Πληροφορίες

Χημεία δοκιμής PCR σε πραγματικό χρόνο

Χημεία δοκιμής PCR σε πραγματικό χρόνο


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Δουλεύω για την κατασκευή μηχανής PCR σε πραγματικό χρόνο. Υπάρχει κάποιο σετ χημείας που μπορώ να αγοράσω online για:

  1. Προσδιορίστε εάν η ενίσχυση PCR έγινε με επιτυχία.
  2. Δοκιμή χρωστικών φθορισμού που θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την επικύρωση εάν τα οπτικά στοιχεία του ανιχνευτή φθορισμού λειτουργούσαν. δηλαδή κάτι που θα μπορούσα να διεγείρω με ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος και να παρακολουθήσω τον φθορισμό.

Άχνω για κάτι που δεν είναι επικίνδυνο και εξυπηρετεί μόνο τον μοναδικό σκοπό της επικύρωσης της μηχανής PCR σε πραγματικό χρόνο.

Οι mods παρακαλώ συμβουλέψτε εάν χρειάζεται να μετακομίσω στο Chemistry StackExchange


Υπάρχουν δύο διαφορετικοί τρόποι ανίχνευσης του προϊόντος PCR σε PCR πραγματικού χρόνου: βαφές που συνδέονται με το DNA γενικά, όπως το SYBR Green I, ή ανιχνευτές ειδικοί για το προϊόν PCR σας. Υπάρχει μια περίληψη των πλεονεκτημάτων του καθενός εδώ, με τον ακόλουθο πίνακα:

Μπορείτε να αγοράσετε είτε online. θα είναι αρκετά ακριβά, αλλά δεν μπορώ να σκεφτώ έναν προφανή τρόπο για να τα αποκτήσω φθηνότερα, αν σας ενδιαφέρει η επικύρωση υψηλής εμπιστοσύνης.

[επεξεργασία] ξέχασα να αναφέρω ότι θα χρειαστεί επίσης να κανονικοποιήσετε το σήμα αναφοράς έναντι μιας βαφής αναφοράς όπως το ROX (https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/12223012).


PCR πραγματικού χρόνου

Το Research Core Facility διαθέτει τρία συστήματα Bio-Rad CFX96 Fast Real-Time PCR. Το CFX96 είναι ένα σύστημα PCR σε πραγματικό χρόνο έξι καναλιών που συνδυάζει προηγμένη οπτική τεχνολογία με ακριβή θερμικό έλεγχο για να παρέχει ευαίσθητη, αξιόπιστη ανίχνευση. Το σύστημα και η οπτική τεχνολογία στερεάς κατάστασης (έξι φιλτραρισμένα LED, το καθένα με μια αντίστοιχη φιλτραρισμένη φωτοδίοδο) μεγιστοποιεί την ανίχνευση φθορισμού για συγκεκριμένες βαφές σε συγκεκριμένα κανάλια, παρέχοντας ευαίσθητη ανίχνευση για ποσοτικοποίηση και διάκριση στόχου. Τα δεδομένα συλλέγονται από όλα τα φρεάτια κατά τη λήψη δεδομένων. Σε κάθε θέση και σε κάθε σάρωση, το φορείο οπτικών είναι αναπαραγωγικά κεντραρισμένο πάνω από κάθε πηγάδι, οπότε η διαδρομή φωτός είναι πάντα η βέλτιστη και δεν χρειάζεται να θυσιάζεται η συλλογή δεδομένων σε ένα από τα κανάλια για κανονικοποίηση σε μια παθητική αναφορά. Οι χρήστες μπορούν να επιλέξουν πολλαπλές λειτουργίες λήψης δεδομένων, συμπεριλαμβανομένης μιας γρήγορης σάρωσης ενός χρώματος για πράσινο SYBR. Τα χαρακτηριστικά θερμικής κλίσης μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη βελτιστοποίηση των αντιδράσεων σε μία μόνο εκτέλεση. Το νέο λογισμικό CFX Manager διαθέτει προηγμένα εργαλεία ανάλυσης για την εκτέλεση κανονικοποιημένης γονιδιακής έκφρασης. Επιπλέον, αυτό το σύστημα δεν απαιτεί φλουορεσκεΐνη ή ROX για την κανονικοποίηση του οργάνου.

Συνιστώμενοι τόμοι δειγμάτων

Βαθμονόμηση βαφής

Φθοροφόρο


Ερχομαι σε επαφή

Επικοινωνήστε μαζί μας

Έχετε ερωτήσεις σχετικά με τα τεστ COVID-19;

Προσαρμοσμένες Λύσεις

Μάθετε για τα προσαρμοσμένα σχεδιασμένα αντιδραστήρια μας

ΕΤΑΙΡΙΑ

ΠΟΡΟΙ

Προϊόντα

ΑΚΟΛΟΥΘΗΣΤΕ ΤΟ BIOGX

Η χρήση των cookies από εμάς

Αυτά τα cookies είναι απαραίτητα για τη λειτουργία του ιστότοπου και δεν μπορούν να απενεργοποιηθούν στα συστήματά μας. Συνήθως ορίζονται μόνο ως απάντηση σε ενέργειες που κάνετε από εσάς που ισοδυναμούν με αίτημα για υπηρεσίες, όπως ο καθορισμός των προτιμήσεων απορρήτου, η σύνδεση ή η συμπλήρωση εντύπων. Μπορείτε να ρυθμίσετε το πρόγραμμα περιήγησής σας ώστε να αποκλείει ή να σας ειδοποιεί για αυτά τα cookie, αλλά ο αποκλεισμός αυτών των cookies θα εμποδίσει τη λειτουργία του ιστότοπου. Αυτά τα cookies δεν αποθηκεύουν προσωπικές πληροφορίες.

Αυτά τα cookies βοηθούν στην εκτέλεση ορισμένων λειτουργιών, όπως η κοινή χρήση του περιεχομένου του ιστότοπου σε πλατφόρμες μέσων κοινωνικής δικτύωσης, η συλλογή σχολίων και άλλες λειτουργίες τρίτων.

Αυτά τα cookies μας επιτρέπουν να μετράμε τις επισκέψεις και τις πηγές επισκεψιμότητας, ώστε να μπορούμε να μετράμε και να βελτιώνουμε την απόδοση του ιστότοπού μας. Μας βοηθούν να γνωρίζουμε ποιες σελίδες είναι οι πιο δημοφιλείς και οι λιγότερο δημοφιλείς και να δούμε πώς μετακινούνται οι επισκέπτες στον ιστότοπο. Ενδέχεται να παρέχουμε αυτά τα cookie σε τρίτους παρόχους υπηρεσιών για να μας βοηθήσουν να εκτελέσουμε αυτά τα αναλυτικά στοιχεία (π.χ. Google Analytics). Όλες οι πληροφορίες που συλλέγουν αυτά τα cookies είναι συγκεντρωτικά ή ανώνυμα δεδομένα και δεν σχετίζονται προσωπικά με εσάς. Εάν αποκλείσετε ή εξαιρεθείτε από αυτά τα cookies, δεν θα γνωρίζουμε πότε έχετε επισκεφτεί τον ιστότοπό μας και δεν θα μπορούμε να παρακολουθούμε την απόδοσή του.

Αυτά τα cookie χρησιμοποιούνται για να κατανοήσουν πώς αλληλεπιδρούν οι επισκέπτες με τον ιστότοπο. Αυτά τα cookie βοηθούν στην παροχή πληροφοριών σχετικά με τις μετρήσεις, τον αριθμό των επισκεπτών, το ποσοστό εγκατάλειψης, την πηγή επισκεψιμότητας κ.λπ.


Αποκαλύψεις συγγραφέων ή πιθανές συγκρούσεις συμφερόντων

Κατά την υποβολή του χειρογράφου, όλοι οι συγγραφείς συμπλήρωσαν τη φόρμα αποκάλυψης του συγγραφέα. Αποκαλύψεις ή/και πιθανές συγκρούσεις συμφερόντων:

Απασχόληση ή ηγεσία: Κανένα δεν δήλωσε.

Συμβουλευτικός ή Συμβουλευτικός Ρόλος: Κανένας δεν δηλώθηκε.

Ιδιοκτησία μετοχών: Κανένας δεν δηλώθηκε.

Honoraria: Κανένας δεν δηλώθηκε.

Χρηματοδότηση Έρευνας: Αυτή η εργασία υποστηρίχθηκε από επιχορηγήσεις από το Εθνικό Μείζον Έργο Επιστήμης και Τεχνολογίας για τον Έλεγχο και την Πρόληψη Μείζονων Λοιμωδών Νοσημάτων στην Κίνα (#2018ZX10711001 και #2018ZX10102001).

Μαρτυρία εμπειρογνωμόνων: Κανένα δεν δήλωσε.

Διπλώματα ευρεσιτεχνίας: Κανένας δεν δηλώθηκε.


Τεχνικές ποσοτικής PCR

Ανάλυση καμπύλης τήξης

Η πλατφόρμα PCR σε πραγματικό χρόνο βασίζεται συνήθως σε ένα αυξανόμενο επίπεδο φθορισμού ως δείκτη της συσσώρευσης του προϊόντος. Όσοι φοβούνται τη μόλυνση από αμπλίκον (θα πρέπει να είναι όλοι) αισθάνονται πολύ σίγουροι χρησιμοποιώντας δοκιμασίες σε πραγματικό χρόνο, επειδή ο σωλήνας ή ο τριχοειδής δεν χρειάζεται να ανοίξουν μετά την ενίσχυση, ούτε πραγματοποιείται ανάλυση πηκτής. Πώς, λοιπόν, μπορεί κάποιος να καθορίσει εάν το σωστό προϊόν συντέθηκε και πώς μπορούν να διακριθούν μη ειδικά προϊόντα; Περιττό να πούμε ότι το μη ειδικό προϊόν, συμπεριλαμβανομένου του διμερούς εκκινητή θα επηρεάσει σίγουρα την ευαισθησία, για να μην αναφέρουμε την ερμηνεία των δεδομένων.

Αυτές οι ερωτήσεις μπορούν να απαντηθούν εκτελώντας ανάλυση καμπύλης τήξης, η οποία είναι μια καθιερωμένη μέθοδος για την αναγνώριση προϊόντων ή για εφαρμογές γονότυπου. Η ιδέα είναι ότι μόρια διαφορετικού μήκους και/ή σύνθεσης βάσης θα διαχωριστούν ή θα «λιώσουν» στα συστατικά τους μονόκλωνα σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Η τυπική διαδικασία είναι η εκτέλεση του πρωτοκόλλου καμπύλης τήξης αμέσως μετά την ολοκλήρωση του τελευταίου κύκλου. Καθώς η θερμοκρασία ενός δείγματος αυξάνεται, το δίκλωνο DNA θα αρχίσει να λιώνει όσο το δυνατόν περισσότερο ΤΜ προσεγγίζεται και θα ολοκληρώσει τη διαδικασία τήξης μετά ΤΜ έχει ξεπεραστεί. Κατά συνέπεια, το SYBR Green ή τα ολιγονουκλεοτίδια με ετικέτα φθοροφόρου δεν θα συσχετίζονται πλέον με μονόκλωνο DNA, με αποτέλεσμα τον μειωμένο φθορισμό καθώς το προϊόν ή τα προϊόντα λιώνουν, παράγοντας έτσι τις καμπύλες τήξης (Εικ. 9.10Β, Ε). Για να διευκολυνθεί η ερμηνεία των δεδομένων, το προφίλ καμπύλης τήξης γενικά παρουσιάζεται ως αρνητικό παράγωγο (−dφά/ρεΤ) έτσι ώστε κάθε προϊόν PCR στο δείγμα να εμφανίζεται ως κορυφή τήξης (Εικ. 9.10C, F), από την οποία το σχετικό προϊόν ΤΜ μπορεί να συναχθεί γρήγορα. Εάν παρήχθη ένα μοναδικό προϊόν, θα πρέπει να παρατηρήσετε μια μοναδική, εξέχουσα κορυφή που σχετίζεται με το προφίλ τήξης του δείγματος. Η εκ των προτέρων γνώση της βασικής σύνθεσης του αναμενόμενου προϊόντος θα πρέπει επίσης να επιτρέπει στον ερευνητή να προβλέψει πού πρέπει να συμβεί η κορυφή της καμπύλης τήξης.

Εικόνα 9.10. Ανάλυση PCR σε πραγματικό χρόνο και ανάλυση καμπύλης τήξης. Η διάσπαση των κλώνων προκαλεί μείωση του φθορισμού καθώς το φθοροφόρο απελευθερώνεται από τη σχέση του με το προϊόν PCR. (Α) Προφίλ ενίσχυσης οκτώ πανομοιότυπων δειγμάτων που εκτελούνται παράλληλα. (Β) Ανάλυση καμπύλης τήξης των προϊόντων PCR που παράγονται στο (Α), που δείχνει τη μείωση του φθορισμού καθώς αυξάνεται η θερμοκρασία και το SYBR Green απομακρύνεται από το μετουσιωμένο προϊόν PCR. (Γ) Τα δεδομένα παρουσιάζονται συχνότερα ως αρνητικό παράγωγο της μείωσης φθορισμού, έτσι ώστε να μπορούν να αναγνωριστούν εύκολα οι κορυφές καμπύλης τήξης. Η μοναδική κορυφή προτείνει έντονα ένα μοναδικό, πανομοιότυπο προϊόν PCR μεταξύ των οκτώ δειγμάτων. (Δ) Ενίσχυση πέντε δειγμάτων που εκτελούνται παράλληλα. (Ε) Ανάλυση καμπύλης τήξης των προϊόντων PCR που παράγονται στο (Δ). (ΣΤ) Η εμφάνιση μιας δεύτερης κορυφής (βέλους) σε χαμηλότερη από την αναμενόμενη θερμοκρασία τήξης υποδηλώνει έντονα διμερές αστάρι ή σχηματισμό άλλου μη ειδικού προϊόντος. Επιπλέον, η απόκλιση των καμπυλών ενίσχυσης μεταξύ των κύκλων 17 και 21 (πίνακας D) υποδηλώνει έντονα σφάλματα στο σιφώνιο ή άγνωστους ρύπους σε ορισμένα από τα δείγματα.

Προβλήματα με τα προϊόντα αντίδρασης ανιχνεύονται όταν το προφίλ τήξης είναι διαφορετικό από το αναμενόμενο ή όταν εμφανίζεται μια δεύτερη κορυφή σε χαμηλότερη θερμοκρασία. Στην περίπτωση του πρώτου, είναι πιθανό να έχει συντεθεί μια παραλλαγή του αναμενόμενου προϊόντος PCR ή να έχει παραχθεί εντελώς διαφορετικό προϊόν. Στην περίπτωση του τελευταίου, χαμηλή θερμοκρασία ΤΜ οι κορυφές συχνά προκύπτουν από τον πλαστό σχηματισμό μη ειδικού προϊόντος ή, πολύ συχνά, από τον σχηματισμό αρχικού-διμερούς. Στην περίπτωση ενός παραλλαγμένου ή άλλως απροσδόκητου προϊόντος, θα πρέπει να εξετάσετε το πρότυπο, να επανεκτιμήσετε τα αστάρια, να υπολογίσετε εκ νέου το αναμενόμενο μέγεθος προϊόντος, να εξετάσετε την αύξηση της θερμοκρασίας ανόπτησης και να διασφαλίσετε ότι δεν έχει συμβεί μόλυνση από αμπλίκον. Ο σχηματισμός αστάρι-διμερούς μπορεί να ελαχιστοποιηθεί αναλύοντας πιθανές αλληλουχίες εκκινητών σε πυριτία πριν τις παραγγείλετε. Το διαδίκτυο είναι φορτωμένο με δωρεάν λογισμικό που όχι μόνο θα εξετάσει μεμονωμένα αστάρια για την πιθανότητα σχηματισμού δευτερεύουσας δομής και σχηματισμού αυτο-αστάρι-διμερούς, αλλά θα χαρακτηρίσει επίσης την πιθανή αλληλεπίδραση δύο εκκινητών που εξετάζονται για χρήση. Ορισμένα τέτοια εργαλεία βρίσκονται σε πολλά σημεία στο διαδίκτυο, συμπεριλαμβανομένων των ιστότοπων πωλητών όπου παραγγέλνονται αστάρια.


Το τεστ RT-PCR COVID-19: Πώς να παραπλανήσετε όλη την ανθρωπότητα. Χρήση «Τεστ» για Κλείδωμα της κοινωνίας

Θετική εξέταση RT-PCR σημαίνει να είσαι άρρωστος με COVID. Αυτή η υπόθεση είναι παραπλανητική.

Πολύ λίγοι άνθρωποι, συμπεριλαμβανομένων των γιατρών, καταλαβαίνουν πώς λειτουργεί μια δοκιμή PCR.

RT-PCR σημαίνει Real Τime-Πολιμεράση ντοχάιν Rδράση.

Στα γαλλικά σημαίνει: Reaction de Polymérisation en Chaîne en Temps Réel.

Στην ιατρική, χρησιμοποιούμε αυτό το εργαλείο κυρίως για τη διάγνωση μιας ιογενούς λοίμωξης.

Ξεκινώντας από μια κλινική κατάσταση με την παρουσία ή απουσία ιδιαίτερων συμπτωμάτων σε έναν ασθενή, εξετάζουμε διαφορετικές διαγνώσεις με βάση τις εξετάσεις.

Στην περίπτωση ορισμένων λοιμώξεων, ιδιαίτερα ιογενών λοιμώξεων, χρησιμοποιούμε την τεχνική RT-PCR για να επιβεβαιώσουμε μια διαγνωστική υπόθεση που προτείνεται από μια κλινική εικόνα.

Δεν κάνουμε τακτικά RT-PCR σε οποιονδήποτε ασθενή υπερθερμαίνεται, βήχει ή έχει φλεγμονώδες σύνδρομο!

Είναι μια τεχνική εργαστηριακής μοριακής βιολογίας γονιδιακής ενίσχυσης επειδή αναζητά γονιδιακά ίχνη (DNA ή RNA) ενισχύοντάς τα.

Εκτός από την ιατρική, άλλοι τομείς εφαρμογής είναι η γενετική, η έρευνα, η βιομηχανία και η εγκληματολογία.

Η τεχνική πραγματοποιείται σε α εξειδικευμένο εργαστήριο, δεν μπορεί να γίνει σε κανένα εργαστήριο, ακόμα και σε νοσοκομείο. Αυτό συνεπάγεται ένα ορισμένο κόστος, και μερικές φορές μια καθυστέρηση πολλών ημερών μεταξύ του δείγματος και του αποτελέσματος.

Σήμερα, από την εμφάνιση της νέας ασθένειας που ονομάζεται COVID-19 (COrona VIrus ρεisease-2019), η διαγνωστική τεχνική RT-PCR χρησιμοποιείται για τον καθορισμό θετικών περιπτώσεων, επιβεβαιωμένων ως SARS-CoV-2 (κορωνοϊός υπεύθυνος για το νέο σύνδρομο οξείας αναπνευστικής δυσχέρειας που ονομάζεται COVID-19).

Αυτές οι θετικές περιπτώσεις εξομοιώνονται με τις περιπτώσεις COVID-19, μερικοί από τους οποίους νοσηλεύονται ή ακόμη και εισάγονται σε μονάδες εντατικής θεραπείας.

Επίσημο αξίωμα των διευθυντών μας: θετικές περιπτώσεις RT-PCR = ασθενείς με COVID-19. [1]

Αυτό είναι το αρχικό αξίωμα, η προϋπόθεση κάθε επίσημης προπαγάνδας, που δικαιολογεί όλα τα περιοριστικά κυβερνητικά μέτρα: απομόνωση, εγκλεισμός, καραντίνα, υποχρεωτικές μάσκες, χρωματικοί κωδικοί ανά χώρα και απαγορεύσεις ταξιδιών, παρακολούθηση, κοινωνικές αποστάσεις σε εταιρείες, καταστήματα και ακόμη περισσότερα σημαντικό, στα σχολεία [2].

Αυτή η κακή χρήση της τεχνικής RT-PCR χρησιμοποιείται ως μια αδυσώπητη και σκόπιμη στρατηγική ορισμένων κυβερνήσεων, υποστηριζόμενα από επιστημονικά συμβούλια ασφαλείας και από τα κυρίαρχα μέσα ενημέρωσης, για να δικαιολογήσει τα υπερβολικά μέτρα όπως η καταπάτηση μεγάλου αριθμού συνταγματικών δικαιωμάτων, η καταστροφή της οικονομίας με τη χρεοκοπία ολόκληρων ενεργών τομέων της κοινωνίας, η υποβάθμιση των συνθηκών διαβίωσης μεγάλου αριθμού απλών πολιτών, με το πρόσχημα της πανδημίας. βασίζεται σε έναν αριθμό θετικών τεστ RT-PCR και όχι σε πραγματικό αριθμό ασθενών.

Τεχνικές πτυχές: για να κατανοήσετε καλύτερα και να μην παραποιηθείτε

Η τεχνική PCR αναπτύχθηκε από χημικό Kary B. Mullis το 1986. Ο Kary Mullis τιμήθηκε με το Νόμπελ Χημείας το 1993.

Αν και αυτό αμφισβητείται [3], ο ίδιος ο Kary Mullis φέρεται να επέκρινε το ενδιαφέρον Η PCR ως διαγνωστικό εργαλείο για λοίμωξη, ιδιαίτερα ιογενή.

Ανέφερε ότι εάν η PCR ήταν ένα καλό εργαλείο για έρευνα, ήταν ένα πολύ κακό εργαλείο στην ιατρική, στην κλινική [4].

Ο Mullis αναφερόταν στον ιό του AIDS (ρετροϊός HIV ή HIV) [5], πριν από την πανδημία του COVID-19, αλλά αυτή η γνώμη σχετικά με τον περιορισμό της τεχνικής στις ιογενείς λοιμώξεις [6], από τον δημιουργό της, δεν μπορεί να απορριφθεί. πρέπει να ληφθεί υπόψη!

Η PCR τελειοποιήθηκε το 1992.

Καθώς η ανάλυση μπορεί να πραγματοποιηθεί σε πραγματικό χρόνο, συνεχώς, γίνεται RT (Πραγματικός χρόνος) - PCR, ακόμα πιο αποτελεσματικό.

Μπορεί να γίνει από οποιοδήποτε μόριο, συμπεριλαμβανομένων αυτών των ζωντανών, τα νουκλεϊκά οξέα που αποτελούν τα γονίδια:

Οι ιοί δεν θεωρούνται «ζωντανά» όντα, είναι πακέτα πληροφοριών (DNA ή RNA) που σχηματίζουν ένα γονιδίωμα.

Με την τεχνική ενίσχυσης (πολλαπλασιασμός) επισημαίνεται το μόριο που αναζητείται και αυτό το σημείο είναι πολύ σημαντικό.

Η RT-PCR είναι μια τεχνική ενίσχυσης [7].

Εάν υπάρχει DNA ή RNA του επιθυμητού στοιχείου σε ένα δείγμα, δεν μπορεί να αναγνωριστεί ως τέτοιο.

Αυτό το DNA ή το RNA πρέπει να είναι ενισχύεται (πολλαπλασιάζεται) ορισμένες φορές, μερικές φορές πολύ μεγάλο αριθμό φορών, πριν μπορέσει να ανιχνευθεί. Από ένα λεπτό ίχνος, μπορούν να ληφθούν έως και δισεκατομμύρια αντίγραφα ενός συγκεκριμένου δείγματος, αλλά αυτό δεν σημαίνει ότι υπάρχει όλη αυτή η ποσότητα στον οργανισμό που ελέγχεται.

Στην περίπτωση του COVID-19, το στοιχείο που αναζητά η RT-PCR είναι ο SARS-CoV-2, ένας ιός RNA [8].

Υπάρχουν Ιούς DNA όπως ο ιός του έρπητα και της ανεμοβλογιάς.

Το πιο γνωστό Ιούς RNA, εκτός από τους κορωνοϊούς, είναι οι ιοί γρίπης, ιλαράς, EBOLA, ZIKA.

Στην περίπτωση του SARS-CoV-2, του ιού RNA, απαιτείται ένα επιπλέον ειδικό βήμα, η μεταγραφή του RNA σε DNA μέσω ενός ενζύμου, της Αντίστροφης Μεταγραφάσης.

Αυτό το βήμα προηγείται της φάσης ενίσχυσης.

Δεν είναι το ολόκληρος ιός που ταυτοποιείται, αλλά αλληλουχίες του ιικού γονιδιώματος του.

Αυτό δεν σημαίνει ότι αυτή η γονιδιακή αλληλουχία, ένα θραύσμα του ιού, δεν είναι ειδική για τον ιό που αναζητείται, αλλά είναι ωστόσο μια σημαντική απόχρωση:

Το RT-PCR δεν αποκαλύπτει ιό, αλλά μόνο μέρη, συγκεκριμένο γονίδιο ακολουθίες του ιού.

Στην αρχή του έτους, έγινε η αλληλουχία του γονιδιώματος SARS-CoV-2.

Αποτελείται από περίπου 30.000 ζεύγη βάσεων. Το νουκλεϊκό οξύ (DNA-RNA), το συστατικό των γονιδίων, είναι μια ακολουθία βάσεων. Σε σύγκριση, το ανθρώπινο γονιδίωμα έχει περισσότερα από 3 δισεκατομμύρια ζεύγη βάσεων.

Οι ομάδες παρακολουθούν συνεχώς την εξέλιξη του ιικού γονιδιώματος SARS-CoV-2 καθώς εξελίσσεται [9-10-11], μέσω των μεταλλάξεων που υφίσταται. Σήμερα, υπάρχουν πολλές παραλλαγές [12].

Λαμβάνοντας μερικά συγκεκριμένα γονίδια από το γονιδίωμα SARS-CoV-2, είναι δυνατό να ξεκινήσει η RT-PCR σε ένα δείγμα από την αναπνευστική οδό.

Για τη νόσο COVID-19, η οποία έχει ρινοφαρυγγικό (μύτη) και στοματοφαρυγγικό (στόμα) σημείο εισόδου, το δείγμα θα πρέπει να λαμβάνεται από την ανώτερη αναπνευστική οδό όσο το δυνατόν βαθύτερα, προκειμένου να αποφευχθεί η μόλυνση ειδικότερα από το σάλιο.


Αποτελέσματα

Τυποποίηση της ανάλυσης qPCR

Αρχικά, η αλληλουχία ITS χρησιμοποιήθηκε ως τόπος στόχος για το σχεδιασμό ειδικών για είδη και καθολικών εκκινητών. Μόνο στόχευση PF3/R3-Myc Μ. μυκητομάτης (84,1 ± 0,18 ° C) και στόχευση PF-R-Fahalii Μ. fahalii (89,13 ± 0,41 ° C) κατέληξαν σε επιτυχείς ειδικές και διακριτές καμπύλες τήγματος (Πίνακες 2 και 3 και Σχήμα 1Α). Αυτοί οι δύο εκκινητές χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για να βελτιστοποιήσουν το duplex qPCR που μπορεί να ανιχνεύσει ειδικά Μ. μυκητομάτης και Μ. fahaliiΤο Δεδομένου ότι οι καθολικοί εκκινητές που βασίζονται σε ITS απέτυχαν στη συγκεκριμένη ταυτοποίηση των τεσσάρων ειδών-στόχων, το γονίδιο β-τουμπουλίνης χρησιμοποιήθηκε για τον ίδιο σκοπό. Ένα γενικό ζεύγος εκκινητών που προέρχεται από β-τουμπουλίνη είχε ως αποτέλεσμα επιτυχημένες θερμοκρασίες τήξης 83,07 ± 0,13 ° C, 83,6 ± 0,09 ° C και 84,17 ± 0,19 ° C και επιτρέποντας τη διάκριση τριών ειδών στόχου, δηλαδή. Μ. pseudomycetomatis, Μ. τροπικάνα, και Μ. μυκητομάτης, αντίστοιχα. Madurella fahalii δεν θα μπορούσε να διακριθεί με αυτό το σετ αστάρι. Προκειμένου να γίνει ένα ολοκληρωμένο πολλαπλό qPCR που μπορεί να προσδιορίσει με σαφήνεια και τα τέσσερα είδη, το σετ εκκινητών PF/R-Fahalii που προέρχεται από ITS προστέθηκε στους γενικούς εκκινητές β-τουμπουλίνης στην ίδια αντίδραση (Εικόνα 1Β, Πίνακες 2 και 3). Χρησιμοποιώντας αυτόν τον συνδυασμό, αποκαλύφθηκαν τέσσερις διακριτές κορυφές τήξης που αντιστοιχούν στα τέσσερα είδη-στόχοι.

(Α) Αναγνώριση του Μ. fahalii και Μ. μυκητομάτης χρησιμοποιώντας διπλή δοκιμασία qPCR. (Β) Ταυτοποίηση όλων των ειδών -στόχων χρησιμοποιώντας τετραπλή ανάλυση qPCR. (Γ) Αναγνώριση του Μ. μυκητομάτης χρησιμοποιώντας ένα Μ. μυκητομάτης-ειδική ανάλυση qPCR.

Προκειμένου να αναπτυχθεί μια συγκεκριμένη qPCR για Μ. μυκητομάτης, σχεδιάστηκαν δύο ακόμη ζεύγη εκκινητών με βάση τη β-τουμπουλίνη με αυξημένη διαφορά θερμοκρασίας τήξης από τα πλησιέστερα είδη στην πολυπλεξική PCR. Αυτοί οι εκκινητές δημιούργησαν αμπλικόνια με τιμές Tm 84,5 ± 0,1 ° C (Myc-F1/R1) και 84,9 ± 0,18 ° C (Myc-F2/R2) (Σχήμα 1C, Πίνακες 2 και 3). Παρά την επιτυχή ενίσχυση του Μ. μυκητομάτης χρησιμοποιώντας και τους δύο εκκινητές, χρησιμοποιήθηκε MycF2/R2 για την Μ. μυκητομάτης-ειδικό qPCR καθώς έδειξε υψηλότερη και πιο διακριτή τιμή Tm από Μ. ψευδομυκητωματίτιδα και Μ. τροπικάναΤο Γενικά, οι εκκινητές που σχεδιάστηκαν με βάση τη β-τουμπουλίνη έδειξαν υψηλότερο ποσοστό επιτυχίας από εκείνους που βασίζονται στην περιοχή ITS, κάτι που μπορεί να οφείλεται σε υψηλότερη περιεκτικότητα σε GC της περιοχής στόχου της τελευταίας.

Στο επόμενο βήμα, ενόψει της δοκιμής ευαισθησίας και οι τρεις αντιδράσεις qPCR υποβλήθηκαν σε σειριακά αραιωμένα δείγματα DNA (3 ng -3 pg) ειδών στόχου. Οι δοκιμές ευαισθησίας το αποκάλυψαν Μ. μυκητομάτης, Μ. ψευδομυκητωματίτιδα, και Μ. τροπικάνα ενισχύθηκαν επιτυχώς και αποτελεσματικά με απόδοση ≥90% και τις τιμές R2 & gt0,99 για Μ. fahalii η αποτελεσματικότητα ήταν 70%. Επιπλέον, 3 pg DNA όλων των ειδών στόχων ανιχνεύθηκαν επιτυχώς και διακρίθηκαν με τις τρεις δοκιμές qPCR.

Ένας υψηλός βαθμός εξειδίκευσης επιβεβαιώθηκε με τυφλά δείγματα DNA που ελήφθησαν από καλλιέργειες

Στην τρίτη φάση, οι επιτυχημένες αντιδράσεις qPCR αμφισβητήθηκαν από ένα τυφλό σετ δοκιμών που περιείχε 26 απομονωμένα είδη στόχων και 21 μη στόχους. Η διπλή δοκιμή qPCR μας οδήγησε σε 100% ειδικότητα όταν το όριο για Μ. μυκητομάτης και Μ. fahalii ορίστηκαν σε τιμή Ct των & lt20 και & lt38, αντίστοιχα (Σχήματα 2 και S2). Ορισμένα από τα είδη μη στόχων απέδωσαν καμπύλες τήξης παρόμοιες με αυτές του Μ. fahalii με τιμές Ct & gt38, επομένως οι τιμές Ct & lt38 και & gt38 θεωρήθηκαν θετικές και αρνητικές για αυτό το είδος, αντίστοιχα. Οι τιμές Ct του <30 απέδωσαν 100% ειδικότητα για το tetraplex και Μ. μυκητομάτης-ειδικές δοκιμασίες qPCR (Σχήμα 3). Καθώς τα σετ εκκινητών Pf/R-Fahalii χρησιμοποιήθηκαν τόσο σε δοκιμές διπλής όψης όσο και σε τετράπλεξη qPCR, η ίδια τιμή Ct (& lt38) εξετάστηκε και για τις δύο αντιδράσεις qPCR. Οι καμπύλες χαρακτηριστικών λειτουργίας δέκτη (ROC) έδειξαν ότι με τις καθιερωμένες τιμές κατωφλίου κύκλου, επιτεύχθηκε εξειδίκευση 100% για τις τρεις δοκιμές qPCR (Εικόνα 4).

(Α) Τιμές Tm που ελήφθησαν από δοκιμή διπλής όψης qPCR για Μ. fahalii και Μ. μυκητομάτηςΤο (Β) Δοκιμασία διπλής όψης qPCR με τυφλό σύνολο δοκιμών και δείγματα DNA που ελήφθησαν από ασθενείς απέδωσαν 100% ειδικότητα και ευαισθησία εάν οι κύκλοι κατωφλίου ορίστηκαν σε<20 (κόκκινη γραμμή) και <30 (μπλε γραμμή), αντίστοιχα.

(Α) Τιμές Tm που λαμβάνονται από tetraplex και Μ. μυκητομάτης-ειδικές δοκιμασίες qPCR για Μ. fahalii, Μ. μυκητομάτης, Μ. ψευδομυκητωματίτιδα, και Μ. τροπικάναΤο (Β) Tetraplex και MM-ειδικό qPCR με τυφλό σετ δοκιμών και δείγματα DNA που ελήφθησαν από ασθενείς απέδωσαν 100% εξειδίκευση και ευαισθησία εάν το κατώφλι κυκλώσει & lt30 (κόκκινη γραμμή).

Ένας υψηλός βαθμός ευαισθησίας και εξειδίκευσης επιβεβαιώθηκε από τυφλά δείγματα DNA που ελήφθησαν από ασθενείς

Μετά την επιτυχία στη δοκιμή ευαισθησίας και εξειδίκευσης, οι αποδεκτοί εκκινητές αξιολογήθηκαν με 13 δείγματα DNA που ελήφθησαν από τεκμηριωμένα Μ. μυκητομάτης-θετικοί και αρνητικοί ασθενείς. Σύμφωνα με την ιστολογία, την καλλιέργεια και την αλληλουχία ITS, και οι 11 θετικοί και οι 2 αρνητικοί ασθενείς αναγνωρίστηκαν επιτυχώς με τις δοκιμές qPCR μέσα σε 3 ώρες ξεκινώντας από την απομόνωση του DNA (Σχήματα 2, 3 και S2). Η δοκιμή κάπα αποκάλυψε ένα κ τιμή 1,00 (95% CI 1,00 έως 1,00) που υποδηλώνει τέλεια συμφωνία. Η διαγνωστική ευαισθησία και ειδικότητα των προσδιορισμών qPCR ήταν 100% (95% CI, 71,51% έως 100%) και 100% (95% CI, 15,81% έως 100%), αντίστοιχα.


Βασική Λογοτεχνία

Συνοψίζοντας: Συνολικά, ο έλεγχος RT-PCR είναι ο βασικός πυλώνας στη διάγνωση του COVID-19, λόγω της ευαισθησίας, της ειδικότητας και της σκοπιμότητάς του σε σύγκριση με την καλλιέργεια ιών. Πρέπει να ληφθεί υπόψη ο χρόνος των δοκιμών PCR σε σχέση με τα συμπτώματα, το όριο ανίχνευσης της ανάλυσης και τη θέση του τόπου συλλογής δειγμάτων. Οι μελλοντικές καινοτομίες στην RT-PCR επικεντρώνονται κυρίως σε θέματα ευκολίας επεξεργασίας, ταχύτερους χρόνους επαναφοράς και μειώσεις στη χρήση υλικών.

Διάρκεια μολυσματικότητας και συσχέτιση με τις τιμές κατωφλίου του κύκλου RT-PCR σε περιπτώσεις COVID-19 (Singanayagam, Αύγουστος 2020).

Συνολικά, σε αυτήν την αναδρομική μελέτη δειγμάτων που ελήφθησαν για σκοπούς εθνικής επιτήρησης, το ιικό φορτίο του SARS-CoV-2 στην ανώτερη αναπνευστική οδό κορυφώθηκε περίπου κατά την έναρξη των συμπτωμάτων. Η ικανότητα καλλιέργειας του SARS-CoV-2 σε ασθενείς με ήπια έως μέτρια νόσο ήταν υψηλότερη την πρώτη εβδομάδα και μειώθηκε σημαντικά την ημέρα 10 αφού η εμφάνιση των συμπτωμάτων την ημέρα 12 δεν ήταν δυνατή η καλλιέργεια του ιού. Οι τιμές κατωφλίου του κύκλου RT-PCR συσχετίστηκαν ισχυρά με τον καλλιεργήσιμο ιό.

Πληθυσμός μελέτης:

  • 754 δείγματα ανώτερης αναπνευστικής οδού (URT) από 425 άτομα με συμπτωματικό COVID-19 που εξετάστηκαν στο Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς Αναπνευστικού Ιού της Public Health England&rsquos μεταξύ Ιανουαρίου και Απριλίου 2020.
  • Τα δείγματα περιλάμβαναν μύτη, λαιμό, συνδυασμένα επιχρίσματα μύτης και λαιμού και ρινοφάρυγγα ή ρινοφαρυγγικές αναρροφήσεις.
  • Επιχειρήθηκε καλλιέργεια ιού σε 253 περιπτώσεις, 233 περιπτώσεις (92%) ταξινομήθηκαν ως μη σοβαρές (ασυμπτωματικές ή ήπιες έως μέτριες) και 20 (8%) είχαν σοβαρή ασθένεια.

Κύριο καταληκτικό σημείο:

  • Για να καθοριστεί η διάρκεια της μολυσματικότητας και να προσδιοριστεί εάν η ανίχνευση RT-PCR σχετίζεται με καλλιεργήσιμο ιό.

Σημαντικά ευρήματα:

  • Την πρώτη εβδομάδα μετά την έναρξη των συμπτωμάτων (ημέρες &μείον 2 έως 7), ο μέσος ουδός κύκλου (Ct) ήταν 28,18 (95% CI 27,76 & ndash28,61) τη δεύτερη εβδομάδα Ct ήταν 30,65 (95% CI: 29,82 & ndash31,52). Μετά από 14 ημέρες, ο γεωμετρικός μέσος όρος (GM) Ct ήταν 31,60 (95% CI: 31,60&ndash34,49).
  • Δεν υπήρχε διαφορά στις τιμές Ct μεταξύ εκείνων με ήπια έως μέτρια και σοβαρή νόσο (p = 0,79).
  • Δεν υπήρχε διαφορά στη θετικότητα της καλλιέργειας μεταξύ συμπτωματικών και ασυμπτωματικών περιπτώσεων (OR = 0,66 95% CI: 0,34&ndash1,31).
  • Η εκτιμώμενη πιθανότητα ανάκτησης του ιού από δείγματα με Ct > 35 ήταν 8,3% (95% CI: 2,8%&ndash18,4%).
  • Υπήρχαν 246 δείγματα από 176 συμπτωματικές περιπτώσεις όπου ήταν γνωστή η ημερομηνία έναρξης των συμπτωμάτων: από αυτά, 103 (42%) από 81 περιπτώσεις ήταν θετικές στην καλλιέργεια.
    • Το ποσοστό θετικότητας καλλιέργειας ήταν σημαντικά υψηλότερο κατά την εβδομάδα 1 από την εβδομάδα 2 (74% έναντι 20% p = 0,002).
    • Δέκα ημέρες μετά την έναρξη των συμπτωμάτων, η πιθανότητα καλλιέργειας του ιού μειώθηκε στο 6,0% (95% CI: 0,9&ndash31,2%)
    • Μετά την ημέρα 12, ο ιός δεν καλλιεργήθηκε.

    Περιορισμοί:

    • Οι ασθενείς και η ανάμνηση rsquo χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί η πιθανότητα εμφάνισης συμπτωμάτων.
    • Η διάρκεια και η διακοπή των συμπτωμάτων δεν καταγράφηκε καλά.
    • Οι περισσότερες περιπτώσεις στις οποίες επιχειρήθηκε καλλιέργεια ήταν ήπιες έως μέτριες, αυτό μπορεί να περιορίσει τη γενίκευση των ευρημάτων σε σοβαρή νόσο.
    • Για ασυμπτωματικές περιπτώσεις, ο χρόνος απόκτησης της λοίμωξης δεν ήταν γνωστός.
    • Η δειγματοληψία των θεμάτων δεν έγινε συστηματικά, πράγμα που θα μπορούσε να προκαλέσει προκατάληψη στο χρόνο δειγματοληψίας που σχετίζεται με το κλινικό σενάριο.

    Ανίχνευση σάλιου του COVID-19 (Caulley, Αύγουστος 2020).

    Συνολικά, σε αυτήν την προοπτική μελέτη, η δοκιμή σάλιου με SARS-CoV-2 RT-PCR ήταν λιγότερο ευαίσθητη από τη δοκιμή ρινοφαρυγγικού ή στοματοφαρυγγικού επιχρίσματος.

    Πληθυσμός μελέτης:

    • Ασυμπτωματικά άτομα υψηλού κινδύνου και άτομα με ήπια συμπτώματα που υποδηλώνουν COVID-19 σε εξεταστικό κέντρο στον Καναδά (n=1939 ζευγαρωμένα δείγματα είτε ρινοφαρυγγικών ή στοματοφαρυγγικών επιχρισμάτων και σάλιου).

    Κύριο καταληκτικό σημείο:

    • Για τον προσδιορισμό του ποσοστού ανίχνευσης του SARS-CoV-2 χρησιμοποιώντας ένα δείγμα σάλιου σε σύγκριση με την τυπική δοκιμή επιχρίσματος.

    Σημαντικά ευρήματα:

    • Ο SARS-CoV-2 ανιχνεύθηκε σε 70 δείγματα - 80,0% με επιχρίσματα και 68,6% με σάλιο.
    • 34 ασθενείς (48,6%) βρέθηκαν θετικοί για SARS-CoV-2 σε δείγματα στυλεού και σάλιου.
    • 22 ασθενείς (31,4%) βρέθηκαν θετικοί μόνο με μπατονέτα και 14 (20%) θετικοί μόνο με σάλιο.

    Περιορισμοί:

    • Τα δείγματα στυλεού και σάλιου χωρίστηκαν σε 2 εργαστήρια, γεγονός που μπορεί να οδήγησε σε αναφορά μεροληψίας.
    • Το μέγεθος του δείγματος των ασθενών με COVID-19 ήταν μικρό (n = 34 ασθενείς).

    Μελλοντικά δείγματα σάλιου ή ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος για ανίχνευση του SARS-CoV-2 (Wyllie, Αύγουστος 2020).

    Συνολικά, σε αυτήν την προοπτική μελέτη, το δείγμα σάλιου συσχετίστηκε με παρόμοια ευαισθησία στο ρινοφαρυγγικό επίχρισμα στην ανίχνευση του RNA του SARS-CoV-2.

    Πληθυσμός μελέτης:

    • 70 νοσηλευόμενοι ασθενείς με COVID-19, επιβεβαιωμένοι με θετικό δείγμα ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος.
    • Μετά τη διάγνωση, οι ασθενείς παρείχαν επίσης δείγματα σάλιου.

    Κύριο τελικό σημείο:

    • Για την αξιολόγηση του τρόπου σύγκρισης του σάλιου με τα δείγματα ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος σε σχέση με την ευαισθησία στην ανίχνευση του SARS-CoV-2 κατά τη διάρκεια της λοίμωξης.

    Σημαντικά ευρήματα:

    • Βρέθηκαν περισσότερα αντίγραφα RNA του SARS-CoV-2 στα δείγματα σάλιου (μέση αντίγραφα καταγραφής ανά χιλιοστόλιτρο, 5,58 95% CI, 5,09-6,07) από ό,τι στα ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα (μέση αντίγραφα καταγραφής ανά χιλιοστόλιτρο, 4,93-9435% CI, 5,09-6,07 ). ).
    • Σε 1 έως 5 ημέρες μετά τη διάγνωση, το 81% (95% CI, 71-96) των δειγμάτων σάλιου ήταν θετικά, σε σύγκριση με το 71% (95% CI, 67-94) των δειγμάτων του ρινοφαρυγγικού επιχρίσματος.
    • Λιγότερη διακύμανση στα επίπεδα του RNA SARS-CoV-2 παρατηρήθηκε στα δείγματα σάλιου (τυπική απόκλιση, 0,98 αντίγραφα RNA ιού ανά χιλιοστόλιτρο 95% αξιόπιστο διάστημα, 0,08 έως 1,98) από ό, τι στα ρινοφαρυγγικά δείγματα επιχρίσματος (τυπική απόκλιση, 2,01 αντίγραφα RNA ιού ανά χιλιοστόλιτρο 95% αξιόπιστο διάστημα, 1,29 έως 2,70).

    Περιορισμοί:

    • Μικρό μέγεθος δείγματος ατόμων που είχαν επιβεβαιωτική COVID-19.
    • Μονοκεντρική μελέτη.
    • Φαίνεται ότι το 100% των ασθενών με θετικά ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα είχαν επίσης θετικά δείγματα σάλιου, αλλά αυτό δεν αναφέρεται ξεκάθαρα στο χειρόγραφο εάν είναι ακριβές, θα ήταν καλύτερη απόδοση από άλλα έγγραφα που μελετούν την ευαισθησία του τεστ SARS-CoV-2 στο σάλιο.

    Προοπτική αξιολόγηση του σάλιου ως μη επεμβατικού δείγματος για την ανίχνευση του SARS-CoV-2 (Γουίλιαμς, Ιούλιος 2020).

    Συνολικά, σε αυτήν την προοπτική μελέτη που αξιολόγησε τη σκοπιμότητα των δειγμάτων σάλιου, η πλειοψηφία των ασθενών με θετικά ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα για SARS-CoV-2 είχαν επίσης θετικά δείγματα σάλιου, αλλά η ευαισθησία του τελευταίου τεστ ήταν χαμηλότερη. Παρατηρήθηκαν υψηλότερα ιικά φορτία με ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα.

    Πληθυσμός μελέτης:

    • 622 ασθενείς σε κλινική εξέτασης COVID-19 στην Αυστραλία με θετικές ρινοφαρυγγικές RT-PCR για SARS-CoV-2.
    • 522 (83,9%) έδωσαν επίσης δείγματα σάλιου.

    Κύριο καταληκτικό σημείο:

    • Για την αξιολόγηση της σκοπιμότητας των δειγμάτων σάλιου σε σύγκριση με τα ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα για την ανίχνευση του SARS-CoV-2.

    Σημαντικά ευρήματα:

    • 39/622 (6,3% 95% CI, 4,6-8,5%) ασθενείς είχαν PCR θετικούς ρινοφαρυγγικούς επιχρίσματα από αυτούς, 33/39 ασθενείς (84,6% 95% CI, 70,0-93,1%) είχαν SARS-CoV-2 ανιχνευμένο στο σάλιο Το
    • Ο ουδός διάμεσου κύκλου (CT) ήταν σημαντικά χαμηλότερος στο NPS σε σύγκριση με το σάλιο, υποδηλώνοντας υψηλότερα ιικά φορτία στο ρινοφάρυγγα.
    • Τόσο σε ρινοφαρυγγικά δείγματα όσο και σε δείγματα σάλιου, υπήρχε συσχέτιση μεταξύ της τιμής CT και των ημερών από την έναρξη των συμπτωμάτων.

    Περιορισμοί:

    • Μικρό μέγεθος δείγματος ασθενών με θετικά ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα (n = 39).
    • Δεν παρασχέθηκαν πληροφορίες σχετικά με τους ασθενείς και δεν αναφέρθηκαν τα βασικά χαρακτηριστικά και τα συμπτώματα της σοβαρότητας του COVID-19.

    Διακύμανση στο ψευδώς αρνητικό ποσοστό αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης της αντίστροφης μεταγραφάσης & τεστ SARS-CoV-2 που βασίζονται σε ndash κατά χρόνο από την έκθεση (Kucirka, Μάιος 2020).

    Συνολικά, σε αυτή τη συγκεντρωτική ανάλυση, οι ψευδώς αρνητικές RT-PCR ήταν τουλάχιστον συχνές 3 ημέρες μετά την εμφάνιση των συμπτωμάτων. Το ποσοστό ψευδώς αρνητικών RT-PCR ήταν υψηλότερο την ημέρα της μόλυνσης, ήταν χαμηλότερο 8 ημέρες μετά τη μόλυνση και στη συνέχεια άρχισε να αυξάνεται ξανά.

    Πληθυσμός μελέτης:

    • Συγκεντρωτική ανάλυση ενός μείγματος εσωτερικών και εξωτερικών ασθενών με λοίμωξη SARS-CoV-2 σε 7 μελέτες απόδοσης RT-PCR στην ανώτερη αναπνευστική οδό κατά χρόνο από την έναρξη ή την έκθεση των συμπτωμάτων (n = 1330 αναπνευστικά δείγματα).

    Κύριο καταληκτικό σημείο:

    Σημαντικά ευρήματα:

    • Κατά τη διάρκεια των 4 ημερών μεταξύ της μόλυνσης (ημέρα 1) έως την τυπική ώρα έναρξης των συμπτωμάτων (ημέρα 5), η πιθανότητα ενός ψευδώς αρνητικού αποτελέσματος σε ένα μολυσμένο άτομο μειώθηκε από 100% την ημέρα 1 (95% CI, 100%-100 %) έως 67% (CI, 27% - 94%) την 4η ημέρα.
    • Την ημέρα έναρξης των συμπτωμάτων (ημέρα 5), το διάμεσο ψευδώς αρνητικό ποσοστό ήταν 38% (CI, 18% έως 65%).
    • Την 8η ημέρα το διάμεσο ψευδώς αρνητικό ποσοστό μειώθηκε στο 20% (CI, 12%-30%) και στη συνέχεια άρχισε να αυξάνεται ξανά (21% [CI 13%-31%] την ημέρα 9).
    • Την ημέρα 21 το μέσο ψευδώς αρνητικό ποσοστό ήταν 66% (CI, 54% -77%).

    Περιορισμοί:

    • Ανάλυση βασισμένη σε ετερογενείς μελέτες.
    • Οι συγγραφείς υπέθεσαν ότι η ημερομηνία μόλυνσης ήταν 5 ημέρες πριν ξεκινήσουν τα συμπτώματα. Αυτή η εκτίμηση ήταν ανακριβής για ορισμένους ασθενείς.
    • Οι τεχνικές συλλογής δειγμάτων διέφεραν μεταξύ των μελετών.
    • Δεν ήταν δυνατός ο διαχωρισμός των ψευδώς αρνητικών ποσοστών ανά τύπο δείγματος (στοματοφαρυγγικό έναντι ρινοφαρυγγικού) αυτό μπορεί να έχει διαφορετικές ψευδώς αρνητικές αναλογίες.

    Πρόβλεψη μολυσματικού σοβαρού οξέος αναπνευστικού συνδρόμου Coronavirus 2 από διαγνωστικά δείγματα (Bullard, Μάιος 2020).

    Συνολικά, σε αυτήν την αναδρομική μελέτη διατομής, η ικανότητα καλλιέργειας του SARS-CoV-2 σε Ct & gt 24 ή η διάρκεια των συμπτωμάτων & gt 8 ημερών μπορεί να είναι χαμηλή. Οι συγγραφείς υποθέτουν ότι η καλλιέργεια είναι επαρκής υποκατάστατος της μολυσματικότητας, ενώ αυτή είναι μια λογική υπόθεση, δεν έχει αποδειχθεί.

    Πληθυσμός μελέτης:

    • Αναδρομική συγχρονική μελέτη 90 ασθενών με COVID-19 στον Καναδά.
    • Ρινοφαρυγγικά και ενδοτραχειακά δείγματα που ελήφθησαν από άτομα που δοκιμάστηκαν μεταξύ 0-21 ημερών μετά την έναρξη των συμπτωμάτων και επωάστηκαν σε κύτταρα Vero.

    Πρωτεύον τελικό σημείο:

    • Η σχέση μεταξύ των τιμών του κατώτατου ορίου κύκλου (Ct) του SARS-CoV-2 RT-PCR από αναπνευστικά δείγματα, έναρξη συμπτωμάτων σε δοκιμή (STT) και μολυσματικότητα στην κυτταρική καλλιέργεια.

    Σημαντικά ευρήματα:

    • Είκοσι έξι δείγματα (28,9%) κατέδειξαν ιική ανάπτυξη.
    • Δεν παρατηρήθηκε ανάπτυξη σε δείγματα με Ct > 24 ή STT >gt 8 ημερών.
    • Η Ct βρέθηκε να συσχετίζεται στατιστικά με θετική καλλιέργεια (OR 0,64 [95% CI: 0,49 &ndash 0,84]) για κάθε 1 μονάδα αύξησης στην τιμή Ct οι πιθανότητες μολυσματικότητας μειώθηκαν κατά 32%.
    • Το STT συσχετίστηκε με θετική καλλιέργεια (OR 0,63 [95% CI: 0,42 & ndash 0,94]) Για κάθε 1 ημέρα αύξηση του STT, η αναλογία πιθανοτήτων να είναι θετική καλλιέργεια μειώθηκε κατά 37%
    • Η μέγιστη πιθανότητα μιας θετικής καλλιέργειας ήταν την ημέρα 3 STT και μειώθηκε στη συνέχεια.

    Περιορισμοί:

    • Σχετικά μικρό μέγεθος δείγματος δεν είναι σαφές πόσα δείγματα ήταν διαθέσιμα την ημέρα.
    • Κανένας ασθενής δεν ήταν ασυμπτωματικός. Αυτά τα αποτελέσματα μπορεί να μην είναι γενικεύσιμα σε αυτόν τον πληθυσμό.
    • Η ανάμνηση του ασθενούς χρησιμοποιήθηκε για να προσδιοριστεί ότι είναι πιθανή η μεροληψία στην έναρξη των συμπτωμάτων.

    Δείγμα σάλιου ως μη επεμβατικό δείγμα για τη διάγνωση της νόσου του κορονοϊού 2019: μια μελέτη διατομής (Pasomsub, Μάιος 2020).

    Συνολικά, σε αυτή τη διασταυρούμενη μελέτη, το δείγμα σάλιου συνδέθηκε με μια ισχυρή συμφωνία θετικότητας SARS-CoV-2 RT-PCR σε σύγκριση με τα μπατονέτα του ρινοφάρυγγα και του λαιμού, ωστόσο, το μικρό μέγεθος δείγματος και η συμπερίληψη μόνο συμπτωματικών ασθενών περιορίζει τη γενικευσιμότητα των ευρημάτων .

    Πληθυσμός μελέτης:

    • 200 άτομα υπό έρευνα που παρακολούθησαν κλινική οξέων αναπνευστικών λοιμώξεων στην Ταϊλάνδη.
    • Τα άτομα συμπεριλήφθηκαν εάν είχαν ιστορικό ταξιδιού από ενδημική περιοχή του COVID-19 εντός 14 ημερών ή είχαν ιστορικό επαφής με άτομο που επιβεβαιώθηκε ότι είχε ή υποψία ότι είχε COVID-19.
    • Τα άτομα παρείχαν ρινοφαρυγγικά επιχρίσματα, επιχρίσματα λαιμού και δείγματα σάλιου

    Primary endpoint:

    Σημαντικά ευρήματα:

    • Among 19 patients diagnosed with COVID-19 by nasopharyngeal and throat swab RT-PCR, the median (IQR) onset of symptoms before the test was 3 (2&ndash11) days.
    • Using nasopharyngeal and throat swab RT-PCR as the reference standard, the prevalence of COVID-19 diagnosed by nasopharyngeal and throat swab RT-PCR was 9.5% (19/200) compared to 9% (18/200) with saliva.
    • The sensitivity and specificity of the saliva samples were 84.2% (95% CI 60.4&ndash96.6%), and 98.9% (95% CI 96.1&ndash99.9%), respectively.
    • Positive predictive value and negative predictive value were 88.9% (95% CI 65.3%&ndash98.6%), and 98.4% (95% CI 95.3%&ndash99.7%).
    • An analysis of the agreement between nasopharyngeal and throat compared to saliva showed a 97.5% observed agreement (&kappa coefficient 0.851 p < 0.001).

    Περιορισμοί:

    • Only patients with respiratory symptoms were enrolled therefore, these results cannot be applied to asymptomatic patients.
    • Small sample size (n=19).

    Virological assessment of hospitalized patients with COVID-19 (Wölfel, April 2020).

    Overall, in this small study of patients with mild COVID-19, peak virus load via RT-PCR was observed early after symptom onset (within 4 days) and viable virus was not cultured past day 8.

    Study population:

    • 9 hospitalized patients with mild COVID-19 from an epidemiologic cluster in Germany.
    • All patients were initially diagnosed by RT&ndashPCR from oro- or nasopharyngeal swab specimens.

    Primary endpoint:

    Σημαντικά ευρήματα:

    • The average viral load by RT-PCR was 6.76 × 105 copies per whole swab until day 5 viral load peaked on day 4, with 7.11 × 108 RNA copies per throat swab.
    • Samples taken after day 5 had an average viral load of 3.44 × 105 copies per swab.
    • SARS-CoV-2 was able to be cultured during the first week of symptoms in 16.66% of swabs and 83.33% of sputum samples.
    • Although viral RNA was detected by RT-PCR up to 28 days after symptom onset, viable virus was not able to be cultured after 8 days.
    • Once RT-PCR dropped below 106 copies/mL virus is no longer culturable.
    • Seroconversion in 50% of patients occurred by day 7, and in all patients by day 14, but this did not correlate with a rapid decline in viral load.

    Περιορισμοί:

    • Small sample size.
    • All patients had mild COVID-19, which may limit the generalizability of findings to patients with moderate-severe disease.

    Presymptomatic SARS-CoV-2 Infections and Transmission in a Skilled Nursing Facility (Kimball, April 2020).

    Overall, in this prospective point prevalence study of skilled nursing residents, patients who were presymptomatic had high viral loads by RT-PCR.

    Study population:

    • 76 residents in a skilled nursing facility (48 positive for COVID-19).
    • Residents were categorized as symptomatic if they had had at least one new or worsened typical or atypical symptom of COVID-19 in the preceding 14 days.
    • Asymptomatic residents were those who had no symptoms or only stable chronic symptoms (e.g., chronic cough without worsening).
    • Presymptomatic residents were those who were asymptomatic at the time of testing but developed symptoms within 7 days after testing.

    Primary endpoint:

    • Transmission of SARS-CoV-2 and the adequacy of symptom-based screening to identify infections in residents.

    Κλειδί findings:

    • 27 of 48 residents (56%) were asymptomatic at the time of testing of these patients, 24 (88.9%) developed symptoms.
    • Samples from these 24 presymptomatic residents had a median rRT-PCR cycle threshold value of 23.1, indicating a high viral load
    • Viable virus was cultured from 17 residents.

    Περιορισμοί:

    • This analysis was conducted in skilled nursing residents, which may limit the generalizability of the findings.
    • Symptom ascertainment in population was difficult, which could have lead to misclassification of patients.

    Temporal dynamics in viral shedding and transmissibility of COVID-19 (He, April 2020).

    Overall, in this prospective study, viral load in patients with COVID-19 was highest at the time of symptom onset.

    Study population:

    • 94 hospitalized patients with COVID-19 in China.
    • 66% were moderately ill none were classified as &lsquosevere&rsquo or &lsquocritical&rsquo on hospital admission.
    • 414 throat swabs were collected, from symptom onset up to 32 days after onset.
    • Modeled COVID-19 infectiousness profiles from a separate sample of 77 infector&ndashinfectee transmission pairs.

    Primary endpoint:

    Σημαντικά ευρήματα:

    • High viral loads were detected soon after symptom onset, then gradually decreased towards the detection limit by about day 21.
    • There was no difference in viral loads across sex, age groups and disease severity.
    • Based upon modeling COVID-19 infectiousness profiles, 44% of secondary cases were infected during the index cases&rsquo presymptomatic stage (95% CI 30&ndash57%).

    Περιορισμοί:

    • Patient recollection was used to determine symptom onset recall bias is possible.
    • Most patients had moderate COVID-19, which may limit the generalizability of these findings to patients with severe disease.

    Viral load dynamics and disease severity in patients infected with SARS-CoV-2 in Zhejiang province, China, January-March 2020: A retrospective cohort study (Zheng, April 2020).

    Overall, in this retrospective cohort study the median duration of positive RT-PCR tests in respiratory samples was 21 days in patients with severe disease and 14 days in patients with mild disease. The duration of SARS-CoV-2 positivity by RT-PCR was significantly longer in stool samples than in respiratory and serum samples.

    Study population:

    • Retrospective study of 96 hospitalized patients with COVID-19 in China 22 with mild disease and 74 with severe disease.
    • 3497 respiratory, stool, serum, and urine samples were collected.

    Primary endpoint:

    Σημαντικά ευρήματα:

    • RNA was detected in the stool of 55 patients (59%) and in the serum of 39 patients (41%).
    • Median duration of virus in stool (22 days, IQR 17-31 days) was significantly longer than in respiratory (18 days, IQR 13-29 days P=0.02) and serum samples (16 days, IQR 11-21 days P<0.001).
    • Median duration of virus in the respiratory samples of patients with severe disease (21 days, IQR 14-30 days) was significantly longer than in patients with mild disease (14 days, IQR 10-21 days P=0.04).
    • In patients with mild disease, viral loads peaked in respiratory samples in the second week from disease onset in patients with severe disease, viral load continued to be high during the third week of disease.

    Περιορισμοί:

    • Single-center study.
    • Data collected retrospectively, which may have allowed for confounding.
    • A small number of patients in the sample (22) had only mild disease.

    Prospective Evaluation of SARS-CoV-2 Viral Load in Upper Respiratory Specimens of Infected Patients (Zou, March 2020).

    Overall, in this small prospective study of patients with COVID-19, high viral loads were present early after symptom onset, compared to later.

    Study population:

    • 18 patients within 2 family clusters with COVID-19 from China - 1 person was asymptomatic, while 13 had pneumonia on CT.
    • 72 throat swabs and 72 nasal swabs were collected.

    Primary endpoint:

    Σημαντικά ευρήματα:

    • Viral loads were higher soon after symptom onset compared to later.
    • Higher viral loads were detected in the nose compared to the throat of patients.
    • The viral shedding pattern resembled that of influenza rather than SARS-CoV-2.
    • The viral load of the asymptomatic patient was similar to that of the symptomatic patients.

    Περιορισμοί:

    • Small sample size.
    • Patients were part of the same family cluster viral inoculum may have been higher in this group than in patients who are infected outside the home.

    Retrospective Evaluation of Detection of SARS-CoV-2 via RT-PCR in Different Types of Clinical Specimens (Wang, March 2020).

    Overall, in this retrospective evaluation of SARS-CoV-2 RT-PCR from various sites, samples from the lower respiratory tract had higher positivity rates than samples from the upper respiratory tract. Viral loads were higher in the nares.

    Study population:

    • 1070 specimens of SARS-CoV-2 from different sites in 205 hospitalized patients with COVID-19, 19% of whom had severe illness.
    • RT-PCR pharyngeal swabs were collected from most patients 1 to 3 days after hospital admission.
    • Blood, sputum, feces, urine, and nasal RT-PCR samples were collected throughout hospitalization.
    • Bronchoalveolar lavage fluid and fibrobronchoscope brush biopsy were sampled from patients with severe illness or undergoing mechanical ventilation.

    Primary endpoint:

    Σημαντικά ευρήματα:

    • Bronchoalveolar lavage fluid specimens showed the highest positive rates (14/15 93%), followed by sputum (72/104 72%), nasal swabs (5/8 63%), fibrobronchoscope brush biopsy (6/13 46%), pharyngeal swabs (126/398 32%), feces (44/153 29%), and blood (3/307 1%).
    • Nasal swabs had a higher mean cycle threshold than other sites (24.3, [1.4 × 106 copies/mL] vs 30 [(2.6 × 104 copies/mL]), indicating higher viral loads in the nares.

    Περιορισμοί:

    • Some patients did not have detailed clinical information available, limiting the data from being correlated with symptoms or disease course.
    • The sample size was small from some tissue areas.
    • The timing to sampling differed between sites, and thus the results may not be directly comparable.
    • Lower respiratory tract sampling occurred only in patients with severe disease findings for these patients may not be directly comparable with those for patients with mild-moderate disease.

    Additional Literature

    Evaluating the accuracy of different respiratory specimens in the laboratory diagnosis and monitoring the viral shedding of 2019-nCoV infections (Yang, February 2020). 213 patients hospitalized with COVID-19 in China provided 866 clinical respiratory samples, including nasal and throat swabs, sputum, and bronchoalveolar lavage fluid. Sputum samples were most likely to test positive by RT-PCR, regardless of the clinical severity of disease.

    Detection profile of SARS-CoV-2 using RT-PCR in different types of clinical specimens: A systematic review and meta-analysis (Bwire, July 2020). 8136 pooled clinical specimens analyzed to detect SARS-CoV-2 most were nasopharyngeal swabs (69.6%). Lower respiratory tract specimens had a positive rate of 71.3% bronchoalveolar lavage fluid had a positive rate of 91.8% sputum had a positive rate of 68.1% and nasopharyngeal swabs had a positive rate of 45.5%.


    Dr Andrew Rallis’s Letter to Parliment Re: Validity of RT PCR test to use as a diagnostic tool for Covid-19/SARS Cov2 viral infection, mass violation of civil liberties & transformation of society

    As a senior research scientist having completed my Postdoctoral studies in Stanford University in Pathology and my Masters in Virology in Imperial College London, as well having graduated with a PhD in Neurobiology from King’s College London, I am extremely concerned how the suppression of scientific evidence and the lack of open debate on the perceived Covid-19 Pandemic has culminated in fundamental changes in society, such as restrictions on freedom of travel and assembly, confinement and censorship by the mainstream media.

    Public fear and hysteria surrounding the perceived Covid-19 Pandemic has been elevated to levels completely out of sync with the actual threat. Professor John Ioannidis of Stanford University, one of the world’s leading and highly cited scientist quotes an infection fatality rate (IFR) for covid of 0.00057% of similar rates to the seasonal flu [1]. This study has not gained notoriety in the mainstream media but is published on the Word Health Organizations website.

    Furthermore, the inappropriate use of the Polymerase Chain reaction (PCR) test as a diagnostic tool for Covid-19, has culminated in a dramatic upsurge of the Covid-19 infection and infection fatality rates. In fact, the inventor of the PCR test Kerry Mullis, the Noble prize winner in Chemistry reported that the PCR test should not be used for diagnosis of viral infection [2]. The well-established protocol for detection of infectious viruses, is isolation and purification from human tissues/secretions and subsequent analysis and confirmation of coronavirus morphology under an electron microscope [3-5]. At present these studies are not carried out to diagnose infection and morbidity with covid 19. In fact, a recent study demonstrated that the use of nasopharyngeal samples, which tested positive for SARS-Cov2/Covid19 using a 30 cycle PCR amplification protocol contained no virus-like particles when analysed with a scanning electron microscopy [5]. Nevertheless, the WHO which advocates the Real-time RT PCR assay for the detection of SARS-CoV-2 recommends a 40-50 cycle amplification protocol to be used on a nationwide level by the CDC in China Pasteur Institute, Paris, France CDC, USA National Institute of Infectious Diseases, Japan Charité Germany HKU, Hong Kong SAR and the National Institute of Health, Thailand [6]. This extremely high number of PCR cycle numbers is known to generate false positives, since you get amplification of non-infectious viral fragments and cross-reacting nucleotides from other coronaviruses. In fact, Dr. Fauci the Director of the National Institute of Allergy and Infectious Diseases stated that “If you get a cycle threshold of 35 or more, the chances of it being replication-competent are minuscule” [7].

    Moreover, one of the primers utilised in the PCR detection protocol endorsed by WHO and developed in the Pasteur Institute, Paris [6] (nCoV_IP2-12759Rv CTCCCTTTGTTGTGTTGT) is an exact match for an 18-nucleotide region on human Chromosome 8 (GRCh38.p13 Primary Assembly) [8] , highlighting the necessity for specificity in testing. In this respect, isolating, purifying and imaging infectious coronavirus-19 viral particles from human tissue samples/secretions would prove a more reliable diagnostic method, rather than using the PCR test, which does not indicate the presence of entire coranavirus-19 infectious viral particles, could lead to false positives, and incorrectly diagnose healthy non-infected individuals as asymptomatic and coronavirus positive. Furthermore, a recent study from the Massachusetts Institute of Technology and Harvard University [9] found that that SARS/Cov2/Covid19 is also able to integrate fragments of its genetic material into human chromosomes, further confounding the use of the RT PCR test as a viral diagnostic tool.

    Furthermore, an extra-parliamentary committee of lawyers, investigating the covid-19 crisis in Germany (‘Stiftung Corona Ausschuss’) has acquired evidence of the individuals and organisations responsible for the politicisation and global propagation of the unreliable/erroneous SARS-CoV-2 RT PCR tests. The use of the RT PCR test to designate asymptomatic healthy individuals as covid-19 cases, has been utilised to implement confinement/lockdown measures from the beginning of the Covid-19 crisis on a worldwide level. The utilisation of the RT PCR test on a global scale has resulted in immense damages to individuals and businesses world-wide and court action is being initiated against those responsible. Recently two prominent UK scientists Dr. Mike Yeadon (a former vice-President of Pfizer company) and Dr. Clare Craig (an NHS pathologist), have given evidence on this matter in relation to the UK testing programme [10, 11].

    Finally, the urgent need to vaccinate the entire world populace propagated by the producers of the coronavirus vaccines and the experimental mRNA gene therapy developed by Pfizer/bioNtech as well as the push to implement vaccine passports by vested interests is a violation of personal choice and infringement of civil liberties. It is widely known that the human population has co-existed with cold coronaviruses throughout evolution and there are multiple studies demonstrating that large proportions of the population already possess cross-reacting antibodies capable of recognising SARS/Cov2/Covid 19 due to previous encounters with cold coronaviruses and are able to acquire natural immunity to covid19 [12-13]. Finally, the Centre for Disease Control and prevention has documented thousands of adverse effects from the Pfizer/bioNtech mRNA gene therapy through VAERS (the Vaccine Adverse Event Reporting System) including multiple morbidities such as muscle paralysis, tremors and convulsions, tachycardia (rapid heartbeat) and death [14]

    I thank you for your kind consideration in reading the above information and I hope this will assist in drawing your own conclusions on this urgent matter. Since this issue is of the upmost importance, the above letter has been sent to all members of the US Senate and congress as well as the British, German, French and Italian parliaments.

    (BSc: Biomedical Science -Kings College London) & Associate of Kings College London

    MSc: Molecular Biology and Pathology of Viruses – Imperial College London

    PhD: Neurobiology – Kings College London

    Postdoctoral Diploma: Pathology – Stanford

    1. John P A Ioannidis. Infection fatality rate of COVID-1937 inferred from seroprevalence data. Publication: Bulletin of the World Health Organization Type: Research Article ID: BLT.20.265892. Page 1. 14 October 2020. https://www.who.int/bulletin/onlinefirst/BLT. 20.265892.pdf

    2. Monique Andersson, Nicola Low , Neil French , Trisha Greenhalgh , Katie Jeffery , Andrew Brent , Jonathan, Ball , Allyson Pollock , David McCoy , Miren Iturriza-Gomara , Iain Buchan , Helen Salisbury , Deenan Pillay , Will Irving. Rapid roll out of SARS-CoV-2 antibody testing-a concern. BMJ 2020 Jun 24369:m2420.

    3. Goldsmith, C. S., and Miller, S. E. (2009). Modern Uses of Electron Microscopy for Detection of Viruses. CMR 22, 552–563. doi: 10.1128/CMR.00027-09

    4. Zhu, N., Zhang, D., Wang, W., Li, X., Yang, B., Song, J., et al. (2020). A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. New Engl. J. Med. 382, 727–733.

    5. Haddad G, Bellali S, Fontanini A, Francis R, La Scola B, Levasseur A, Bou Khalil J, Raoult D. Rapid Scanning Electron Microscopy Detection and Sequencing of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 and Other Respiratory Viruses. Front Microbiol. 2020 11: 596180. Published online 2020 Nov 19.

    8. Homo sapiens chromosome 8, GRCh38.p13 Primary Assembly – Nucleotide – NCBI (nih.gov)

    9. Liguo Zhang, Alexsia Richards, Andrew Khalil, Emile Wogram, Haiting Ma, Richard A. Young, Rudolf Jaenisch SARS-CoV-2 RNA reverse-transcribed and integrated into the human genome. bioRxiv. doi: https://doi.org/10.1101/2020.12.12.422516

    10. Helen J Steen, 61440 Oberursel, Germany. Rapid response to: Covid-19: politicisation, “corruption,” and suppression of science BMJ 2020 371 doi: https://doi.org/10.1136/bmj.m4425 (Published 13 November 2020).

    11. Kamran Abbasi Covid-19: politicisation, “corruption,” and suppression of science

    BMJ 2020 371 doi: https://doi.org/10.1136/bmj.m4425 (Published 13 November 2020)

    12. Kevin W NG et al. Preexisting and de novo humoral immunity to SARs-CoV-2 in humans. 6 Nov 2020 DOI: 10.1126/science.abe1107

    13. Alessandro Sette, Shane Crotty. Adaptive immunity to SARS-CoV-2 and COVID-19. Κύτταρο. 2021 Feb 18 184(4): 861–880.


    Συζήτηση

    The focus of this study was to develop a species-specific quantitative PCR protocol to diagnose Η. pinnaeΤο The SSU rDNA marked proved a good genetic result for both cPCR and qPCR approaches. This gene region is often a useful target for diagnostic tests, because there are both enough variability and many copies in the genome, which help to ensure good specificity and sensitivity [15]. For this reason, in this study the parasitic load of Η. pinnae is reported as copies of Η. pinnae by SSU rDNA / ng of extracted DNA.

    The specificity of these assays resulted in PCR amplification of DNA from Η. pinnae only and was negative in all the tests with the DNA of other protozoan parasites. In the last few years, species-specific real-time PCR procedures for the diagnosis of protozoan parasites in different mollusc species have been developed and applied to monitoring protocols. In fact, the protistan parasite Perkinsus marinus, a severe pathogen of the oyster Crassostrea virginica, was detectable by real-time PCR, showing specificity and sensitivity of this assay [16]. More recently, a rapid and sensitive diagnostic of Bonamia ostreae και σι. exitiosa in the European flat oyster Ostrea edulis [5] as well as a qPCR assay to determine prevalence and intensity of Haplosporidium nelsoni in oysters Crassostrea virginica [17], described sensitive techniques that can detect very low quantities of parasite DNA.

    The sensitivity of the qPCR technique described in this study using the cloned DNA fragment to avoid inhibitions in PCR reaction (3 SSU rDNA copies of Η. pinnae / ng of fan mussel DNA) is presented as the ideal molecular diagnostic technique for monitoring protocols. Regarding the detection of the SSU rDNA region of Η. pinnae, the recommendation is to use the primers described by Catanese et al 2018 [4] whose sensitivity is 207 copies of the DNA of Η. pinnae / ng of fan mussel DNA.

    However, as expected, this study showed some differences in positive amplification resulted using the two methods. In fact, samples negative for cPCR but positive with qPCR confirmed the lower sensitivity of conventional PCR in relation to quantitative approach. Other studies have shown problems with cPCR working with low quantity of tissue, because light infections may be missed if tissue is subsampled or because inhibitory factors in mollusc tissues may give false negative results [15]. In our study, the amplification control supports this hypothesis. In fact, two sample (PN3 and PN7), with negative amplification in qPCR, showed amplicons only for the control amplification in cPCRs but resulting also negative for the Η. pinnae detection. Otherwise in other two samples (PN25 and PN30), qPCR detected <1 copy of Η. pinnae SSU rDNA, but no amplification was observed in cPCR assays, including in the control of amplification, probably due to a strong degradation of the DNA or to the eventual presence of PCR-inhibitors that may not have been eliminated during extraction with the tissue kits.

    In this study, the quality of the used sample tissue should be also considered. Although it has been highlighted that the sporulation stages of Η. pinnae were exclusively observed in the digestive gland tubules of Π. nobilis, those resulted often darker and softer than the normal appearance and sometimes presented liquefaction [2–3], indicating that digestive gland is one of the first tissues to degrade after death of fan mussel. The mantle sampling is easy to undertake επί τόπου without much disturbance to living specimens and it has been previously tested to obtain samples in many Π. nobilis populations for genetic studies. Moreover, we must consider that these animals are in a critical situation and, in the time of carrying out this study, the authorities only allowed sampling the fan mussels when they were dead, showing evidence of parasite infection. Only at a later time, to increase the monitoring frequency in Western and Central Mediterranean populations, authorities suggested and allowed new precautionary measures, including to take tissue biopsies of the mantle from the alive specimens to find out the presence or absence of the parasite (http://medpan.org/pinna-nobilis-mass-mortality-outbreak-in-the-mediterranean-recommendations-for-mpas). As consequence, the use of the mantle of Π. nobilis as reference tissue for molecular biology Η. pinnae detection was highly recommended. For this study the mantle was sampled and analysed regardless of the presented appearance, although in PN9, PN24, PN25, PN26, PN28, PN29 and PN30 samples showed signs of degradation (ratio 260/280 < 1.8) only PN25 and PN30 failed of cPCR control reaction.

    Therefore, we observed that the methods of tissue conservation would seem to have uncommon effects in the cPCR, probably due to the dissimilar action of inhibitors or sensitivity of the different Taq polymerases used by the two laboratories. In contrast, in the qPCR of Η. pinnae, diagnostic was positive for all of them except PN3 and PN7, which did not show DNA degradation signs. Therefore, there are substances in the DNA samples that could inhibit the polymerase of cPCR without affecting the qPCR.

    Moreover, we must consider that both laboratories have been using tissue kits for the extraction of the target DNA (Material and methods paragraph “Sample collection and genetic DNA extraction”). Audermard et al 2004 [16] showed that if the sample presents inhibitors, the tissue kit is not efficient to eliminate them. Although in this study, the amount of DNA obtained from each fan mussel has been acceptable, the molecular diagnosis failed and one of the reasons may be that the enzymatic lysis was insufficient due to the poor state of the tissues [18]. Therefore, when the animal to be sampled is dead or has a bad appearance, the recommendation is to use stool kits. On the contrary, if the analysis to be carried out is on living tissues (for example biopsies) the efficiency is significantly higher with tissue kits, especially in bivalve molluscs [16].

    The here presented diagnostic protocol by qPCR, revealed that 94% of the 32 analysed mantle tissues of fan mussel were infected by Η. pinnae, showing a high sensitivity and specificity for its detection (100% if we don't consider negative and too much degraded samples). The sensitivity and specificity qPCR method led us to infer that there could be some false positives (very low quantity of copy) or false negative (DNA degradation or presence of PCR-inhibitor compounds).

    The application of the assay offers much potential for studies to understand parasite communities and its diffusion, disease risk, host–parasite interactions and parasite impact in ecosystem processes [19]. We do not know how Η. pinnae is transported and infects the fan mussels, even though the most plausible access route of the parasite is the digestive tract during the filtration of nutrients, thus interfering with food absorption and causing severe general dysfunction with fatal outcome [2–3].

    The described protocol presents the advantages of high sensitivity and high specificity, and it is reliable for a rapid screening to detect the presence of the pathogen from very small mantle samples, including from the biopsy of alive but potentially infected fan mussels, or to determine the relative abundance in the environment, such as water samples in the field.


    Δες το βίντεο: SYBR Green qPCR (Φεβρουάριος 2023).