραγματοποιήθηκε για να διευκρινιστεί εάν η πρωτεΐνη ZC3H12D εμπλέκεται στη διαδικασία πρόσληψης κυττάρων ΝΚ. Η καταστολή των επιπέδων της πρωτεΐνης ZC3H12D με ηλεκτροδιάτρηση siRNA (Συμπληρωματικό Σχήμα S8a) μείωσε σαφώς την ώραIL1β-πρόσληψη mRNA (Σχ. 7δ) σε σύγκριση με το siRNA- ελέγχου ή ZC3H12A-siRNA-επιμολυσμένα κύτταρα. Ενεργοποίηση ΝΚ μετά την πρόσληψη της ώραςIL1β-Το mRNA εξετάστηκε. Η ανοσοχρώση IFN-γ αποκάλυψε ότι τα κύτταρα CD56 + CD3-NK αυξήθηκαν σε θετικότητα IFN-γ μετά από hIL1β-διέγερση mRNA (Εικ. 7e), και τα επίπεδα έκφρασης IFN-γ ήταν τόσο υψηλά όσο αυτά που προκλήθηκαν από ανασυνδυασμένο IL12 44 ως επαγωγέας IFN-γ για κύτταρα ΝΚ 45. Τα ανθρώπινα ΝΚ κύτταρα χωρίζονται σε δύο ξεχωριστά υποσύνολα, το CD56 bright και το CD56 dim 46, και το μικροπεριβάλλον που σχετίζεται με τον όγκο επηρεάζεται διαφορετικά σε αυτά τα κύτταρα ΝΚ στις ογκοκτόνες και πολλαπλασιαστικές λειτουργίες τους 47. Καθώς το ZC3H12D εκφράστηκε και στα δύο υποσύνολα (Συμπληρωματικό Σχήμα S8b), τα φωτεινά CD56 και CD56 αμυδρά κελιά κυττάρων ΝΚ από hPBMCs καθαρίστηκαν καιIL1β-Η πρόσληψη mRNA δοκιμάστηκε ξεχωριστά για να διαπιστωθεί ότι ήταν στο 38% των φωτεινών κυττάρων CD56 και στο 50% των CD56 αμυδρά ΝΚ κυττάρων. Για να μιμηθούν το μικροπεριβάλλον του όγκου, τα κύτταρα ΝΚ διεγέρθηκαν αρχικά με TCM που προέρχεται από κύτταρα ανθρώπινου καρκίνου του μαστού MDAMB231 και η απόκριση παραγωγής IFN-γ στη συνέχεια παρατηρήθηκε κατά την εφαρμογή της πρωτεΐνης IL-2 και/ή hIL1β-mRNA (Εικ. 7f, επάνω). Τρεις ημέρες μετά από διέγερση TCM, hIL1β-Το mRNA αλλά όχι η πρωτεΐνη IL2 αύξησε την παραγωγή IFN-γ σε CD56 αμυδρά ΝΚ κύτταρα (Εικ. 7f, κάτω αριστερά). Η δεύτερη διέγερση από hIL1β-Το mRNA προκάλεσε παραγωγή IFN-γ στο ίδιο επίπεδο με την πρώτη διέγερση (Εικ. 7στ, κάτω δεξιά Συμπληρωματικό Σχ. S8c). Αντίθετα, τα φωτεινά κύτταρα ΝΚ CD56 δεν έδειξαν επαγωγή (Συμπληρωματικό Σχήμα S8d). Ο δείκτης ενεργοποίησης κυττάρων NK, NKG2D, σε CD56 φωτεινά κύτταρα NK αυξήθηκε ελαφρώς μετά την εφαρμογή του hIL1β-mRNA (Συμπληρωματικό Σχ. S8e).

ένα Σχέδιο δύο ισομορφών συναρμογής του hZC3H12D. Οι μακριές και σύντομες μορφές κωδικοποιούν πρωτεΐνες 58 και 36 kDa, αντίστοιχα. Και τα δύο έχουν μια κοινή Ν-τερματική ακολουθία, συμπεριλαμβανομένου ενός τομέα ZF (πράσινο) και η μακρά μορφή έχει έναν τομέα πλούσιο σε προλίνη (πορτοκαλί κορυφή). Ανάλυση IHC του ZC3H12D σε μακρά μορφή (hZC58)-και σύντομης μορφής (hZC36) που εκφράζει κυψέλες 786-O (κάτω). Τα πειράματα επαναλήφθηκαν δύο φορές με παρόμοια αποτελέσματα. σι Αντιπροσωπευτικές εικόνες εστιακής μικροσκοπίας του hIL1β-mRNA-Πρόσληψη FITC στον κυτταρικό πυρήνα hZC58 ή hZC36 (πάνω). Ποσοτικά σήματα της hIL1β-mRNA-FITC στον πυρήνα κυττάρων hZC58 ή hZC36 (κάτω 3D εικόνες ανά ομάδα: ν = 38 για hZC58 και ν = 50 για hZC36). ντο Πρόσληψη του hIL1β-mRNA-FITC σε πυρήνα κυττάρων CD56 + CD3-NK 3 ώρες μετά την εφαρμογή 50 ng/mL RNA με 200 U/mL IL-2 πρωτεΐνης. Απεικόνιση ομοεστιακής μικροσκοπίας που δείχνει τον πυρήνα χρωματισμένο με DAPI σε μεμονωμένες εικόνες (πάνω) και τρισδιάστατες στοίβες που συνδυάζουν 15 εικόνες από πάνω προς τα κάτω (μέση). Οι εικόνες 3D στοίβας δείχνουν μια σύγκριση της πυρηνικής πρόσληψης μεταξύ hIL1β-mRNA και hβακτίνη-mRNA (κάτω). ρε Πυρηνικά σήματα hIL1β-mRNA-FITC σε CD56 + CD3 - ΝΚ κύτταρα που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με siRNA. Ο έλεγχος (con) είναι ένα μη στόχευση siRNA (ν = 13, 10 και 11 κελιά για έλεγχο, ZC3H12D-siRNA και ZC3H12A-siRNA, αντίστοιχα. Κάθε εικόνα κελιού αποτελείται από 15 στοιβαγμένες τρισδιάστατες εικόνες). μι Ανάλυση IHC της επαγωγής IFN -γ 48 ώρες μετά την εφαρμογή RNA με 200 U/mL IL2 σε CD56 + CD3 - ΝΚ κύτταρα. Ο θετικός έλεγχος επωάστηκε με 20 ng/mL πρωτεΐνης IL12 σε μέσο καλλιέργειας IL2 (σήματα IFN-γ από ν = 16, 21 και 20 κύτταρα ZC3H12D+ για όχι, IL1β-RNA, και πρωτεΐνη IL2, αντίστοιχα). φά Ανάλυση IHC της επαγωγής IFN-γ 3 και 6 ημέρες μετά τη διέγερση της ώραςIL1β-mRNA και πρωτεΐνη IL2 για κύτταρα CD56 αμυδρά CD3-NK που έχουν υποστεί προεπεξεργασία με MDAMB231-TCM. Εμφανίζεται το σύστημα ανάλυσης (πάνω). Χρησιμοποιήθηκαν ανεξάρτητα δύο κύτταρα ΝΚ δότη. όχι, έλεγχος βασικού μέσου καλλιέργειας (κάτω αριστερά, ν = 42, 45, 51 και 51 κελιά για όχι, IL1β-RNA, και πρωτεΐνη IL2, και IL1β-RNA συν IL2 πρωτεΐνη, αντίστοιχα. Κάτω δεξιά, ν = 34, 44, 37 και 60 κελιά για όχι, IL1β-RNA, και πρωτεΐνη IL2, και IL1β-RNA συν IL2 πρωτεΐνη, αντίστοιχα). Μπάρες, 5 μm. Στα γραφήματα, οι μέσοι όροι ± SEM και τα αποτελέσματα του Student t-εμφανίζονται δοκιμές (διπλής όψης) ή μονόδρομος ANOVA με διόρθωση Bonferroni. ο Π οι τιμές φαίνονται στο σχήμα. Τα δεδομένα προέλευσης παρέχονται ως αρχείο δεδομένων προέλευσης.

Συνοπτικά, το ZC3H12D σε κύτταρα ΝΚ συλλαμβάνει επιλεκτικά το επόμενοIL1β-Το mRNA εμπλουτίζεται στο διεγερμένο από όγκο πνευμονικό μικροπεριβάλλον και το μεταφέρει στον πυρήνα. Για τον εντοπισμό της πρωτεΐνης ZC3H12D στην κυτταρική επιφάνεια, η C-τερματική περιοχή πλούσια σε προλίνη είναι απαραίτητη, αν και είναι εκτός της θέσης σύνδεσης RNA. IL1β-Η μεταφορά του mRNA στον πυρήνα προκάλεσε τρεις λειτουργίες: (1) ενίσχυση της ογκοκτόνος δραστηριότητας με ικανότητα μετανάστευσης κυττάρων και παραγωγή IFN-γ, (2) ρύθμιση της έκφρασης αντιαποπτωτικών γονιδίων μέσω σύνδεσης με το RNA Pol II και (3) έλεγχος της επιβίωσης των ΝΚ κυττάρων και παρατεταμένη παραγωγή IFN-γ σε μικροπεριβάλλον όγκου (Εικ. 8).

Η σχετιζόμενη με τον όγκο επόμενοIL1β-mRNA 3-Το UTR παγιδεύτηκε από την πρωτεΐνη ZC3H12D στην επιφάνεια του κυττάρου ΝΚ και εισήχθη στον πυρήνα μέσω του C-τερματικού του που περιέχει μια περιοχή πλούσια σε προλίνη. Στη συνέχεια, αυτό μπορεί να ρυθμίσει την αντιαποπτωτική γονιδιακή έκφραση που σχετίζεται με το RNA Pol II και να ελέγξει τη μετανάστευση των κυττάρων ΝΚ, την επιβίωση και τη βιωσιμότητα της παραγωγής IFN-γ.


2 Εξωσώματα

Ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά σε ώριμα δικτυοερυθρά αιμοσφαίρια (ανώριμα ερυθρά αιμοσφαίρια), τα εξωσώματα είναι

Κυστίδια 40 έως 100 nm που εκκρίνονται από ένα ευρύ φάσμα τύπων κυττάρων θηλαστικών [24]. Ο όρος εξωσώμα (εκείνη την εποχή προερχόμενη από μικρο-κυστίδια) επινοήθηκε για πρώτη φορά από τους Trams et al., Στις αρχές της δεκαετίας του 1980 [25]. Τα εξωσώματα αποτελούνται από μια λιπιδική μεμβράνη διπλής στιβάδας που περιβάλλει ένα μικρό κυτταρόλυμα και στερούνται κυτταρικών οργανιδίων. Τα εξωσώματα περιέχουν διάφορα μοριακά συστατικά του κυττάρου προέλευσής τους, συμπεριλαμβανομένων πρωτεϊνών και υλικού νουκλεϊκού οξέος (όλων των τύπων RNA) [26]. Παρόλο που η σύνθεση εξωσωμικής πρωτεΐνης ποικίλλει ανάλογα με το κύτταρο και τον ιστό προέλευσης, τα περισσότερα εξωσώματα περιέχουν ένα κοινό σύνολο εξελικτικά διατηρημένων μορίων πρωτεϊνών [27]. Τα μόρια RNA στα εξωσώματα περιλαμβάνουν mRNA και πρόσφατα αναγνωρισμένα miRNA. Με τα χρόνια, οι ερευνητές μπόρεσαν να συλλάβουν τη διαδικασία βιογένεσης των εξωσωμάτων σε διαφορετικούς τύπους κυττάρων και έχουν απομονώσει με επιτυχία αυτά τα μεμβρανώδη σώματα από διάφορες πηγές, όπως το πλάσμα του αίματος [28], ο ορός [29] και τα ούρα [30].

Η βιογένεση εξωσωμάτων (συνοψίζεται σε Το Σχήμα 1) είναι μια πολύ αυστηρά ρυθμισμένη διαδικασία που διέπεται από πολλαπλά μόρια σηματοδότησης και ξεκινά με την ενεργοποίηση του υποδοχέα που είναι μοναδική για κάθε τύπο κυττάρου [31]. Για παράδειγμα, σε μονοκύτταρα και ουδετερόφιλα, είναι η ενεργοποίηση του πουρινοϋποδοχέα P2X από το ATP, στα αιμοπετάλια είναι η ενεργοποίηση του υποδοχέα της θρομβίνης και για τον βακτηριακό λιποπολυσακχαρίτη ο υποδοχέας-4 (TLR-4) στα δενδριτικά κύτταρα έχει αναγνωριστεί [3233 ]. Μορφολογικές μελέτες υποδηλώνουν ότι τα εξωσώματα προέρχονται από τη διαδρομή διαλογής του μικρο-κυστιδικού σώματος (MVB) [3435]. Τα MVBs πρώτα συγχωνεύονται με τη μεμβράνη πλάσματος και απελευθερώνουν τα κυστίδια στο εξωκυττάριο περιβάλλον ως εξωσώματα. Εν συντομία, η συσταλτική μηχανή του κυττάρου τραβά πρώτα τις αντίθετες μεμβράνες με τη βοήθεια του διαλυτού συμπλέγματος υποδοχέων πρωτεΐνης προσάρτησης NSF (ή απλά του συμπλέγματος SNARE) μαζί πριν τσιμπήσει τη σύνδεση μεμβράνης και απελευθερώσει το κυστίδιο στον εξωκυττάριο χώρο [36-40] Το

Διάγραμμα που απεικονίζει το καλά αποδεκτό μοντέλο για τη βιογένεση και την απελευθέρωση των εξωσωμάτων. Κυρίως, τα εξωσώματα προέρχονται από τα πολυφυσαλιδώδη σώματα (MVBs) τα οποία είναι γνωστά ως όψιμα ενδοσώματα (αρχικά προέρχονται από λυσοσώματα). Η δημιουργία εξωσωμάτων μπορεί να ενεργοποιηθεί από πολλούς παράγοντες, συμπεριλαμβανομένων των εξωκυττάριων ερεθισμάτων (π.χ. μικροβιακή προσβολή) και άλλων καταπονήσεων. Τα εξωσώματα μπορούν να απελευθερωθούν στο εξωκυττάριο περιβάλλον με σύντηξη MVB με την κυτταρική επιφάνεια που υποστηρίζεται από έναν αριθμό εξειδικευμένων πρωτεϊνών που ονομάζονται SNARE.

Οι μηχανισμοί απελευθέρωσης των εξωσωμάτων έχουν επίσης μελετηθεί σε βάθος. Μελέτες από τους Thery και συνεργάτες έδειξαν ότι μια σειρά πρωτεϊνών της οικογένειας Rab, συμπεριλαμβανομένων των Rab27a και Rab27b, λειτουργούν ως βασικοί ρυθμιστές της οδού έκκρισης εξωσωμάτων [41]. Το Rab27 έχει αποδειχθεί ότι εμπλέκεται στην εξέλιξη του καρκίνου και στην προώθηση του όγκου, γεγονός που παρείχε πρώιμες ενδείξεις ότι συστατικά της οδού έκκρισης εξωσωμάτων μπορεί να έχουν ρόλους στη βιολογία του όγκου [42]. Εκτός από τα Rab27a και b, μια άλλη πρωτεΐνη μέλος της οικογένειας Rab, το Rab35 έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει την έκκριση εξωσωμάτων αλληλεπιδρώντας με την πρωτεΐνη ενεργοποίησης της GTPase οικογένειας τομέα TBC1, μέλος 10A-C (TBC1D10A-C) [43].Έχει αποδειχθεί ότι η απελευθέρωση εξωσωμάτων προκαλείται από διάφορα άλλα ερεθίσματα, όπως η κεραμίδη [44] και οι αλλαγές στο pH της μεμβράνης [45]. Μελέτες έχουν επίσης δείξει ότι τα εξωσώματα μπορούν να απελευθερωθούν στο εξωκυττάριο χιλιόμετρο από το εξωτερικό εξωσωματικό και μικροκυτταρικό εκκολαπτόμενο μονοπάτι (EMV) στο οποίο εμφανίζεται εκκόλαψη/σχάση της μεμβράνης του πλάσματος [46]. Η ρύθμιση της οδού EMV είναι πολυπαραγοντική και είναι ευαίσθητη στα ενδοκυτταρικά επίπεδα ασβεστίου εξαρτάται από τη δομική σκαλωσιά του κυττάρου. Το συνοπτικό διάγραμμα του πιο αποδεκτού μοντέλου σχηματισμού εξωσωμάτων και απελευθέρωσης εξωσωμάτων είναι στο σχήμα 1.


Από το Exosome Isolation έως το Biomarker Discovery


Τα εξωσώματα είναι μικρά κυστίδια (30-150 nm) που εκκρίνονται από κύτταρα θηλαστικών και τα οποία, μαζί με το μοναδικό τους φορτίο RNA και πρωτεΐνης, έχουν γίνει το επίκεντρο πολλών ερευνών. Κρίσιμο για την περαιτέρω κατανόηση της λειτουργίας των εξωσωμάτων και των εφαρμογών τους στα διαγνωστικά και θεραπευτικά είναι η διαθεσιμότητα αντιδραστηρίων και πρωτοκόλλων για την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό τους, καθώς και για την ανάλυση του περιεχομένου τους σε RNA και πρωτεΐνη. Έχουμε αναπτύξει ένα νέο σύνολο αντιδραστηρίων που επιτρέπει μια πλήρη ροή εργασίας εξωσωμάτων-από τη γρήγορη και αποτελεσματική εξαγωγή εξωσωμάτων από μέσο καλλιέργειας κυττάρων ή ορού έως την απομόνωση και χαρακτηρισμό περιεχομένου εξωσωμικού RNA χρησιμοποιώντας προσδιορισμό αλληλουχίας επόμενης γενιάς.

Μικρά κυστίδια με τεράστιες δυνατότητες

Τα εξωσώματα είναι μικρά κυστίδια που πιστεύεται ότι περιλαμβάνουν RNA και πρωτεϊνικά μόρια που εκκρίνονται από όλους τους τύπους κυττάρων θηλαστικών σε καλλιέργεια και επίσης απαντώνται φυσικά στα υγρά του σώματος συμπεριλαμβανομένου του αίματος, του σάλιου, των ούρων και του μητρικού γάλακτος. Ο ακριβής μοριακός μηχανισμός έκκρισης και πρόσληψής τους, καθώς και η σύνθεση, το φορτίο και οι λειτουργίες τους, μόλις αρχίζουν να αποκαλύπτονται [1]. Αρχικά θεωρούνταν «σακούλες σκουπιδιών» που χρησιμοποιούσαν τα κύτταρα για να απαλλαγούν από περιττά μακρομόρια, τα εξωσώματα θεωρούνται τώρα ως ειδικά εκκριμένα κυστίδια που επιτρέπουν τη διακυτταρική επικοινωνία [2]. Μελέτες έχουν δείξει ότι τα εξωσώματα μπορούν να μεταφέρουν mRNA και miRNA μεταξύ κυττάρων και ότι το μεταφερόμενο RNA είναι λειτουργικό στη νέα του θέση [3].

Αντιδραστήρια Ολικής Απομόνωσης Εξωσωμάτων

Η απομόνωση εξωσωμάτων από το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και τα σωματικά υγρά είναι επί του παρόντος μια κουραστική, δύσκολη και μη ειδική διαδικασία που απαιτεί υπερφυγοκέντρηση [4]. Για να απλοποιήσουμε και να συντομεύσουμε τη διαδικασία απομόνωσης εξωσωμάτων, έχουμε αναπτύξει δύο διαφορετικά Αντιδραστήρια Ολικής Εξώσωσης Απομόνωσης που επιτρέπουν την απλή και αξιόπιστη συγκέντρωση άθικτων εξωσωμάτων από μέσο καλλιέργειας κυττάρων ή ορό αίματος. Δένοντας μόρια νερού, τα αντιδραστήρια αναγκάζουν τα λιγότερο διαλυτά συστατικά (δηλαδή τα εξωσώματα) να βγουν από το διάλυμα, επιτρέποντάς τους να συλλεχθούν μετά από ένα σύντομο βήμα φυγοκέντρησης χαμηλής ταχύτητας. Η διαδικασία επιτρέπει την ανάκτηση σημαντικού αριθμού μικροσωματιδίων στο τυπικό εύρος μεγέθους εξωσωμάτων 30-150 nm, με κατανομή μεγέθους συγκρίσιμη με εκείνη των εξωσωμάτων που απομονώνονται με υπερφυγοκέντρηση (Φιγούρα 1).


Σχήμα 1. Ανάλυση εξωσωμάτων που ανακτήθηκαν από ανθρώπινο ορό αίματος χρησιμοποιώντας το Αντιδραστήριο Ολικής Εξώσωσης Απομόνωσης ή ένα πρωτόκολλο υπερφυγοκέντρησης.
Τα εξωσώματα εξήχθησαν από ορό ανθρώπινου αίματος χρησιμοποιώντας (ΕΝΑ) Αντιδραστήριο ολικής απομόνωσης εξωσώματος ή (ΣΙ) μια διαδικασία υπερφυγοκέντρησης «homebrew» [4] και αναλύθηκε στο όργανο NanoSight® LM10. Και τα δύο πρωτόκολλα παράγουν εξωσώματα με συγκρίσιμη κατανομή μεγέθους: όλα τα νανοσωματίδια είναι μικρότερα από 300 nm, με την πλειοψηφία

Το κιτ απομόνωσης ολικού εξωσώματος RNA και πρωτεΐνης

Το Total Exosome RNA and Protein Isolation Kit σχεδιάστηκε για την απομόνωση RNA και πρωτεΐνης από ένα εμπλουτισμένο παρασκεύασμα εξωσώματος. Ένα παρασκεύασμα εναιωρήματος εξωσωμάτων διαιρείται σε δύο δείγματα το ένα χρησιμοποιείται για κοινές μεθόδους ανάλυσης πρωτεΐνης όπως στύπωμα γουέστερν και το άλλο χρησιμοποιείται για οργανική εκχύλιση ακολουθούμενο από καθαρισμό φίλτρου από ίνες γυαλιού του συνολικού RNA. Οι μέγιστες αποδόσεις υπερκαθαρού RNA μπορούν να παρασκευαστούν σε περίπου 30 λεπτά και είναι κατάλληλες για μελέτες έκφρασης RNA (συμπεριλαμβανομένου miRNA), επεξεργασίας ή λειτουργίας. Το RNA μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί σε μια ποικιλία μεταγενέστερων εφαρμογών, συμπεριλαμβανομένης της RT-PCR, της ανάλυσης αλληλουχιών (π.χ., χρησιμοποιώντας ένα Ion Personal Genome Machine® (PGM ™), Ion Proton or, ή SOLiD® System), ενίσχυση RNA, αναλύσεις μικροσυστοιχιών και υβριδισμού διαλύματος και στυπώματος.

Αλληλουχία και ανάλυση εξωσωμικού RNA

Το εξωσωματικό RNA που εκχυλίζεται χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο Total Exosome Isolation Reagent μπορεί να αναλυθεί με αλληλούχιση και στη συνέχεια να συγκριθεί με το RNA από τα «γονικά» δείγματα (κύτταρα ή ορός από τον οποίο προήλθαν τα εξωσώματα). Μικρές βιβλιοθήκες RNA μπορούν να παρασκευαστούν χρησιμοποιώντας το Ion Total RNA-Seq Kit v2, με ορισμένες τροποποιήσεις πρωτοκόλλου για την αντιμετώπιση των σχετικά χαμηλών ποσοτήτων και μικρών μεγεθών (<200 nt) εξωσωματικού RNA. Μόλις δημιουργηθούν οι βιβλιοθήκες, μπορούν να αναλυθούν με τη χρήση του Ion PGM ™ Sequencer και των τυπικών πρωτοκόλλων.

Μετά τον προσδιορισμό της αλληλουχίας, συγκρίναμε το περιεχόμενο RNA των εξωσωμάτων που εξήχθησαν από το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας HeLa και από τον ορό με αυτό των αντίστοιχων γονικών δειγμάτων τους (κύτταρα HeLa και ολόκληρος ορός). Τα εξωσώματα βρέθηκαν να περιέχουν έναν ποικίλο πληθυσμό RNA, συμπεριλαμβανομένων των miRNA, mRNA, rRNA και άλλων μικρού RNA (snoRNA και άλλο ncRNA). Συνολικά, το εξωσωμικό φορτίο και για τους δύο τύπους δειγμάτων αντικατοπτρίζει το περιεχόμενο RNA των γονικών κυττάρων - ως προς τις ακολουθίες και τα επίπεδα έκφρασης - για πολλούς στόχους (Σχήμα 2), υποδηλώνοντας ότι το εξωσωματικό RNA θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως σημαντικό διαγνωστικό εργαλείο. Παρ 'όλα αυτά, ορισμένα miRNA, tRNA, ncRNA και mRNA δείχνουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα μεταξύ του εξωσωμικού και του γονικού δείγματος (Εικόνα 3), το οποίο μπορεί να οδηγήσει στην ταυτοποίηση δεικτών ειδικών για τα εξωσώματα.


Επιλογές πρόσβασης

Αποκτήστε πλήρη πρόσβαση στο περιοδικό για 1 έτος

Όλες οι τιμές είναι ΚΑΘΑΡΕΣ τιμές.
Ο ΦΠΑ θα προστεθεί αργότερα στο ταμείο.
Ο υπολογισμός του φόρου θα οριστικοποιηθεί κατά το ταμείο.

Αποκτήστε περιορισμένο χρονικό διάστημα ή πλήρη πρόσβαση στο άρθρο στο ReadCube.

Όλες οι τιμές είναι ΚΑΘΑΡΕΣ τιμές.


Βιβλιογραφικές αναφορές

Ratajczak, J., Wysoczynski, M., Hayek, F., Janowska-Wieczorek, Α., & Ratajczak, M. Z. (2006). Μικροσωματίδια που προέρχονται από μεμβράνη: Σημαντικοί και υποτιμημένοι διαμεσολαβητές της επικοινωνίας κυττάρου σε κύτταρο. Λευχαιμία, 20, 1487–1495

Ratajczak, J., Miekus, K., Kucia, M., Zhang, J., Reca, R., Dvorak, P., & amp Ratajczak, M. Z. (2006). Τα μικροκυστίδια που προέρχονται από εμβρυϊκά βλαστοκύτταρα επαναπρογραμματίζουν αιμοποιητικούς προγονικούς: Στοιχεία για οριζόντια μεταφορά mRNA και παροχή πρωτεΐνης. Λευχαιμία, 20(5), 847–856

Deregibus, Μ. C., Cantaluppi, V., Calogero, R., Lo Iacono, Μ., Tetta, C., Biancone, L., et αϊ. (2007). Τα μικροκυστίδια που προέρχονται από ενδοθηλιακά προγονικά κύτταρα ενεργοποιούν ένα αγγειογενετικό πρόγραμμα στα ενδοθηλιακά κύτταρα με μια οριζόντια μεταφορά mRNA. Αίμα, 110, 2440–8. 22

Valadi, H., Ekström, K., Bossios, A., Sjöstrand, M., Lee, J. J., & amp Lötvall, J. O. (2007). Η μεσολάβηση εξωσωμάτων μεταφορά mRNAs και microRNAs είναι ένας νέος μηχανισμός γενετικής ανταλλαγής μεταξύ των κυττάρων. Nat Cell Biol, 9, 654–9. 26

Skog, J., Würdinger, T., van Rijn, S., Meijer, D. H., Gainche, L., SenaEsteves, M., et al. (2008). Τα μικροκυστίδια γλοιοβλαστώματος μεταφέρουν RNA και πρωτεΐνες που προάγουν την ανάπτυξη του όγκου και παρέχουν διαγνωστικούς βιοδείκτες. Φύση Κυτταρική Βιολογία, 10, 1470–1476

Quesenberry, P. J., Aliotta, J., Deregibus, M. C., & Camussi, G. (2015). Ο ρόλος των κυστιδίων που φέρουν εξωκυτταρικό RNA στη διαφοροποίηση και τον επαναπρογραμματισμό των κυττάρων. Έρευνα βλαστικών κυττάρων και θεραπεία ενισχυτή, 6, 153

Bruno, S., Chiabotto, G., Favaro, E., Deregibus, M. C., & amp Camussi, G. (2019). Ο ρόλος των εξωκυττάριων κυστιδίων στη βιολογία των βλαστοκυττάρων. American Journal of Physiology. Φυσιολογία κυττάρων, 317, C303–C313


Από το Exosome Isolation έως το Biomarker Discovery


Τα εξωσώματα είναι μικρά κυστίδια (30-150 nm) που εκκρίνονται από κύτταρα θηλαστικών και τα οποία, μαζί με το μοναδικό τους φορτίο RNA και πρωτεΐνης, έχουν γίνει το επίκεντρο πολλών ερευνών. Κρίσιμο για την περαιτέρω κατανόηση της λειτουργίας των εξωσωμάτων και των εφαρμογών τους στα διαγνωστικά και θεραπευτικά είναι η διαθεσιμότητα αντιδραστηρίων και πρωτοκόλλων για την απομόνωση και τον χαρακτηρισμό τους, καθώς και για την ανάλυση του περιεχομένου τους σε RNA και πρωτεΐνη. Έχουμε αναπτύξει ένα νέο σύνολο αντιδραστηρίων που επιτρέπει μια πλήρη ροή εργασίας εξωσωμάτων-από τη γρήγορη και αποτελεσματική εξαγωγή εξωσωμάτων από μέσο καλλιέργειας κυττάρων ή ορού έως την απομόνωση και χαρακτηρισμό περιεχομένου εξωσωμικού RNA χρησιμοποιώντας προσδιορισμό αλληλουχίας επόμενης γενιάς.

Μικρά κυστίδια με τεράστιες δυνατότητες

Τα εξωσώματα είναι μικρά κυστίδια που πιστεύεται ότι περιλαμβάνουν RNA και πρωτεϊνικά μόρια που εκκρίνονται από όλους τους τύπους κυττάρων θηλαστικών σε καλλιέργεια και επίσης απαντώνται φυσικά στα υγρά του σώματος συμπεριλαμβανομένου του αίματος, του σάλιου, των ούρων και του μητρικού γάλακτος. Ο ακριβής μοριακός μηχανισμός έκκρισης και πρόσληψής τους, καθώς και η σύνθεση, το φορτίο και οι λειτουργίες τους, μόλις αρχίζουν να αποκαλύπτονται [1]. Αρχικά θεωρήθηκαν ως «σακούλες σκουπιδιών» που χρησιμοποιούνται από τα κύτταρα για να απαλλαγούν από περιττά μακρομόρια, τα εξωσώματα θεωρούνται τώρα ως ειδικά εκκρινόμενα κυστίδια που επιτρέπουν τη διακυτταρική επικοινωνία [2]. Μελέτες έχουν δείξει ότι τα εξωσώματα μπορούν να μεταφέρουν mRNA και miRNA μεταξύ των κυττάρων και ότι το μεταφερόμενο RNA είναι λειτουργικό στη νέα του θέση [3].

Αντιδραστήρια Ολικής Απομόνωσης Εξωσωμάτων

Η απομόνωση εξωσωμάτων από το μέσο κυτταρικής καλλιέργειας και τα σωματικά υγρά είναι επί του παρόντος μια κουραστική, δύσκολη και μη ειδική διαδικασία που απαιτεί υπερφυγοκέντρηση [4]. Για να απλοποιήσουμε και να συντομεύσουμε τη διαδικασία απομόνωσης των εξωσωμάτων, έχουμε αναπτύξει δύο διαφορετικά αντιδραστήρια ολικής απομόνωσης εξωσωμάτων που επιτρέπουν την απλή και αξιόπιστη συγκέντρωση ανέπαφων εξωσωμάτων από το μέσο κυτταροκαλλιέργειας ή τον ορό αίματος. Συνδέοντας μόρια νερού, τα αντιδραστήρια αναγκάζουν λιγότερο διαλυτά συστατικά (δηλ. Εξωσώματα) έξω από το διάλυμα, επιτρέποντάς τους να συλλεχθούν μετά από ένα σύντομο βήμα φυγοκέντρησης χαμηλής ταχύτητας. Η διαδικασία επιτρέπει την ανάκτηση σημαντικού αριθμού μικροσωματιδίων στο τυπικό εύρος μεγέθους εξωσωμάτων 30-150 nm, με κατανομή μεγέθους συγκρίσιμη με εκείνη των εξωσωμάτων που απομονώνονται με υπερφυγοκέντρηση (Φιγούρα 1).


Σχήμα 1. Ανάλυση εξωσωμάτων που ανακτήθηκαν από ανθρώπινο ορό αίματος χρησιμοποιώντας το Αντιδραστήριο Ολικής Εξώσωσης Απομόνωσης ή ένα πρωτόκολλο υπερφυγοκέντρησης.
Τα εξωσώματα εξήχθησαν από ανθρώπινο ορό αίματος χρησιμοποιώντας (ΕΝΑ) Αντιδραστήριο ολικής απομόνωσης εξωσωμάτων ή (ΣΙ) μια διαδικασία υπερφυγοκέντρησης «homebrew» [4], και αναλύθηκε στο όργανο NanoSight® LM10. Και τα δύο πρωτόκολλα παράγουν εξωσώματα με συγκρίσιμη κατανομή μεγέθους: όλα τα νανοσωματίδια είναι μικρότερα από 300 nm, με την πλειοψηφία

Το σετ Total Exosome RNA και Protein Isolation Kit

Το κιτ απομόνωσης ολικού εξωσώματος RNA και πρωτεΐνης σχεδιάστηκε για την απομόνωση RNA και πρωτεΐνης από ένα εμπλουτισμένο παρασκεύασμα εξωσωμάτων. Ένα επαναιωρημένο παρασκεύασμα εξωσώματος χωρίζεται σε δύο δείγματα το ένα χρησιμοποιείται για κοινές μεθόδους ανάλυσης πρωτεϊνών όπως το στύπωμα western και το άλλο χρησιμοποιείται για οργανική εκχύλιση που ακολουθείται από καθαρισμό ολικού RNA με φίλτρο ινών υάλου. Οι μέγιστες αποδόσεις υπερκαθαρού RNA μπορούν να παρασκευαστούν σε περίπου 30 λεπτά και είναι κατάλληλες για μελέτες έκφρασης RNA (συμπεριλαμβανομένου του miRNA), επεξεργασίας ή λειτουργίας. Το RNA μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί σε μια ποικιλία κατάντη εφαρμογών, συμπεριλαμβανομένης της RT-PCR, του προσδιορισμού αλληλουχίας (π.χ., χρησιμοποιώντας μια μηχανή προσωπικού γονιδιώματος ιόντων® (PGM™), συστήματος ιόντων Proton™ ή SOLID®), ενίσχυση RNA, αναλύσεις μικροσυστοιχιών και υβριδισμός διαλύματος και κηλίδας.

Αλληλουχία και ανάλυση εξωσωμικού RNA

Το εξωσωμικό RNA που εξάγεται χρησιμοποιώντας το πρωτόκολλο Total Exosome Isolation Reagent μπορεί να αναλυθεί με προσδιορισμό αλληλουχίας και στη συνέχεια να συγκριθεί με RNA από τα «γονικά» δείγματα (κύτταρα ή ορός από τα οποία προήλθαν τα εξωσώματα). Μικρές βιβλιοθήκες RNA μπορούν να παρασκευαστούν χρησιμοποιώντας το Ion Total RNA-Seq Kit v2, με ορισμένες τροποποιήσεις πρωτοκόλλου για την αντιμετώπιση των σχετικά χαμηλών ποσοτήτων και μικρών μεγεθών (& lt200 nt) εξωσωμικού RNA. Μόλις δημιουργηθούν οι βιβλιοθήκες, μπορούν να αναλυθούν με τη χρήση του Ion PGM ™ Sequencer και των τυπικών πρωτοκόλλων.

Μετά την αλληλουχία, συγκρίναμε το περιεχόμενο RNA εξωσωμάτων που εξήχθησαν από το μέσο καλλιέργειας κυττάρων HeLa και από τον ορό με αυτό των αντίστοιχων γονικών δειγμάτων τους (κύτταρα HeLa και ολόκληρος ορός). Τα εξωσώματα βρέθηκαν να περιέχουν έναν ποικίλο πληθυσμό RNA, συμπεριλαμβανομένων των miRNA, mRNA, rRNA και άλλων μικρού RNA (snoRNA και άλλο ncRNA). Συνολικά, το εξωσωματικό φορτίο και για τους δύο τύπους δειγμάτων αντικατοπτρίζει την περιεκτικότητα σε RNA των γονικών κυττάρων - όσον αφορά τις αλληλουχίες και τα επίπεδα έκφρασης - για πολλούς στόχους (Σχήμα 2), υποδηλώνοντας ότι το εξωσωμικό RNA θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως σημαντικό διαγνωστικό εργαλείο. Παρ 'όλα αυτά, ορισμένα miRNA, tRNA, ncRNA και mRNA δείχνουν σημαντικές διαφορές στα επίπεδα μεταξύ του εξωσωμικού και του γονικού δείγματος (Εικόνα 3), το οποίο μπορεί να οδηγήσει στην αναγνώριση ειδικών δεικτών για τα εξωσώματα.


Συζήτηση

Έχει αποδειχθεί ότι ένα επιλεκτικό υποσύνολο RNA εξέρχεται από τα κύτταρα, στο εξωκυτταρικό περιβάλλον, μέσω έκκρισης κυστιδίων όπως εξωσωμάτων [17, 19, 28]. Ως εκ τούτου, υπάρχουν μεγάλες διαφορές μεταξύ της περιεκτικότητας σε RNA των εξωσωμάτων και των μητρικών τους κυττάρων, για παράδειγμα, τα εξωσώματα στερούνται 18S και 28S rRNA [17, 28-31], ενώ το 80% του κυτταροπλασμικού RNA στα ευκαρυωτικά κύτταρα είναι rRNA [53]. Ωστόσο, δεν έχει ακόμη παρουσιαστεί οριστικός μηχανισμός που να αποκαλύπτει τους βασικούς παράγοντες που εμπλέκονται στην επιλεκτική φόρτωση των κυτταροπλασματικών RNA σε εξωσώματα ή τον τρόπο με τον οποίο ρυθμίζεται αυτή η διαδικασία. Πρέπει να υπάρχει ένας μηχανισμός μεταφοράς στα κύτταρα για να φορτώσει το φορτίο RNA στα εξωσώματα. Για αυτό, υποθέτουμε ότι η διαδικασία μεταφοράς RNA σε εξωσώματα συμβαίνει πιθανότατα μέσω της δράσης ορισμένων RBP.

Χρησιμοποιώντας ταυτοποίηση και χαρακτηρισμό πρωτεΐνης υψηλής απόδοσης, άλλοι ερευνητές έχουν εντοπίσει νουκλεοπρωτεΐνες σε εξωσώματα που αναφέρονται στη Vesiclepedia [54]. Με βάση τις αναλύσεις REMSA και LC-MS/MS, εντοπίσαμε RBPs σε εκχυλίσματα εξωσωμάτων που ήταν ικανά να αλληλεπιδράσουν με RNA κυττάρου, miRNA κυττάρου και esRNA (Σχ. 1Β και Εικ. 2). Επειδή το κυρίαρχο κυτταρικό περιεχόμενο, δηλαδή το rRNA (80-85%) [53], απουσιάζει σχεδόν εντελώς στα εξωσώματα [17], χρησιμοποιήσαμε επιλεκτικά μόνο το κλάσμα κυτταρικού miRNA και κυτταρικού mRNA των γονικών κυττάρων για σύγκριση. Τα ολικά εξωσωματικά εκχυλίσματα πρωτεΐνης επωάστηκαν τόσο με κυτταρικό RNA όσο και με εξωσωματικό-RNA. Παρατηρήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις τους και ταυτοποιήθηκαν τα RBP. Οι εξωσωμικές πρωτεΐνες που συνδέονται με το κυτταρικό RNA, δηλαδή τα εξωσωματικά-RBPs θα μπορούσαν να έχουν διπλό σκοπό: (i) οι ιδιότητες σύνδεσης RNA ορισμένων πρωτεϊνών μπορούν να διατηρηθούν μόλις μεταφερθούν σε εξωσώματα, παρά τις μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις που πιθανότατα καθορίζουν τον υποκυτταρικό εντοπισμό τους [ 55] και (ii) μόλις τα εξωσωματικά-RBP μεταφερθούν σε άλλα κύτταρα μέσω εξωσωμάτων και απελευθερωθούν στο κύτταρο-δέκτη, αυτές οι πρωτεΐνες μπορεί να είναι σε θέση να αλληλεπιδράσουν με τα RNA-στόχους τους στα κύτταρα-δέκτες. Τα αποτελέσματα που παρουσιάζονται εδώ υποδεικνύουν ότι αρκετές εξωσωματικές πρωτεΐνες θα μπορούσαν να αλληλεπιδράσουν με RNA από κύτταρα (δηλ. κύτταρο-miRNA και κύτταρο-mRNA) και με RNA σε εξωσώματα (esRNA).

Η πιθανή εμπλοκή εξωσωματικών RBP σε μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις και μεταφορά RNA

Σε αυτή τη μελέτη, εντοπίσαμε 30 RBPs σε εξωσώματα που ήταν σε θέση να συνδεθούν με είδη κυτταρικού RNA και esRNA. Από αυτά τα 30 RBPs, είκοσι εξωσωματικά RBPs δεσμεύτηκαν στο esRNA (12 είναι επιλεκτικά στο esRNA και 8 κοινά) 14 στο cell-mRNA και 9 στο cell-miRNA, ενώ τέσσερα RBPs ήταν κοινά μεταξύ των τριών ομάδων (Σχήμα 2Γ και Πίνακας 2). Ωστόσο, δεν υπάρχει σαφής εικόνα πόσα RBPs μπορεί να υπάρχουν σε εξωσώματα και μπορεί να έχουμε χάσει τον εντοπισμό όλων των RBP σε αυτά τα EV, ειδικά τα RBP που εκφράζονται ελαφρώς σε εξωσώματα ή συνδέονται με λίγους αριθμούς μορίων RNA. Μεταξύ των συγκεκριμένων εξωσωματικών-RBP που εντοπίσαμε, περίπου το 90% έχει ήδη αναφερθεί σε πρωτεομικές μελέτες διαφορετικών τύπων εξωσωμάτων [56–62]. Τριάντα από τα εξωσωματικά RBP είναι συστατικά συμπλεγμάτων RNP που είναι γνωστό ότι εκτελούν κυτταρικές λειτουργίες που σχετίζονται με διάφορα στάδια του μεταβολισμού του RNA, όπως η ωρίμανση, η μεταφορά και η μετάφραση. Τα περισσότερα από τα αναγνωρισμένα γνωστά RBPs χαρακτηρίζονται από πολλαπλούς εντοπισμούς σε κυτταρικά διαμερίσματα και πολύπλευρες λειτουργίες. Αξιοσημείωτα, εντοπίσαμε έναν αριθμό εξωσωματικών-RBP που είναι μέλη της οικογένειας hnRNP που απαντάται παντού, συγκεκριμένα, hnRNPA2B1, hnRNPD, hnRNPH1, hnRNPK, hnRNPE1, hnRNPM, hnRNPU και hnRNPUL1 Αυτές οι πρωτεΐνες εμπλέκονται στο μεταβολισμό του RNA και οδηγούν τα προ-mRNA μέσω των βημάτων ωρίμανσής τους από τον πυρήνα στο διαμέρισμα του κυτταροπλάσματος, συμπεριλαμβανομένης της μετα-μεταγραφικής ρύθμισης, της εναλλακτικής συγκόλλησης, της μεταφοράς και του εντοπισμού [63]. Ενώ όλα τα μέλη της οικογένειας hnRNP εντοπίζονται στον πυρήνα, ένας αριθμός (μι.σολ., hnRNPA2, hnRNPH1, hnRNPK, hnRNPE1 και hnRNPUL1) μπορεί να παίζουν ρόλο στη μεταφορά νουκλεοκυτταροπλασματικού RNA υπό συγκεκριμένες συνθήκες [64-67]. Επιπλέον, το hnRNPH1 είναι σε θέση να δεσμεύει άμεσα pri-miRNA μόρια και να προάγει την επεξεργασία pri-miRNA, επομένως, εμπλέκεται άμεσα στην ωρίμανση του miRNA [67]. Παράγοντες όπως η επεξεργασία RNA με τη μεσολάβηση hnRNPH1, είναι σημαντικοί για τη διασφάλιση της σωστής αναλογίας μεταξύ του προ-miRNA και του ώριμου miRNA [67].

Επιπλέον, εντοπίσαμε έναν αριθμό RBP σε εξωσώματα που εμπλέκονται στην ωρίμανση του tRNA και του μικρού πυρηνικού RNA (snoRNA). Ανιχνεύσαμε το ELAC2, το οποίο καταλύει την αφαίρεση του 3 ρυμουλκούμενου από τα πρόδρομα tRNA, οδηγώντας στην παραγωγή tRF-1001 [68], καθώς και το MOCS3, το οποίο εμπλέκεται στη θειολίωση του tRNA, και το RUVBL1, το οποίο παίζει σημαντικό ρόλο τη συναρμολόγηση και τη σταθερότητα των snoRNA [69]. Επιπλέον, τέσσερα μέλη της οικογένειας συνθετάσης αμινοακυλο-tRNA (IARS, DARS, EPRS και RARS) ταυτοποιήθηκαν σε εξωσώματα. Η κύρια λειτουργία αυτών των πρωτεϊνών είναι να καταλύσουν την αντίδραση αμινοακυλίωσης κατά τη μετάφραση [70]. Εντοπίσαμε επίσης τις πρωτεΐνες TUFM (μεταφραστική παράμετρος Tu, μιτοχονδριακή) και πρωτεΐνες EEF1A1 (ευκαρυωτική μετάφραση επιμήκυνση 1) σε εξωσώματα, και οι δύο παίζουν βασικό ρόλο στη μετάφραση. αμινοακυλο tRNA στα ριβοσώματα. Η αλληλεπίδραση μεταξύ αυτών των δύο πρωτεϊνών εμποδίζει την απελευθέρωση του EEF1A1 και οδηγεί σε μεταφραστική σίγαση [71]. Η παρουσία πρωτεϊνών εντός εξωσωμάτων που εμπλέκονται στην ωρίμανση του tRNA και του snoRNA δεν ήταν εκπληκτική επειδή τα εξωσώματα περιέχουν πληθώρα ncRNA που είναι σε θέση να συνδεθούν με πρωτεΐνες Αργοναυτών για να σχηματίσουν συμπλέγματα σιγής που προκαλούνται από RNA (RISC) [18, 72, 73]. Εντοπίσαμε επίσης το GNB2L1, ένα βασικό συστατικό του ριβοσώματος, σε εξωσώματα. Αυτή η πρωτεΐνη λειτουργεί ως μοριακός προσαρμογέας που είναι σε θέση να στρατολογήσει μια ποικιλία ρυθμιστών της μετάφρασης mRNA, όπως συμπλέγματα σίγασης που προκαλούνται από miRNA και διευκολύνει τις αλληλεπιδράσεις αυτών των ρυθμιστών με τον μεταφραστικό μηχανισμό κατά τη διάρκεια διαφόρων βημάτων μετάφρασης [74]. Επιπλέον, ένας αριθμός RBP που ανιχνεύθηκαν σε εξωσώματα (HSP90AB1, HSP1A, HSPD και HSPA8) ανήκουν στην οικογένεια των πρωτεϊνών θερμικού σοκ. Παρόλο που αυτή η κατηγορία πρωτεϊνών δεν έχει αναγνωρισμένους ειδικούς τομείς σύνδεσης RNA, παίζουν ρόλο στη σίγαση γονιδίου που προκαλείται από miRNA. Πράγματι, αρκετές πρωτεΐνες θερμικού σοκ βρίσκονται σε σύμπλοκα με πρωτεΐνες Argonaute [75].Το σύμπλεγμα Hsc70 (HSPA8)-HSP90 είναι απαραίτητο για τη συναρμολόγηση RISC και παίζει άμεσο ρόλο στη φόρτωση των miRNAs στα RISC [76].

Στο πλαίσιο της δικτύωσης και μετα-μεταγραφικών τροποποιήσεων (Εικ. 3), πρόσφατα στοιχεία δείχνουν ότι οι μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις του RNA θα μπορούσαν να είναι σχετικές για την ταξινόμηση του RNA σε εξωσώματα [44, 77]. Η 3' αδενυλίωση των miRNAs έχει συσχετιστεί με ενδοκυτταρική κατακράτηση ενώ οι ουριδυλιωμένες ισομορφές εμπλουτίζονται σε κλάσματα εξωσώματος [77]. Αυτό θα μπορούσε να υποδηλώσει ότι ο συγκεκριμένος υποκυτταρικός εντοπισμός πρωτεϊνών που τροποποιούν το RNA μπορεί να έχει αντίκτυπο στη διαλογή του RNA. Επιπλέον, οι μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις μπορούν να συμβάλουν στη διαλογή συγκεκριμένων συνόλων miRNA σε εξωσώματα, π.χ. miR-2909, ενώ η φύση της μετα-μεταγραφικής τροποποίησης του miR-2909 θα μπορούσε να συμβάλει στην επιλεκτική κατανομή της κινάσης αδενοσίνης μεταξύ των καρκινικών κυττάρων και των εκκρινόμενων εξωσωμάτων τους [ 78].

Η δικτύωση και η παρουσία μετα-μεταγραφικών τροποποιητών RBP που εντοπίζονται στα εξωσώματά μας (Εικ. 3) θα μπορούσε να συνεργαστεί (θα μπορούσε να συνεργαστεί) για να καθορίσει τους προαναφερθέντες ρόλους στη διαλογή RNA σε εξωσώματα. Όσον αφορά τη μετα-μεταγραφική τροποποίηση και τη γονιδιακή σύνθεση στο εξωσωμικό περιβάλλον, υπάρχουν ήδη ορισμένες ενδείξεις ότι το εξωσωμικό πρωτεώμα εμπλουτίζεται σε πρωτεΐνες που εμπλέκονται σε τέτοιες διαδικασίες [79]. Για παράδειγμα, πρόσφατα αποδείχθηκε ότι τα εξωσώματα περιέχουν πρωτεΐνες που σχετίζονται με τη σύνθεση RNA, τη μετάφραση και την τροποποίηση πρωτεΐνης, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτές οι πρωτεΐνες μπορεί να μεταφραστούν από τα mRNA αφού συσκευαστούν σε εξωσώματα. Δεδομένου ότι μηχανήματα επεξεργασίας RNA θα μπορούσαν να υπάρχουν σε εξωσώματα [9, 80], η ύπαρξη αρκετών εξωσωματικών πρωτεϊνών δείχνει περαιτέρω τη σχέση τους με το RNA και τον μηχανισμό σύνθεσης και επεξεργασίας πρωτεϊνών, υποδηλώνοντας ότι τα εξωσώματα φιλοξενούν όχι μόνο μηχανήματα έτοιμων προς χρήση πρωτεϊνών αλλά και mRNA που μπορεί να μεταφραστεί εάν είναι απαραίτητο [79]. Επιπλέον, τα mRNA δεν μπορούσαν μόνο να λειτουργήσουν σε κύτταρα στόχους αλλά και να εκφραστούν στα εξωσώματα μετά την έκκριση [79]. Δεδομένου ότι έχει αναφερθεί εκτενώς τα τελευταία χρόνια ότι τα εξωσώματα μεταφέρουν πρωτεΐνες και νουκλεϊκά οξέα μεταξύ των κυττάρων και μπορεί στη συνέχεια να είναι σε θέση να ρυθμίζουν την έκφραση γονιδίων στα κύτταρα δέκτες. Η παρουσία τροποποιητών μετά τη μεταγραφή στα εξωσώματα μπορεί να βοηθήσει στη σταθεροποίηση της μετατόπισης (μεταφοράς) RNA μεταξύ των κυττάρων και των επιγενετικών δραστηριοτήτων στα κύτταρα λήπτες.

Η βασική πρωτεΐνη που ανιχνεύθηκε από τις αναλύσεις μας ήταν η MVP, ένα κύριο συστατικό του συμπλέγματος θησαυροφυλακίου, μια ορφανή πρωτεΐνη που ανήκει σε μια εξαιρετικά διατηρημένη πανταχού παρούσα κατηγορία RNP αγνώστων λειτουργιών (θησαυροφυλάκια). Αυτή η πρωτεΐνη είναι ένα RNP πολλών υπομονάδων που μαζί με άλλες πρωτεΐνες σχηματίζει ένα μεγάλο μακρομοριακό σύμπλεγμα, ένα χαρακτηριστικό κοίλο σχήμα που μοιάζει με βαρέλι [81]. Λόγω του χαρακτηριστικού σχήματος και της υποθετικής λειτουργίας του (νουκλεοκυτταροπλασματική μεταφορά RNA) [81], υποθέτουμε ότι ο MVP μπορεί όχι μόνο να μεταφέρει το RNA σε εξωσώματα, αλλά θα μπορούσε επίσης να εμπλακεί στη μεταφορά του esRNA σε άλλα κύτταρα μέσω εξωσωμάτων. Αρκετές άλλες RBP με πολλαπλούς εντοπισμούς βρέθηκαν επίσης σε εξωσώματα, συμπεριλαμβανομένων των NCL και SNW/SKIP. Το NCL εμπλέκεται στην ωρίμανση και την επεξεργασία του rRNA και έχει την ικανότητα να συνδέεται με κυτταροπλασματικά mRNAs, οδηγώντας σε μετα-μεταγραφική ρύθμιση, στην προώθηση της σταθερότητας του RNA και στη ρύθμιση της μετάφρασης στο κυτταρόλυμα [82-85]. Το NW/SKIP είναι ένας παράγοντας ματίσματος που εμπλέκεται στη ρύθμιση της σύνθεσης του mRNA [86].

Ο πιθανός ρόλος των αναγνωρισμένων RBP στη μεταφορά των RNA στα εξωσώματα: Η MVP είναι σημαντική πρωτεΐνη

Οι διαφορές μεταξύ της παρουσίασης κυτταρικών και esRNAs δείχνουν ότι τα esRNAs δεν συσκευάζονται τυχαία σε εξωσώματα αλλά μάλλον πρέπει να υπάρχει ένας αυστηρά ρυθμισμένος μηχανισμός διαλογής που να παρέχει σε αυτά τα κυστίδια ένα υποσύνολο RNA, κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσής τους. Έχει αποδειχθεί ότι όλα τα RNA εντός των κυττάρων δεν είναι γυμνά, αλλά συνδέονται με RBPs, καθώς και οι σχετιζόμενες με αυτές πρωτεΐνες (συνδετικοί εταίροι), που επηρεάζουν το μεταβολισμό τους καθώς και τις ενδο-διαμεριστικές μετατοπίσεις. Αυτό υποδηλώνει ότι το esRNA πρέπει να συζευχθεί με πρωτεΐνες (δηλαδή πρέπει να υπάρχουν ως σύμπλοκα RNP).

Εντοπίσαμε RBP σε εξωσώματα που ήταν σε θέση να αλληλεπιδράσουν με διαφορετικά είδη RNA. Η εκτίμησή μας είναι ότι: (α) δεδομένου ότι τα RBPs βρέθηκαν συνδεδεμένα με τα σχετικά RNA τους, αυτά τα RBP δεν καταλήγουν μόνο σε εξωσώματα, αλλά μαζί με μόρια RNA ως σύμπλεγμα RNA και ριβονουκλεοπρωτεϊνών και (β) παρουσία RBP σε Τα εξωσώματα θα μπορούσαν να είναι για σκοπούς όπως η διατήρηση των RNA εντός των εξωσωμάτων και η μεταφορά αυτού του RNA σε άλλα κύτταρα - το επονομαζόμενο εξωσωμικό λεωφορείο RNA (esRNA) [17].

Αν και, τα RBPs έχουν αναφερθεί ότι ρυθμίζουν τη βιογένεση εξωσωμάτων, ο ρόλος τους στη διαλογή RNA σε εξωσώματα μόλις πρόσφατα αρχίζει να διερευνάται [27, 33, 44, 45]. Παρόλα αυτά, οι μηχανισμοί μέσω των οποίων τα κυτταροσολικά σύμπλοκα RBP-RNA αναγνωρίζονται από τα MVB και φορτώνονται σε εξωσώματα παραμένουν άγνωστοι. Στη μελέτη μας, η παρουσία RBP σε εξωσώματα υποδηλώνει ότι, παρόμοια με τα κύτταρα, τα εξωσώματα περιέχουν RNA συνδεδεμένα με τις συγγενείς πρωτεΐνες τους. Αυτά τα RBP μπορεί να είναι σημαντικά για τη μοίρα και τη λειτουργία των esRNAs, συμπεριλαμβανομένης της συσκευασίας τους σε εξωσώματα, τη σταθερότητα και τη διατήρησή τους για την παράδοσή τους στα κύτταρα λήπτες. Για την αξιολόγηση των πιθανών ρόλων των RBP στη συσκευασία RNA σε εξωσώματα, έξι μεταγραφές γονιδίων, που κωδικοποιούν RBPs που εντοπίζονται σε εξωσώματα (HSP90AB1, XPO5, hnRNPH1, hnRNPM, hnRNPA2B1 και MVP), αποσιωπήθηκαν στα μητρικά κύτταρα (το XPO5 εντοπίστηκε μόνο σε ένα από τα κύτταρα) τα αντίγραφα αλλά και πάλι συμπεριλήφθηκε μεταξύ των γονιδίων που αποσιωπήθηκαν, ωστόσο δεν περιλαμβάνεται στον Πίνακα 2). Τέσσερα από τα έξι επιλεγμένα RBP περιέχουν μια γνωστή λειτουργική περιοχή δέσμευσης RNA (Πίνακας 2) και είναι γνωστό ότι εμπλέκονται σε διαφορετικά στάδια του μεταβολισμού του RNA, συμπεριλαμβανομένης της μεταφοράς, του ματίσματος και της ωρίμανσης. Αξιοσημείωτα, τα αποτελέσματά μας αποκάλυψαν ότι η εκλεκτική σίγαση του κυτταροπλασματικού MVP μείωσε σημαντικά την ποσότητα του συνολικού RNA στα εξωσώματα (Εικ. 4), υποδεικνύοντας τον πιθανό ρόλο του MVP στη μεταφορά RNA από κύτταρα σε εξωσώματα. Επιπλέον, μετά τον προσδιορισμό έλξης προς τα κάτω, η ποσοτικοποίηση του RNA που είχε συν-εκλουστεί με MVP έδειξε ότι η ποσότητα του esRNA που υπάρχει στο MVP-έκλουσμα ήταν σημαντικά υψηλότερη από το esRNA από μη επιμολυσμένα κύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι αυτό δείχνει ότι το MVP είναι συμπλεγμένο με υψηλότερα επίπεδα εξωσωματικών RNA από τα εξωσώματα από μη επιμολυσμένα κύτταρα (Σχ. 5Β και 5Γ). Στο τρέχον σενάριο, τα αποτελέσματά μας δείχνουν ότι ο MVP είναι σημαντικός για τη μεταφορά του RNA στα εξωσώματα, ωστόσο, ποια είδη RNA αλληλεπιδρούν με το MVP σε αυτά τα εξωσώματα μένει να απαντηθεί. Μελέτες έχουν δείξει ότι το πιο άφθονο είδος RNA σε εξωσώματα είναι το θόλο RNA (vRNA) και ότι αυτό το RNA συνδέεται με το MVP [87]. Σύμφωνα με αυτήν την παρατήρηση, υποθέτουμε ότι η σίγαση MVP θα μπορούσε να εμποδίσει τη συσκευασία του vRNA και επομένως τη μείωση του ολικού RNA στα εξωσώματα (Σχήμα 4Δ). Ωστόσο, εκτός από το RNA θολωτού που βρέθηκε σε εξωσώματα, η παρουσία αρκετών άλλων ειδών κωδικοποίησης και ncRNA έχει αναφερθεί σε εξωσώματα [3, 88]. Ο MVP μπορεί να συμβιβαστεί με πολλούς από αυτούς. Για παράδειγμα, πρόσφατα, έχει αποδειχθεί ότι το MVP αλληλεπιδρά με το miR-193a, ενώ το νοκ-άουτ του MVP οδηγεί σε συσσώρευση miR-193a στα εξωσωματικά κύτταρα δότη αντί για τα εξωσώματα [89]. Έχει επίσης προταθεί ότι διαφορετικοί τύποι κυττάρων μπορούν να χρησιμοποιούν RBP με ξεχωριστές προτιμήσεις σύνδεσης για να εκκρίνουν συγκεκριμένα υποσύνολα miRNA, και ίσως άλλες κατηγορίες RNA, σε εξωσώματα [33]. Συνολικά, το MVP θα μπορούσε να είναι ένας σημαντικός παράγοντας στη μεταφορά του RNA στα εξωσώματα, ωστόσο, περαιτέρω μελέτες μπορεί να δικαιολογήσουν τους υποκείμενους μηχανισμούς.

Παραδόξως, μετά τη σίγαση του hnRNPH1 η ποσότητα του RNA στα εξωσώματα αυξήθηκε σε σύγκριση με τον αρνητικό έλεγχο (Σχήμα 4Β). Αυτός ο αντίστροφος συσχετισμός του hnRNPH1 με την ποσότητα του esRNA μπορεί να υποτεθεί με τρόπο που αυτή η πρωτεΐνη θα μπορούσε να είναι σημαντική στον βρόχο ανατροφοδότησης για να διατηρήσει τα επίπεδα του κυτταροπλασματικού RNA (ενδοκυτταρική κατακράτηση του RNA) εμποδίζοντας τη μεταφορά του RNA σε εξωσώματα. Ωστόσο, τα τρέχοντα δεδομένα σχετικά με το hnRNPH1 προέρχονται από δύο βιολογικά αντίγραφα και εάν αυτή η πρωτεΐνη έχει πιθανό ρόλο στην κατακράτηση κυτταροπλασματικού RNA θα χρειαζόταν περαιτέρω επικύρωση.

Εκτός από τη μείωση του ολικού εξωσωματικού RNA μετά τη σίγαση MVP, η σίγηση του hnRNPA2B1 προκάλεσε επίσης μια ελαφρά μείωση του ολικού RNA που υπάρχει στα εξωσώματα, αλλά σε μη σημαντικό επίπεδο ≈13% (Σχήμα 4Β). Πρόσφατα, μια μελέτη εντόπισε το ρόλο του sumoylated hnRNPA2B1 στη μεταφορά συγκεκριμένων υποσυνόλων miRNAs σε εξωσώματα από κύτταρα Jurkat [44]. Ωστόσο, στα πειράματά μας, εντοπίσαμε το hnRNPA2B1 στις δοκιμασίες σύνδεσης από εξωσωματικές πρωτεΐνες και κυτταρικά mRNAs ή εξωσωμικό RNA, καθώς και δοκιμασίες σύνδεσης που περιείχαν κυτταρικές πρωτεΐνες και κυτταρικά miRNAs/mRNA, αλλά δεν μπορούσαμε να το προσδιορίσουμε σε δοκιμασίες που περιέχουν εξωσωμικές πρωτεΐνες και κυτταρικά -miRNAs (Σχήμα 2Γ). Αυτή η ασυμφωνία του hnRNPA2B1 στη μεταφορά συγκεκριμένων υποσυνόλων των miRNAs σε εξωσώματα μπορεί να οφείλεται σε στερεό εμπόδιο που προκαλείται από τα σουμοϋλιωμένα κατάλοιπα στο hnRNPA2B1 που εμποδίζουν την αλληλεπίδραση πρωτεΐνης/RNA στην επιφάνεια των Dynabeads. Εάν τα miRNA μεταφέρονται στα εξωσώματα με αυτήν την τροποποιημένη μορφή της πρωτεΐνης, η οποία είναι κυρίαρχη αλλά όχι αποκλειστική στα εξωσώματα, θα μπορούσαμε να έχουμε εντοπίσει τις αλληλεπιδράσεις που λαμβάνουν χώρα μεταξύ των RNA και της κανονικής μορφής της πρωτεΐνης (μη σουμοϋλιωμένες). Εναλλακτικά, η αλληλεπίδραση μεταξύ του hnRNPA2B1 και των RNA -στόχων του μπορεί να είναι συγκεκριμένη και να στοχεύει σε ορισμένα μόρια miRNA που δεν μπορούν να ανιχνευθούν με τη μέθοδο που χρησιμοποιείται εδώ. Ωστόσο, περαιτέρω μελέτες μπορεί να αποκλείσουν αυτές τις αποκλίσεις.

Ο πιθανός μηχανισμός μεταφοράς του εξωσωματικού RNA

Αφού έδειξε τις αλληλεπιδράσεις εξωσωματικών-RBP με διαφορετικά είδη RNA, δείχνει ότι το RNA που βρίσκεται στα εξωσώματα συνδυάζεται με RBPs (δηλαδή υπάρχουν ως σύμπλοκα RNP) που εντοπίσαμε στη μελέτη μας (Σχήμα 1Β)και προσδιόρισε τα RBP από αυτές τις αλληλεπιδράσεις (Εικ. 2). Ωστόσο, σε ποιο στάδιο τα σύμπλοκα RNP-RNA εισάγονται σε εξωσώματα-κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης των κυστιδίων και ποιοι είναι οι υποκείμενοι μηχανισμοί παραμένει ασαφές.

Εδώ, υποθέτουμε δύο εύλογες οδούς για τη μεταφορά των RNA στα εξωσώματα κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης αυτών των κυστιδίων από σώματα πολλαπλών κυστιδίων (MVBs) (Εικ. 6). Στο πρώτο μοντέλο, τα σύμπλοκα πρωτεϊνών RNA (RNP) θα μπορούσαν να χρησιμοποιήσουν έναν εκκολαπτόμενο μηχανισμό από πυρηνικό περίβλημα (ΝΕ) για να συσκευαστούν σε κυστίδια που ονομάζονται κόκκοι «esRNA-πρωτεΐνης». Οι κόκκοι πρωτεΐνης esRNA θα μπορούσαν να συγχωνευθούν και να εισέλθουν σε MVB σχηματίζοντας ενδιάμεσα κυστίδια, τα οποία αργότερα ωριμάζουν σε ενδοαυλικά κυστίδια MVB. Μια παρόμοια διαδικασία έχει περιγραφεί στο Δροσόφιλα για την ύπαρξη κοκκίων RNP από τον πυρήνα στη νευρομυϊκή σύνδεση. Συγκεκριμένα, οι κόκκοι RNP συγχωνεύονται με την εσωτερική πυρηνική μεμβράνη και εμφανίζονται στον πυρηνικό φάκελο. Στη συνέχεια, οι οφθαλμοί που περιέχουν RNP θα μπορούσαν να μεταναστεύσουν στο κυτταρόπλασμα με σύντηξη με την εξωτερική πυρηνική μεμβράνη [90]. Ομοίως προτείνουμε ότι, στο πρώτο βήμα της συσκευασίας esRNA, οι κόκκοι RNP (δηλ. σύμπλοκο esRNA-πρωτεΐνη) μπορεί να σχηματίσουν ένα ενδιάμεσο κυστίδιο μέσα στα MVBs, με εκβλάστηση προς τα μέσα - παρόμοια με την εκβλάστηση της πυρηνικής μεμβράνης. Τα ενδιάμεσα κυστίδια ωριμάζουν και μετατρέπονται σε ενδοαυλικά κυστίδια μέσα στο MVB. Κατά τη σύντηξη του MVB με την πλασματική μεμβράνη, τα ενδοαυλικά κυστίδια (εξωσώματα) θα απελευθερωθούν έξω που περιέχουν σύμπλοκα RNA-RNPs στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Στο δεύτερο μοντέλο (Σχ. 6, δεξιά πλευρά), σύμπλοκα RNA-πρωτεΐνης (RNPs)-που μεταφέρονται μέσω συμπλέγματος πυρηνικών πόρων (NPC)-έλκονται από τη θέση εσωτερικοποίησης / πρωτεΐνες υποδοχέα που θα μπορούσαν να μεσολαβήσουν προς τα μέσα εκκολαπτόμενους MVBs, για να σχηματίσουν ενδοαυλικά κυστίδια. Κατά τη σύντηξή τους με τη μεμβράνη πλάσματος, οι MVB απελευθερώνουν τα ενδοαυλικά κυστίδια ως εξωσώματα που περιέχουν σύμπλοκα RNA -RNPs στο εξωκυτταρικό περιβάλλον.

Δύο υποθετικές διαδρομές (ΕΝΑ και ΣΙ) για τη συσκευασία συμπλεγμάτων RNA -πρωτεΐνης (RNPs) σε εξωσώματα κατά τη διάρκεια της βιοσύνθεσης αυτών των κυστιδίων από τα πολυποικίδια σώματα (MVBs): (ΕΝΑ) Οι κόκκοι RNP δηλ. Τα σύμπλοκα RNA-πρωτεΐνης που πρόκειται να συμπεριληφθούν σε εξωσώματα (που ονομάζεται σύμπλεγμα esRNA-πρωτεΐνης) χρησιμοποιούν έναν εκκολαπτόμενο μηχανισμό για να εισέλθουν σε ενδοαυλικά κυστίδια MVB ως κόκκους RNA-πρωτεΐνης. Κάνοντας αυτό, πρώτα, σχηματίζουν ένα ενδιάμεσο κυστίδιο μέσα στα MVBs, με εκβλάστηση προς τα μέσα – έναν μηχανισμό παρόμοιο με την εκβλάστηση πυρηνικού περιβλήματος (NE), όπως φαίνεται από το [90-92]. Τα ενδιάμεσα κυστίδια ωριμάζουν και μετατρέπονται σε ενδοαυλικά κυστίδια μέσα στο MVB. Κατά τη σύντηξη του MVB με την μεμβράνη πλάσματος, τα ενδοαυλικά κυστίδια (εξωσώματα) θα απελευθερωθούν έξω περιέχοντας σύμπλοκα RNA-RNPs στο εξωκυτταρικό περιβάλλον. Στο δεύτερο μοντέλο (σι) Τα σύμπλοκα RNA-πρωτεΐνης (RNPs) - που μεταφέρονται μέσω συμπλόκου πυρηνικών πόρων (NPC) - έλκονται στη θέση εσωτερίκευσης που έχει διαφορετικούς υποδοχείς-πρωτεΐνες που θα μπορούσαν να μεσολαβήσουν προς την εσωτερική εκβλάστηση των MVBs, για να σχηματίσουν ενδοαυλικά κυστίδια. Κατά τη σύντηξη με την πλασματική μεμβράνη, τα MVB απελευθερώνουν τα ενδοαυλικά κυστίδια (εξωσώματα) που περιέχουν σύμπλοκα RNA-RNPs στο εξωκυτταρικό περιβάλλον.

Πρόσφατες μελέτες έχουν δείξει τη συμμετοχή τόσο της εκβλάστησης του NE όσο και του NPC στη μεταφορά των RNPs από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα [91, 92]. Υποθέτουμε ότι τα RNP μετά την εκκολαπτόμενη ΝΕ μπορούν να ακολουθήσουν περαιτέρω τον παρόμοιο εκκολαπτόμενο σε MVB. Ωστόσο, για την επικύρωση αυτών των διαδρομών θα απαιτηθούν περαιτέρω μελέτες.

Συνοψίζοντας, λαμβάνοντας υπόψη τον ρόλο των RBP στη μεταφορά και το μεταβολισμό RNA και τον πρόσφατα αναφερόμενο ρόλο τους στην ταξινόμηση RNA σε εξωσώματα, είναι πρωταρχικής σημασίας να κατανοήσουμε ποια RBPs είναι ζωτικής σημασίας για τη συσκευασία του RNA σε εξώσωμα. Αυτό αυξάνει επίσης τη δυνατότητα εμπλοκής των RBP στη διατήρηση του RNA σε εξωσώματα για επαρκείς περιόδους ώστε να διευκολύνουν τη μεταφορά άθικτου εξωσωμικού RNA σε κύτταρα -δέκτες για να διασφαλιστεί η λειτουργική μεταφορά του RNA. Για το σκοπό αυτό, τα δεδομένα μας αναφέρουν πολλά RBP (ιδίως MVP) σε εξωσώματα και ανοίγουν περαιτέρω δρόμους για τη διερεύνηση των υποκείμενων μηχανισμών. Ωστόσο, τα δεδομένα μας δεν δείχνουν τα συγκεκριμένα μοτίβα αλληλουχίας των ειδών MVP και esRNA. Δεδομένου ότι ο σχηματισμός καθώς και η σίγαση των συμπλεγμάτων MVP-RNA έχουν επικυρωθεί και επαληθευτεί σε όλες τις ανεξάρτητες δοκιμασίες και τουλάχιστον σε δύο κυτταρικές σειρές (HTB-177 και HEK293F), η απουσία αλληλουχίας RNA για την εύρεση δεσμευτικού μοτίβου δεν αλλάζει το συμπέρασμά μας ότι ο MVP παίζει σημαντικό ρόλο στη μεταφορά RNA σε εξωσώματα. Ο Shurtleff και οι συνεργάτες του έχουν προτείνει ότι διαφορετικοί τύποι κυττάρων μπορούν να χρησιμοποιούν RBP με ξεχωριστές προτιμήσεις σύνδεσης για να εκκρίνουν miRNAs, και ίσως άλλες κατηγορίες RNA, σε εξωσώματα. Οι συγγραφείς έχουν επίσης προτείνει ότι ορισμένοι τύποι κυττάρων μπορούν να αναπτύξουν πολλαπλά RBP για να ταξινομήσουν τα RNA σε εξωσώματα [33]. Τα δεδομένα μας που δείχνουν την ταυτοποίηση πολλαπλών RBP είναι, σε συμφωνία με αυτό το επιχείρημα, ωστόσο δεν είναι σαφές εάν αυτές οι πρωτεΐνες λειτουργούν μαζί σε συνδυασμό ή μεμονωμένα. Επιπλέον, οι συγγραφείς αυτής της μελέτης υποστήριξαν ότι σε αυτή την περίπτωση η ανακάλυψη μοτίβου θα ήταν προκλητική, ακόμη και σε πολύ καθαρισμένα κυστίδια, λόγω διαφορετικών προτιμήσεων μοτίβου από διακριτές πρωτεΐνες [33].


Δες το βίντεο: What are RNA, mRNA and tRNA? (Φεβρουάριος 2023).