Πληροφορίες

Πώς λειτουργούν τα εσωτερικά κανάλια διορθωτικού καλίου στην καρδιά;

Πώς λειτουργούν τα εσωτερικά κανάλια διορθωτικού καλίου στην καρδιά;


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Προφανώς στα καρδιομυοκύτταρα, υπάρχει ένα εσωτερικό διορθωτικό κανάλι καλίου που λειτουργεί κατά τη φάση 4 του δυναμικού δράσης των καρδιομυοκυττάρων. Έχω ακούσει ότι παρά το ότι αυτό το κανάλι καλίου αναφέρεται ως ένα προς τα μέσα διορθωτικό κανάλι, ότι in vitro Το κανάλι στην πραγματικότητα εξακολουθεί να μεταφέρει κάλιο από το εσωτερικό στο εξωτερικό του κυττάρου. Φαίνεται ότι η Wikipedia φαίνεται να προτείνει διαφορετικά (;).

Μπορεί κάποιος να εξηγήσει τι κάνει ο εσωτερικός διόρθωση καναλιού καλίου και ο ρόλος του στη φάση 4 του δυναμικού δράσης των μυοκυττάρων;


Σύμφωνα με το εγχειρίδιο ιατρικής φυσιολογίας του Boron:

"Αν και τα κανάλια καλίου που ανορθώνουν προς τα μέσα περνούν το ρεύμα καλύτερα προς τα μέσα παρά προς τα έξω, το δυναμικό της μεμβράνης (Vm) δεν είναι συνήθως πιο αρνητικό από το Ek (δυναμικό ισορροπίας του καλίου κατά μήκος της μεμβράνης). Έτσι, το καθαρό ρεύμα K+ δεν εμφανίζεται φυσιολογικά Ως αποτέλεσμα, η ενεργοποίηση των καναλιών GIRK (πρωτεΐνη G που συνδέεται προς τα μέσα με διόρθωση εσωτερικά του διαύλου καλίου) υπερπολώνει τα καρδιακά κύτταρα αυξάνοντας την αγωγιμότητα Κ+ ή το εξωτερικό ρεύμα Κ+ ».


Μηχανισμός πύλης του κλωνοποιημένου προς τα μέσα ανορθωτή καναλιού καλίου από την καρδιά του ποντικού

Το συμπληρωματικό DNA που κωδικοποιεί την εσωτερική διόρθωση του διαύλου καλίου κλωνοποιήθηκε από την καρδιά του ενήλικα ποντικού χρησιμοποιώντας την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Ο κλώνος είχε την νουκλεοτιδική αλληλουχία πανομοιότυπη με εκείνη του γονιδίου IRK1 που κλωνοποιήθηκε από μια κυτταρική σειρά μακροφάγου ποντικού. Η ανάλυση στυπώματος Northern αποκάλυψε ότι το αντίγραφο αυτού του γονιδίου εκφράστηκε κυρίως στην κοιλία, όπου ο εσωτερικός σωλήνας ανορθωτή Κ + παίζει κυρίαρχο ρόλο στη διατήρηση της υψηλής αρνητικής τιμής του δυναμικού της μεμβράνης ηρεμίας. Το ρεύμα που εκφράζεται με έγχυση του συμπληρωματικού RNA του κλωνοποιημένου γονιδίου σε Ξενοπούς τα ωοκύτταρα έδειξαν μια έντονη εσωτερική διόρθωση που εξαρτάται από την κινητήρια δύναμη του Κ +. Μια περιοχή αρνητικής αγωγιμότητας κλίσης παρατηρήθηκε στη σχέση ρεύματος-τάσης σε δυναμικά θετικά στο δυναμικό αντιστροφής. Όταν αυξήθηκε η εξωκυττάρια συγκέντρωση Κ +, η αύξηση του πλάτους εξωτερικού ρεύματος είχε ως αποτέλεσμα την «διασταύρωση» σχέσεων τάσης εξωτερικού ρεύματος. Η ταχέως εξαρτώμενη από το χρόνο αύξηση του πλάτους του ρεύματος καταγράφηκε κατά την επαναπόλωση της μεμβράνης από δυνητικά θετικό στο αναστρέψιμο δυναμικό. Η κινητική του χρονικά εξαρτώμενου ρεύματος ήταν πολύ παρόμοια με εκείνη του εγγενή μηχανισμού πύλης του φυσικού καρδιακού εσωτερικού ανορθωτή καναλιού Κ +. Τα αποτελέσματά μας υποδηλώνουν την ύπαρξη του εγγενή μηχανισμού πύλης, που αντιπροσωπεύει την έκταση της διόρθωσης στη σχέση ρεύματος-τάσης στο εκφρασμένο κανάλι.

Αυτή είναι μια προεπισκόπηση περιεχομένου συνδρομής, πρόσβαση μέσω του ιδρύματός σας.


Μηχανισμός εσωτερικής διόρθωσης

Εσωτερική διόρθωση του Κir Τα κανάλια είναι το αποτέλεσμα αποκλεισμού υψηλής συγγένειας από ενδογενείς πολυαμίνες, συγκεκριμένα τη σπερμίνη και το ιόν μαγνησίου που κλείνουν τον πόρο του καναλιού σε πιο θετικά δυναμικά. Ενώ η κύρια ιδέα του μπλοκ πολυαμίνης είναι κατανοητή, οι συγκεκριμένοι μηχανισμοί είναι άγνωστοι. Έτσι, όταν το δυναμικό της μεμβράνης γίνεται λιγότερο αρνητικό (αποπόλωση), το κανάλι μπλοκάρεται και η εκροή καλίου περιορίζεται. Αυτό το μειωμένο ρεύμα προς τα έξω (με το εσωτερικό ρεύμα ανεπηρέαστο) έχει ως αποτέλεσμα περισσότερο καθαρό ρεύμα να διοχετεύεται προς τα μέσα παρά προς τα έξω, επομένως το ρεύμα διορθώνεται προς τα μέσα.


Digital Commons @ RU

Ο καρδιακός ρυθμός ρυθμίζεται στενά από τις συνδυασμένες επιδράσεις των συμπαθητικών και παρασυμπαθητικών κλάδων του αυτόνομου νευρικού συστήματος. Αυτοί οι δύο κλάδοι ελέγχουν τον καρδιακό ρυθμό διεγείροντας διαφορετικούς υποδοχείς συζευγμένους με πρωτεΐνη G (GPCRs), οι οποίοι με τη σειρά τους ενεργοποιούν κανάλια ιόντων που τροποποιούν τις ηλεκτρικές ιδιότητες των κυττάρων του καρδιακού βηματοδότη. Η συμπαθητική διέγερση επιταχύνει τον καρδιακό ρυθμό μέσω της ενεργοποίησης των βήτα-αδρενεργικών υποδοχέων (βARs), οι οποίοι ανοίγουν κανάλια διεγερτικών ιόντων μέσω της οδού διεγερτικής πρωτεΐνης G (Gαs). Η παρασυμπαθητική διέγερση επιβραδύνει τον καρδιακό ρυθμό μέσω της ενεργοποίησης του μουσκαρινικού υποδοχέα ακετυλοχολίνης M2 (M2Rs), ο οποίος αναστέλλει την επίδραση της συμπαθητικής διέγερσης μέσω της οδού της ανασταλτικής πρωτεΐνης G (Gαi). Τα M2R απελευθερώνουν επίσης υπομονάδες βήτα-γάμα πρωτεΐνης G (Gβγ), οι οποίες επιβραδύνουν τον καρδιακό ρυθμό ενεργοποιώντας τα εσωτερικά κανάλια καλίου (GIRK) που καλύπτονται από την πρωτεΐνη G. Είναι ενδιαφέρον ότι τα βAR απελευθερώνουν επίσης το ίδιο ελεύθερο Gβγ, αλλά το GIRK δεν ενεργοποιείται. Ο μοριακός μηχανισμός στον οποίο βασίζεται αυτή η εξειδίκευση χαρακτηρίζεται ελάχιστα. Ποια είναι η μοριακή βάση πίσω από την εξειδίκευση σηματοδότησης; Έχει προταθεί ότι τα κανάλια GIRK σχηματίζουν ένα μακρομοριακό υπερσύμπλεγμα με υποδοχείς συζευγμένους με Gαi και πρωτεΐνες G, επιτρέποντας στην απελευθερωμένη Gβγ να συνδεθεί και να ενεργοποιήσει το GIRK από εγγύτητα. Ωστόσο, τα στοιχεία για την ύπαρξη του συγκροτήματος παραμένουν αμφιλεγόμενα. Στο πρώτο μέρος της διατριβής μου, αμφισβητώ την υπερ σύνθετη υπόθεση παρέχοντας τρία πειραματικά σύνολα ενάντια στη θεωρία. Πρώτον, ο συν-εντοπισμός GIRK με GPCR δεν δείχνει καμία προτίμηση στα M2R έναντι των β2AR. Δεύτερον, τα β2AR δεν ενεργοποιούν τα κανάλια GIRK ακόμη και όταν είναι συνεντοπισμένα. Τρίτον, ούτε τα ετεροτριμερή Gαi1 ούτε η πρωτεΐνη G αλληλεπιδρούν λειτουργικά με καθαρισμένα κανάλια GIRK1/4 στο επίπεδο διπλό στρώμα λιπιδίων. Καταλήγω ότι ο συν-εντοπισμός πρωτεΐνης δεν είναι ο υποκείμενος μηχανισμός για να εξηγήσει γιατί τα κανάλια GIRK ενεργοποιούνται ειδικά από υποδοχείς συζευγμένους με Gai. Στη συνέχεια, προσπάθησα να καθορίσω τη μοριακή βάση πίσω από την εξειδίκευση της σηματοδότησης. Χρησιμοποιώντας ηλεκτροφυσιολογικές τεχνολογίες και δοκιμές βιοφωταύγειας συντονισμού μεταφοράς ηλεκτρονίων (BRET), δείχνω ότι τα M2R καταλύουν την απελευθέρωση των υπομονάδων Gβγ σε υψηλότερους ρυθμούς από τα β2ARs, δημιουργώντας υψηλότερες συγκεντρώσεις Gβγ που ενεργοποιούν το GIRK και ρυθμίζουν άλλους στόχους του Gβγ. Ο υψηλότερος ρυθμός απελευθέρωσης Gβγ οφείλεται σε ταχύτερο ρυθμό συσχέτισης πρωτεϊνών GPCR-G σε M2R σε σύγκριση με β2AR. Καταλήγω στο συμπέρασμα ότι η δραστηριότητα των καναλιών GIRK καθορίζεται απλώς από την αποτελεσματικότητα της απελευθέρωσης Gβγ από GPCR. Φυσιολογικά, μόνο υποδοχείς συζευγμένοι με Gαi μπορούν να παρέχουν επαρκή συγκέντρωση Gβγ για ενεργοποίηση των καναλιών GIRK. Στο δεύτερο μέρος της πτυχιακής μου εργασίας, παρουσιάζω την εργασία μου για τον λειτουργικό χαρακτηρισμό της ρύθμισης Gβγ και Na+ δύο καρδιακών καναλιών GIRK, των ετεροτετραμερών GIRK1/4 και των ομοτετραμερών GIRK4. Είναι γνωστό ότι τα καρδιακά κανάλια GIRK αποτελούνται από ετεροτετραμερή GIRK1/4 και ομοτετραμερή GIRK4. Ωστόσο, λίγα είναι γνωστά για τη λειτουργική διαφορά μεταξύ των δύο καναλιών. Χρησιμοποιώντας καθαρισμένες πρωτεΐνες και το επίπεδο σύστημα διπλής στιβάδας λιπιδίων, διαπιστώνω ότι η σύνδεση Na+ αυξάνει τη συγγένεια Gβγ στα ομο-τετραμερή GIRK4 και ως εκ τούτου αυξάνει την ανταπόκριση GIRK4 στη διέγερση της πρωτεΐνης G. Τα ετεροτετραμερή GIRK1/4 δεν ενεργοποιούνται με Na+, αλλά είναι σε μόνιμη κατάσταση υψηλής απόκρισης στο Gβγ, υποδηλώνοντας ότι η υπομονάδα GIRK1 λειτουργεί σαν υπομονάδα GIRK4 με Na+ μόνιμα συνδεδεμένη.

Σχόλια

Πτυχιακή εργασία που παρουσιάστηκε στη Σχολή του Πανεπιστημίου Rockefeller για μερική εκπλήρωση των απαιτήσεων για το βαθμό του Διδάκτορα της Φιλοσοφίας


Μοριακή Δομή Κ καναλιών

Οι μοριακές βιολογικές τεχνικές ήταν επιτυχείς στην παραγωγή λεπτομερών πληροφοριών σχετικά με τις αλληλουχίες αμινοξέων που περιλαμβάνουν πρωτεΐνες διαύλου ιόντων. Η κλωνοποίηση της αλληλουχίας DNA που κωδικοποιεί ένα νέο κανάλι ιόντων συνήθως προέρχεται είτε από τη γνώση της πρωτεϊνικής αλληλουχίας είτε από την ειδική ηλεκτροφυσιολογική λειτουργία της σε μια λειτουργική δοκιμασία για τον προσδιορισμό του συγκεκριμένου γονιδίου. Οι ηλεκτροφυσιολόγοι έπαιξαν καθοριστικό ρόλο σε αυτή τη διαδικασία αναγνωρίζοντας πρώτα ένα συγκεκριμένο ρεύμα σε ένα συγκεκριμένο κύτταρο του οποίου μια νέα κλωνοποιημένη αλληλουχία μπορεί να είναι η πηγή.

Μόλις αναγνωριστεί ένας κλώνος πλήρους μήκους, μία από τις κύριες προσπάθειες που ακολουθούν είναι να κατανοήσουμε πώς η ανακαλυφθείσα αλληλουχία σχετίζεται με άλλα γνωστά κανάλια και ποιες ακολουθίες δημιουργούν συγκεκριμένες λειτουργίες. Αυτό που προέκυψε από αυτή την ανάλυση των κλωνοποιημένων καναλιών Κ είναι μια εικόνα τόσο αλληλεπίδρασης όσο και ποικιλομορφίας.

Μοτίβα ή δομικοί τομείς που βρέθηκαν σε κανάλια Κ με τάση

Η κλωνοποίηση του καναλιού Shaker έδωσε την πρώτη ευκαιρία ανάλυσης της πρωτογενούς αλληλουχίας αμινοξέων ενός καναλιού Κ. Ταυτόχρονα, άλλοι ερευνητές κλωνοποιούσαν κανάλια νατρίου (Na) και ασβεστίου (Ca) με τάση, [4,5] και αμέσως έγινε σαφές ότι οι θεμελιώδεις δομές όλων αυτών των καναλιών ήταν στενά συνδεδεμένες. Οι πρωτεΐνες των καναλιών Na ή Ca με πύλη τάσης αποτελούνται από μια μεγάλη συνεχή αλληλουχία που κωδικοποιεί τέσσερα επαναλαμβανόμενα στοιχεία, καθένα από τα οποία είναι ομόλογο με μία πρωτεΐνη Shaker (Εικόνα 1Α). Ένα μόνο από αυτά τα δομικά στοιχεία πιστεύεται ότι εκτείνεται στη μεμβράνη έξι φορές (Εικόνα 1Β). Είναι πλέον σταθερά αποδεδειγμένο ότι χρειάζονται τέσσερις πρωτεΐνες Shaker για τη συναρμολόγηση ενός λειτουργικού καναλιού K με πύλη τάσης (K V ), [6] δημιουργώντας έτσι μια δομή παρόμοια με τα κανάλια Na και Ca με πύλη τάσης, ένα που έχει χωριστεί σε υπομονάδες.

Εικόνα 1. Διατηρημένη δομή των καναλιών Κ. Οι πρωταρχικές αλληλουχίες αμινοξέων των καναλιών Na και Ca με τάση (Α) εμφανίζουν μια επαναλαμβανόμενη δομή τομέα ομόλογη με μεμονωμένες υπομονάδες καναλιού Κ (Β). Τα κυλινδρικά τμήματα της αλυσίδας αμινοξέων αντιπροσωπεύουν άλφα-έλικα διαμεμβρανικά συστατικά της δομής πρωτεΐνης καναλιού. Ο τομέας πόρων ή Η5 είναι ένα εξαιρετικά διατηρημένο χαρακτηριστικό στα κανάλια al K που εμφανίζονται μεταξύ δύο διατηρημένων διαμεμβρανικών τμημάτων (S5 και S6). Οι υπομονάδες με πύλη τάσης έχουν επίσης τέσσερις άλλες περιοχές που εκτείνονται σε μεμβράνη που ανιχνεύουν αλλαγές στο δυναμικό της μεμβράνης (κυρίως τα φορτισμένα υπολείμματα στο S4). Τα αμινο (Ν)- και τα καρβοξυ (C) -τερμινά συμβάλλουν στην απενεργοποίηση και διαμόρφωση από μικρά μόρια (Ca (++) και ATP). Ένθετο: προβολή από ψηλά του επιπέδου της μεμβράνης (εξωκυτταρική πλευρά) που απεικονίζει πώς τέσσερις υπομονάδες καναλιών Κ μπορούν να διευθετηθούν για να σχηματίσουν έναν κεντρικό πόρο και πώς συσκευάζονται τα έξι διαμεμβρανικά τμήματα κάθε υπομονάδας. Δομικό μοντέλο σύμφωνα με τους Durell και Guy. [103]

Εικόνα 1. Διατηρημένη δομή καναλιών Κ. Οι πρωταρχικές αλληλουχίες αμινοξέων των καναλιών Na και Ca με τάση (Α) εμφανίζουν μια επαναλαμβανόμενη δομή τομέα ομόλογη με μεμονωμένες υπομονάδες καναλιού Κ (Β). Τα κυλινδρικά τμήματα της αλυσίδας αμινοξέων αντιπροσωπεύουν άλφα-ελικοειδή διαμεμβρανικά συστατικά της δομής πρωτεΐνης καναλιού. Η περιοχή πόρων ή Η5 είναι ένα εξαιρετικά διατηρημένο χαρακτηριστικό σε κανάλια al K που εμφανίζονται μεταξύ δύο διατηρημένων διαμεμβρανικών τμημάτων (S5 και S6). Οι υπομονάδες με πύλη τάσης έχουν επίσης τέσσερις άλλες περιοχές που εκτείνονται σε μεμβράνη που ανιχνεύουν αλλαγές στο δυναμικό της μεμβράνης (κυρίως τα φορτισμένα υπολείμματα στο S4). Τα αμινο (Ν)- και τα καρβοξυ (C) -τερμινά συμβάλλουν στην απενεργοποίηση και διαμόρφωση από μικρά μόρια (Ca (++) και ATP). Εισαγωγή: άποψη από πάνω το επίπεδο της μεμβράνης (εξωκυτταρική πλευρά) που απεικονίζει τον τρόπο με τον οποίο τέσσερις υπομονάδες καναλιού Κ μπορούν να διαταχθούν για να σχηματίσουν έναν κεντρικό πόρο και πώς είναι συσκευασμένα τα έξι διαμεμβρανικά τμήματα κάθε υπομονάδας. Δομικό μοντέλο σύμφωνα με τους Durell και Guy. [103]

Τα γονίδια που κωδικοποιούν διαύλους Κ με πύλη τάσης υπάρχουν όχι μόνο στη Drosophila αλλά και στα θηλαστικά και είναι αναγνωρίσιμα ως κανάλια Κ διαθέτοντας μια διατηρημένη αλληλουχία αμινοξέων. Αυτή η δομή, που ονομάζεται περιοχή «H5» ή «πόρος», βρίσκεται σε όλα τα κανάλια Κ που έχουν κλωνοποιηθεί μέχρι σήμερα και πιστεύεται ότι δημιουργεί την επένδυση της οδού αγωγιμότητας ιόντων. Πειράματα που κάνουν συγκεκριμένες μεταλλάξεις σε αυτήν την αλληλουχία σχηματισμού πόρων έχουν αποδείξει ότι είναι απαραίτητο για την επιλεκτικότητα καλίου του διαύλου και για τη δέσμευση του αποκλειστή Κ καναλιού ΤΕΑ +. [7] Επομένως, η εύρεση αυτής της ακολουθίας υπογραφής προσδιορίζει έναν νέο κλώνο ως κανάλι Κ.

Ένα άλλο διατηρημένο χαρακτηριστικό βρίσκεται στο τέταρτο τμήμα που καλύπτει τη μεμβράνη (S4). Βρέθηκαν σε όλα τα κανάλια ιόντων με τάση, συμπεριλαμβανομένων των καναλιών Na και Ca, οι περιοχές S4 περιέχουν θετικά φορτισμένα υπολείμματα αμινοξέων, επιτρέποντάς τους να συμμετέχουν στην "ανίχνευση" αλλαγών στο δυναμικό της μεμβράνης. Τα φορτισμένα αμινοξέα αλλάζουν προσανατολισμό κατά τη διάρκεια της αποπόλωσης της μεμβράνης για να ανοίξουν την οδό αγωγιμότητας ιόντων. Η κίνηση αυτών των φορτισμένων υπολειμμάτων μπορεί ακόμη και να μετρηθεί ως μικροσκοπικά ρεύματα πύλης.

Από την κλωνοποίηση του Shaker, έχουν απομονωθεί περισσότερα γονίδια που κωδικοποιούν μια ποικιλία υπομονάδων καναλιών Κ με πύλη τάσης. Έχουν ομαδοποιηθεί σε τέσσερις υποοικογένειες με βάση την ομοιότητα των αλληλουχιών αμινοξέων τους και το αν θα συναθροιστούν με άλλες υπομονάδες (Πίνακας 1). Για παράδειγμα, όλα τα μέλη της υποοικογένειας αναδευτήρων έχουν περισσότερο από το 60% της πρωτογενούς αλληλουχίας αμινοξέων τους ίδια με άλλες υπομονάδες αναδευτήρα, αν και σε σύγκριση με τα μέλη της υποοικογένειας shab, τα μέλη του αναδευτήρα είναι μόνο περίπου 40% ομόλογα. Επιπλέον, οι υπομονάδες αναδευτήρων δεν μπορούν να συνδυαστούν με υπομονάδες shab (ούτε με μέλη υποοικογένειας shaw ή shal) για να παράγουν λειτουργικά κανάλια ιόντων.

Πίνακας 1. Οικογένειες K Channel

3u9zyqmY71w9yYK85yiZ2mMV96jcJAGO4g __ & ampKey-Pair-Id = APKAIE5G5CRDK6RD3PGA " />

Τα τελευταία χρόνια, οι ερευνητές ανακάλυψαν επίσης άλλες αλληλουχίες πρωτεϊνών χωρίς ομολογία με υπομονάδες με πύλη τάσης, αλλά μπορεί να αποδειχθεί ότι συνσυναρμολογούνται με αυτές και ρυθμίζουν τη λειτουργία τους. Όταν τα αυθεντικά κανάλια Κ καθαρίζονται από τον εγκέφαλο των θηλαστικών, απομονώνονται μεγάλα μοριακά σύμπλοκα (μοριακό βάρος, περίπου 400 kd). Αυτά τα μακρομοριακά σύμπλοκα αποδείχθηκε ότι περιλαμβάνουν οκτώ μεμονωμένες πρωτεΐνες, που αντιπροσωπεύουν τέσσερα αντίγραφα δύο διαφορετικών τύπων πρωτεΐνης. [8] Τέσσερις υπομονάδες καναλιού Κ με τάση τάσης ([υπομονάδες [μικρά γράμματα άλφα]) βρέθηκαν να σχετίζονται με τέσσερα αντίγραφα μιας νέας πρωτεΐνης που ονομάζεται [ελληνικά μικρά γράμματα βήτα] υπομονάδες. Η επακόλουθη κλωνοποίηση των γονιδίων για τις [μονάδες μικρού γράμματος βήτα] 1, [ελληνικά μικρά γράμματα βήτα] 2, και [ελληνικά μικρά γράμματα βήτα] 3 υπομονάδες αποκάλυψαν νέες αλληλουχίες για αυτές τις υδρόφιλες πρωτεΐνες χωρίς ομολογία σε άλλα κανάλια Κ. Η συνέκφραση του [ελληνικού μικρού γράμματος βήτα] 1 με υπομονάδες της υποοικογένειας Shaker [ελληνικό μικρό γράμμα άλφα] φαίνεται να μεταβάλλει τη λειτουργία τους επιταχύνοντας την απενεργοποίηση του ρεύματος K +.

Άλλες οικογένειες K Channel

Τα ενεργοποιημένα κανάλια K Ca ++ (K Ca ) είναι δομικά παρόμοια με τα κανάλια K με πύλη τάσης. Οι ηλεκτροφυσιολόγοι στη δεκαετία του 1960 εντόπισαν ρεύματα Κ σε αρκετούς ιστούς που όχι μόνο ενεργοποιούνταν με τάση, αλλά των οποίων η ανοιχτή πιθανότητα διέπεται επίσης από ενδοκυτταρικές συγκεντρώσεις Ca ++. Αυτά τα ρεύματα βρίσκονται σε νευρώνες, μυς και εκκριτικά κύτταρα σε σπονδυλωτά και αναστέλλονται ισχυρά από τη χαριβδοτοξίνη, μια τοξίνη που απομονώνεται από το δηλητήριο του σκορπιού. Η απώλεια αυτού του ενεργοποιημένου ρεύματος Ca ++ στον μυ της Drosophila προκαλεί τον φαινότυπο της αργής ροής. [9] Όταν το γονίδιο που κωδικοποιεί αυτό το κανάλι κλωνοποιήθηκε, η δομή του βρέθηκε να έχει πολλά κοινά στοιχεία με τις υπομονάδες τύπου Shaker, συμπεριλαμβανομένων των τομέων H5 και S4, αλλά επιπλέον, αυτή η αλληλουχία κωδικοποίησε επίσης μια μακρά επέκταση στο καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης που υποτίθεται ότι λειτουργεί στην ανίχνευση των επιπέδων Ca ++ ή για τη διαμόρφωση από άλλα μικρά μόρια (Εικόνα 1Β). Η σχέση αυτών των καναλιών μεταξύ τους έγινε σαφέστερη με τις νέες πληροφορίες που προέρχονται από έργα αλληλουχίας γονιδιώματος (προς συζήτηση).

Εσωτερική διόρθωση Κ καναλιών. Μια άλλη οικογένεια καναλιών Κ, οι εσωτερικοί ανορθωτές (K ir), μπορούν να θεωρηθούν ως "λειτουργικό θραύσμα" ενός καναλιού τύπου τάσης (Σχήμα 2Α, αριστερά). Εδώ, η περιοχή διατηρημένων πόρων συνδέει δύο διαμεμβρανικές αλληλουχίες. [10] Αυτές οι αλληλουχίες που καλύπτουν μεμβράνες είναι οι μόνες που υπάρχουν σε μια εσωτερική ακολουθία ανορθωτή και είναι ομόλογες με τα διαμεμβρανικά τμήματα S5 και S6 του Shaker. Οι εσωτερικοί ανορθωτές έχουν μοναδικές ηλεκτροφυσιολογικές ιδιότητες (προς συζήτηση) που τις καθιστούν απαραίτητες σε πολλούς ιστούς για τη σταθεροποίηση του δυναμικού της μεμβράνης.

Εικόνα 2. Διαμεμβρανική τοπολογία εσωτερικών ανορθωτών (αριστερά) και διαδοχικών πόρων (δεξιά) καναλιών Κ. Στο κάτω μέρος απεικονίζεται ένα αποκομμένο τμήμα ενός μοντέλου ενός εσωτερικού ανορθωτή καναλιού Κ που εμφανίζει την υποτιθέμενη σχέση της επικράτειας του πόρου (Η5) με παρακείμενα διαμεμβρανικά τμήματα. Τα ιόντα μαγνησίου και οι πολυαμίνες εμποδίζουν τα προς τα έξω ρεύματα Κ από την ενδοκυτταρική πλευρά του διαύλου ιόντων.

Εικόνα 2. Διαμεμβρανική τοπολογία εσωτερικών ανορθωτών (αριστερά) και διαδοχικών πόρων (δεξιά) καναλιών Κ. Στο κάτω μέρος φαίνεται ένα αποκομμένο τμήμα ενός μοντέλου ενός καναλιού K ανορθωτή προς τα μέσα που εμφανίζει την πιθανή σχέση της περιοχής επένδυσης πόρων (Η5) με γειτονικά διαμεμβρανικά τμήματα. Τα ιόντα μαγνησίου και οι πολυαμίνες αποκλείουν τα εξωτερικά ρεύματα Κ από την ενδοκυτταρική πλευρά του καναλιού ιόντων.

Ένα μοντέλο του τρόπου με τον οποίο ένα κανάλι K ανορθωτή προς τα μέσα συναρμολογείται εντός της κυτταρικής μεμβράνης φαίνεται στο Σχήμα 2Β. Τα διαμεμβρανικά τμήματα (Μ1 και Μ2) είναι υπεύθυνα για τη διατήρηση της ενσωμάτωσης της πρωτεΐνης μέσα στο υδρόφοβο περιβάλλον της λιπιδικής μεμβράνης, ενώ η περιοχή Η5 θεωρείται ότι σχηματίζει μια δομή τύπου χωνιού ή «ανεστραμμένου tepee» [11] και μεσολαβεί στη διέλευση του Ιόντα K + επιλεκτικά. Τα κανάλια K με ανορθωτή προς τα μέσα υπόκεινται σε αποκλεισμό από το εσωτερικό από ιόντα μαγνησίου (Mg ++) και από ενώσεις πολυαμίνης, όπως η σπερμίνη και η σπερμιδίνη, που κάνει το κανάλι να λειτουργεί σαν μονόδρομος, αφήνοντας ιόντα K + να εισέλθουν στο κύτταρο υπάρχουν ελεύθερα αλλά περιοριστικά (βλέπε συζήτηση για την Επανόρθωση).

Διαδοχικά κανάλια K Domain Pore. Η πιο πρόσφατη προσθήκη στις οικογένειες των καναλιών K ήταν ένα γκρουπ του οποίου η ύπαρξη έχει αναδειχθεί μόλις τα τελευταία 3 χρόνια. Το πρωτότυπο κανάλι Κ αυτού του τύπου βρέθηκε πρώτα στην κοινή μαγιά αρτοποιίας (TOK1) και αναγνωρίστηκε αμέσως ως μοναδικό επειδή περιείχε δύο αλληλουχίες πόρων ή Η5 σε σειρά στην κύρια αλληλουχία αμινοξέων του. [12]Ένα μοντέλο του τρόπου με τον οποίο τα κανάλια Κ διαδοχικών πόρων ευθυγραμμίζονται σε σχέση με τη μεμβράνη πλάσματος φαίνεται στα δεξιά του Σχήματος 2Α. Από τότε που περιγράφηκε για πρώτη φορά το TOK1, τέσσερα θηλαστικά (TWIK-1, TREK-1, TASK και TRAAK) και ένα κανάλι Drosophila (ORK1) διαδοχικών πόρων Κ έχουν απομονωθεί. [13-18] Φαίνεται ότι αυτά τα κανάλια είναι υπεύθυνα για τα ρεύματα βάσης ή διαρροής και ότι μπορεί να είναι τα πιο πολυάριθμα από όλα τα κανάλια Κ.

Πόσα διαφορετικά κανάλια Κ είναι πιθανό να εκφραστούν στο ανθρώπινο σώμα; Ο Πίνακας 1 παραθέτει τα κανάλια Κ που έχουν κλωνοποιηθεί μέχρι σήμερα και τα ομαδοποιεί στις δομικές οικογένειες που παρουσιάστηκαν προηγουμένως. Μια εκτίμηση για το πόσα ακόμη κανάλια υπάρχουν προκύπτει από έργα αφιερωμένα στην αλληλουχία ολόκληρου του γονιδιώματος απλούστερων οργανισμών. Οι πλήρεις πληροφορίες αλληλουχίας είναι πλέον γνωστές για πολλούς ιούς, για αρκετά βακτήρια, συμπεριλαμβανομένων των Escherichia coli, Hemophilus influenzae και Helicobacter pylori και για το μονοκύτταρο ευκαρυωτικό Saccharomyces cerevisiae (ζύμη). Για τους «ανώτερους» οργανισμούς, περισσότερο από το 50% της αλληλουχίας είναι γνωστό για το νηματώδες Caenorhabditis elegans και ένα μικρό ποσοστό του γονιδιώματος για οργανισμούς με πιο πολύπλοκο κεντρικό νευρικό σύστημα όπως ο ποντικός και ο άνθρωπος. Ο C. elegans θα είναι ο πρώτος πολυκύτταρος οργανισμός του οποίου η αλληλουχία έχει καθοριστεί πλήρως. [19] Μέχρι στιγμής, περισσότερα από 45 κανάλια Κ, που αντιπροσωπεύουν και τις τέσσερις κύριες οικογένειες καναλιών Κ, έχουν εντοπιστεί στο γονιδίωμα του C. elegans. [20] Αυτός ο αριθμός ακολουθιών καναλιού Κ είναι φαινομενικά δυσανάλογος καθώς το νευρικό σύστημα C. elegans είναι τόσο απλό (συνολικά 308 νευρώνες). Η ομάδα τομέων διαδοχικών πόρων είναι η μεγαλύτερη, με περισσότερα από τα μισά κανάλια Κ να είναι αυτού του τύπου. Επειδή υπάρχουν πολλά γονίδια νηματωδών που έχουν άμεσους ομόλογους σε ανώτερους οργανισμούς, [21-23] υπάρχουν προσδοκίες ότι η πλήρης πανοπλία των καναλιών C. elegans Κ, αν όχι περισσότερο, θα εκπροσωπείται επίσης σε πιο πολύπλοκα νευρικά συστήματα. Για να κατανοήσουμε τους ρόλους τους στη λειτουργία των διεγερτικών ιστών, θα εξετάσουμε στη συνέχεια τη βασική ηλεκτροφυσιολογική συμπεριφορά τους.


ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Προηγούμενες μελέτες το έδειξαν ΕγώΚ1 κανάλια στις καρδιές του ποντικιού σχηματίζονται από ετερομερή συναρμολόγηση του Κir2.1 και Κir2.2 υπομονάδες (Zaritsky et αϊΤο 2001). Δεδομένου ότι αυτές οι μελέτες σε ποντίκια περιπλέκονταν από πιθανές αντισταθμιστικές προσαρμογές που συμβαίνουν μετά από γονιδιακή κατάλυση, προσπαθήσαμε να διερευνήσουμε τη μοριακή βάση της κοιλιακής ΕγώΚ1 χρησιμοποιώντας υπερ-έκφραση του κυρίαρχου-αρνητικού Κ που προκαλείται από ιούςir2 υπομονάδες. Τα αποτελέσματα Western blotting μας έδειξαν ότι το Κir2.1 και Κir2.2, αλλά όχι ο Κir2.3, εκφράζονται σε κοιλιακά μυοκύτταρα κουνελιού, σύμφωνα με προηγούμενες μετρήσεις mRNA σε ποντίκι (Kurachi & Takahashi, 1996) και αρουραίους (Nagashima et αϊΤο 2001). Αυτά τα συμπεράσματα είναι επίσης παρόμοια με εκείνα που βασίζονται σε αποτελέσματα σε μυοκύτταρα ινδικού χοιριδίου χρησιμοποιώντας ενιαία ΕγώΚ1 κατανομές πλάτους (Liu et αϊΤο 2001) και στο ανθρώπινο μυοκάρδιο (Wang et αϊΤο 1998) δείχνοντας ότι ο Κir2.1 και Κir2.2 είναι οι κύριοι καθοριστικοί παράγοντες της καρδιακής ΕγώΚ1, με πολύ λίγες, αλλά μετρήσιμες, συνεισφορές από τον Κir2.3 κανάλια.

Επιμόλυνση κοιλιακών μυοκυττάρων κουνελιού με Κir2.1dn, Κir2.2dn ή Κir2.1dn+ Κir2.2dn μειωμένος ΕγώΚ1 επίπεδα κατά την ίδια ποσότητα μετά από 72 ώρες καλλιέργειας, ενώ ο Κir2.3dn η υπερ-έκφραση δεν είχε κανένα αποτέλεσμα. Μείωση του ρεύματος στο ίδιο επίπεδο δεν θα ήταν αναμενόμενη εάν σημαντικές αναλογίες ΕγώΚ1 κανάλια που περιείχαν το Κir2.1 ή Κir2.2 υπομονάδες είτε ως ομοτετραμερή είτε (ενδεχομένως) ετεροτετραμερή με άλλα άγνωστα Κirα-υπομονάδες. Η ετεροτετραμερική συναρμολόγηση είναι επίσης σύμφωνη με την παρατήρησή μας ότι ο αποκλεισμός ΕγώΚ1 με Βα 2+ περιγράφηκε με μία και όχι διπλή δεσμευτική ισοθερμική εξίσωση από το IC50 για το Ba 2+ διαφέρει κατά 5 έως 10 φορές μεταξύ του Κir2.1 και Κir2.2 ομομερή (Liu et αϊΤο 2001 Preisig-Muller et αϊΤο 2002). Παρόμοιο ετεροτετραμερές συγκρότημα του Κv4.2 και Κv4.3 εμφανίζεται στο σχηματισμό της καρδιάς του ποντικού Εγώπρος το (Γκουό et αϊΤο 2002). Επιπλέον, ο Κir2.2 η έκφραση παρέμεινε αμετάβλητη κατά τη διάρκεια της καλλιέργειας κοιλιακών μυοκυττάρων κουνελιού παρά τις μεγάλες μειώσεις ΕγώΚ1 και Κir2.1 έκφραση. Δεδομένου ότι τα αποτελέσματα στυπώματος Western δεν μπορούν να κάνουν διάκριση μεταξύ του Kir2 υπομονάδες στις σαρκολαμμικές και μη σαρκοκομματικές μεμβράνες, φαίνεται ότι ο Κir2.1 βοηθά στη μετατόπιση των ετεροτετραμερών ΕγώΚ1 κανάλια στην επιφανειακή μεμβράνη όπως προτείνεται προηγουμένως από διαγονιδιακές μελέτες σε ποντίκια (Zaritsky et αϊΤο 2001). Σύμφωνα με αυτή την πρόταση, ο Κir2.2 τα ρεύματα που εκφράζονται σε ωοκύτταρα και κύτταρα tsA201 είναι συνήθως 10 φορές λιγότερα από το Κir2.1 ρεύματα, παρά τα ισομοριακά επίπεδα RNA ή DNA (H. C. Cho & P. ​​H. Backx, αδημοσίευτα δεδομένα) τα οποία θα μπορούσαν να σχετίζονται με την παρατήρηση ότι η μεταφορά του άπω C-τερματικού από το Kir2.2 στο Κir2.1 μειωμένη έκφραση επιφάνειας (Ma et αϊ. 2001 ).

Είναι αξιοσημείωτο ότι οι βιοφυσικές ιδιότητες του ΕγώΚ1, συμπεριλαμβανομένου του αποκλεισμού από το Ba 2+ (δηλαδή το IC50 και ο συντελεστής Hill), δεν μεταβλήθηκε πότε ΕγώΚ1 μειώθηκε μετά την καλλιέργεια ή ως απόκριση στη διαμόλυνση με Κir2.1dn και/ή Κir2.2dnΤο Αυτή η παρατήρηση είναι παρόμοια με την απουσία αλλαγών σε ένα κανάλι ΕγώΚ1 αγωγιμότητα ή ανοιχτή πιθανότητα που αναφέρθηκε προηγουμένως κατά τη διάρκεια καλλιέργειας μυοκυττάρων κουνελιού ( Veldkamp et αϊΤο 1999). Ενώ αυτά τα ευρήματα υποστηρίζουν υπέρ μιας σταθερής στοιχειομετρίας του ΕγώΚ1 κανάλια στην κοιλία του κουνελιού, η σχέση μεταξύ της στοιχειομετρίας καναλιών και των βιοφυσικών ιδιοτήτων του ΕγώΚ1 τα κανάλια είναι πιθανότατα πολύπλοκα και απαιτούνται περαιτέρω μελέτες για να προσδιοριστεί η ακριβής στοιχειομετρία του καρδιακού κουνελιού ΕγώΚ1.

Ο βαθμός μείωσης του ΕγώΚ1 η πυκνότητα στα μυοκύτταρα κουνελιού ήταν η ίδια μετά από 48 ή 72 ώρες συν-επιμόλυνσης με AdKir2.1dn και AdKir2.2dnΤο Επιπλέον, διπλασιάζοντας το επίπεδο του AdKir2.1dn και AdKir2.2dn δεν ήταν επίσης σε θέση να προκαλέσει περαιτέρω ΕγώΚ1 μειώσεις (C. Zobel, H. C. Cho & P. ​​H. Backx, ανέκδοτα δεδομένα). Αυτές οι παρατηρήσεις υποδηλώνουν ότι η μέγιστη μείωση του ΕγώΚ1 στις πειραματικές μας συνθήκες είναι περίπου 70 %. Η μοριακή σύνθεση των υπολοίπων ΕγώΚ1 είναι ασαφές. Ως αποτέλεσμα των πεπερασμένων ποσοστών κύκλου εργασιών των ενδογενών ΕγώΚ1 κανάλια, το υπόλοιπο ρεύμα ενδέχεται να δημιουργηθεί ακόμη από τον Κir2.1 και Κir2.2 υπομονάδες, αν και, εκ πρώτης όψεως, αυτή η πρόταση δεν συνάδει με την παρατήρηση ότι ο βαθμός μείωσης του ρεύματος ήταν ισοδύναμος στις 48 και 72 ώρες μετά την επιμόλυνση με AdKir2.1dn και AdKir2.2dnΤο Ωστόσο, μπορεί να γίνει κατανοητό ότι μια δυναμική ισορροπία μεταξύ της παραγωγής νέου καναλιού και της έκφρασης διαγονιδίου DN επιτυγχάνεται μεταξύ 48 και 72 ωρών, ιδιαίτερα εάν το επίπεδο της έκφρασης διαγονιδίου DN μειωθεί μετά από 48 ώρες σε καλλιέργεια, όπως έχει αποδειχθεί προηγουμένως ( Parks et αϊΤο 1999 Seharaseyon et αϊΤο 2000). Η αδυναμία μας να εξαλείψουμε πλήρως ΕγώΚ1 στα μυοκύτταρα χρησιμοποιώντας Κir2.1dn και Κir2.2dn θα μπορούσε επίσης να προκύψει από την ατελή καταστολή του ΕγώΚ1, παρά τις προηγούμενες μελέτες μας που έδειξαν μια ισχυρή κυρίαρχη-αρνητική δράση του Κir2.1dn σε ωοκύτταρα ( Cho et αϊΤο 2000). Συνεπής με αυτή τη δυνατότητα, ο Κir2.1dn και Κir2.2dn ήταν πολύ λιγότερο αποτελεσματικοί αναστολείς του άγριου τύπου Κir2.X ρεύματα σε κύτταρα tsA201 παρά σε ωοκύτταρα (αδημοσίευτες παρατηρήσεις συγγραφέων). Ως εκ τούτου, είναι πιθανό ότι άλλα κυρίαρχα-αρνητικά μεταλλαγμένα κανάλια του Κir2.1 και Κir2.2 (GYG έως AAA) μπορεί να εξαλείψει αποτελεσματικότερα το καρδιακό κουνέλι ΕγώΚ1 υπό τις πειραματικές μας συνθήκες και αυτό αξίζει περαιτέρω διερεύνηση. Εναλλακτικά, ΕγώΚ1 παραμένει μετά τη μόλυνση με το AdKir2.1dn ή/και AdKir2.2dn ενδέχεται να προέρχονται εν μέρει (ή αποκλειστικά) από κανάλια που στερούνται Kir2.1 ή Κir2.2 πρωτεΐνη καναλιού. Με βάση προηγούμενες δημοσιεύσεις (Liu et αϊΤο 2001 Preisig-Muller et αϊΤο 2002), ένας πιθανός υποψήφιος για αυτό το εναπομείναν ρεύμα θα ήταν ο Κir2.3 είτε μόνο του είτε σε συνδυασμό με άλλα μέλη του Κir οικογένεια. Αυτή η πιθανότητα φαίνεται απίθανη αφού στις μελέτες μας η διαμόλυνση με το AdKir2.3dn δεν προκάλεσε μειώσεις σε ΕγώΚ1 και τα Western blots δεν αποκάλυψαν στοιχεία του Κir2.3 έκφραση. Επιπλέον, διαμόλυνση με το AdKir2.1dn και/ή AdKir2.2dn δεν επηρέασε τις βιοφυσικές ιδιότητες ρεύματος -τάσης ή τον αποκλεισμό από το Ba 2+ ΕγώΚ1 στα καλλιεργημένα μυοκύτταρα κουνελιού, γεγονός που (όπως αναφέρθηκε ήδη) υποδηλώνει ότι η μοριακή σύνθεση του ΕγώΚ1 δεν άλλαξε ως απάντηση στις μειώσεις ΕγώΚ1 σε αυτά τα πειράματα.

Προηγουμένως είχε προταθεί ότι η μείωση του ΕγώΚ1 η ακόλουθη καλλιέργεια σχετίζεται με τις αντίστοιχες μειώσεις της πυκνότητας των σωληναρίων t που προκαλούνται από συνθήκες καλλιέργειας (Christe, 1999). Αυτός ο ισχυρισμός είναι συνεπής με τον παρατηρούμενο εντοπισμό του Κir2.1 (Κλαρκ et αϊΤο 2001) και Κir2.2 (Λεονουδάκης et αϊΤο 2001 ) στους t-tubules. Ωστόσο, αυτός ο μηχανισμός για μειωμένο ΕγώΚ1 στον πολιτισμό θα προέβλεπε παράλληλες μειώσεις στα επίπεδα έκφρασης του Κir2.1 και Κir2.2, κάτι που δεν παρατηρήθηκε στις μελέτες μας. Σαφώς, ο εντοπισμός των μηχανισμών που ευθύνονται για τη μείωση του ΕγώΚ1 μετά την καλλιέργεια μυοκυττάρων απαιτείται περαιτέρω διερεύνηση.

Συμπερασματικά, τα αποτελέσματά μας καταδεικνύουν ότι και οι δύο Κir2.1 και Κir2.2 εκφράζονται λειτουργικά σε κοιλιακά μυοκύτταρα κουνελιού και ο κυρίαρχος μοριακός συσχετισμός των μακροσκοπικών ΕγώΚ1 φαίνεται να είναι ετερομερή κανάλια συναρμολογημένα και από το Kir2.1 και Κir2.2 υπομονάδες.


Τα ρεύματα καλίου με χαμηλό δυναμικό ηρεμίας μεμβράνης και ανορθωτή προς τα μέσα δεν είναι εγγενή χαρακτηριστικά των καρδιομυοκυττάρων που προέρχονται από hiPSC

Τα καρδιομυοκύτταρα που προκαλούνται από ανθρώπινα πολυδύναμα βλαστοκύτταρα (hiPSC) εμφανίζουν λιγότερο αρνητικό δυναμικό μεμβράνης ηρεμίας (RMP), το οποίο αποδίδεται σε μικρά εσωτερικά ρεύματα ανορθωτή (ΙΚ1). Εδώ εγώΚ1 μετρήθηκε σε hiPSC-CMs (ιδιόκτητη και εμπορική κυτταρική σειρά) καλλιεργημένη ως μονοστρωματική (ML) ή τρισδιάστατη μηχανική καρδιακού ιστού (EHT) και, για άμεση σύγκριση, σε CMs από ανθρώπινο δεξιό κόλπο (RA) και αριστερό κοιλιακό ιστό (LV). Το RMP μετρήθηκε σε απομονωμένα κύτταρα και άθικτους ιστούς. ΕγώΚ1 Η πυκνότητα στα ML- και EHT-CM από την αποκλειστική σειρά ήταν παρόμοια με τα LV και RA, αντίστοιχα. ΕγώΚ1 η πυκνότητα στα EHT-CM από την εμπορική γραμμή ήταν 2 φορές μικρότερη από ό, τι στην ιδιόκτητη γραμμή. Το RMP στο EHT και των δύο γραμμών ήταν παρόμοιο με το RA και το LV. Κλάσμα επαναπόλωσης και ΙΚ, ACh η απόκριση διακρίθηκε καλύτερα μεταξύ RA και LV και έδειξε κυρίως κοιλιακό φαινότυπο σε hiPSC-CMs/EHT. Τα δεδομένα υποδεικνύουν ότι ΙΚ1 δεν είναι απαραιτήτως χαμηλά σε hiPSC-CM και τεχνικά ζητήματα ενδέχεται να αποτελούν το χαμηλό RMP στα hiPSC-CM.

Λέξεις-κλειδιά: Ι (Κ, ACh) Ι (Κ1) δυναμική δράση διάρκειας μηχανικός καρδιακός ιστός ανθρώπινος κόλπος που προκάλεσε πολυδύναμο καρδιομυοκύτταρα προερχόμενα από βλαστοκύτταρα ανθρώπινη κοιλία εσωτερικός ανορθωτής Κ (+) τρέχον κλάσμα επαναπόλωσης δυναμικό μεμβράνης ανάπαυσης.

Πνευματικά δικαιώματα © 2018 Οι Συγγραφείς. Δημοσιεύτηκε από την Elsevier Inc. Με επιφύλαξη παντός δικαιώματος.


Αυτή η μελέτη χρηματοδοτήθηκε από το Υπουργείο Γεωργίας και την Αγροτική Έρευνα των Ηνωμένων Πολιτειών (USDA-ARS) με τον αριθμό έργου: 3094-32000-042-00D.

Οποιαδήποτε αναφορά σε εμπορικές ονομασίες ή εμπορικά προϊόντα σε αυτή τη δημοσίευση έχει αποκλειστικά σκοπό την παροχή συγκεκριμένων πληροφοριών και δεν υποδηλώνει σύσταση ή έγκριση από το Υπουργείο Γεωργίας των Η.Π.Α. Το USDA είναι πάροχος ίσων ευκαιριών και εργοδότης.

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι η έρευνα διεξήχθη απουσία εμπορικών ή οικονομικών σχέσεων που θα μπορούσαν να ερμηνευθούν ως πιθανή σύγκρουση συμφερόντων.


ΣΥΖΗΤΗΣΗ

Σε αυτή τη μελέτη διερευνήσαμε τη διακίνηση, τον εντοπισμό κυττάρων και τις αλληλεπιδράσεις υπομονάδων ενός πρόσφατα αναγνωρισμένου ανθρώπινου εσωτερικού ανορθωτή καναλιού καλίου Kir2.6. Αυτή η υπομονάδα ανακαλύφθηκε ως γονίδιο που όταν μεταλλάσσεται προκαλεί ευαισθησία στο TPP, μια κατάσταση που χαρακτηρίζεται από μυϊκή αδυναμία ή παράλυση που συνοδεύεται από υποκαλιαιμία και θυρεοτοξίκωση (22). Εδώ χαρακτηρίζουμε τον άγριο τύπο Kir2.6 για να κατανοήσουμε πώς το τυπικό εγγενές Kir2.6 συμβάλλει στη βιολογία των μυϊκών κυττάρων. Παραδόξως, διαπιστώνουμε ότι παρά την υψηλή ακολουθία ομοιότητάς του με άλλες υπομονάδες Kir2.x (㺘% ταυτότητα με Kir2.2), το Kir2.6 διακινείται πολύ άσχημα στην επιφανειακή μεμβράνη και αντίθετα κατοικεί κυρίως στο ενδοπλασματικό δίκτυο. Τα ρεύματα ολόκληρων κυψελών του Kir2.6 από μόνα τους είναι πολύ μικρά σε σχέση με άλλες υπομονάδες ανορθωτή προς τα μέσα λόγω της χαμηλής επιφανειακής του έκφρασης. Ωστόσο, τα κανάλια ανορθωτή προς τα μέσα αποτελούνται από ένα ετεροτετραμερές σύνολο υπομονάδων και δείχνουμε ότι το Kir2.6 συναρμολογείται εύκολα με άλλες υπομονάδες Kir2.x. Λόγω του κυρίαρχου φαινοτύπου διακίνησης, το Kir2.6 ασκεί σημαντικό ρυθμιστικό έλεγχο στη διακίνηση καναλιών διόρθωσης προς τα μέσα μέσω της κυρίαρχης αρνητικής διατήρησης στο ER. Σύμφωνα με τις γνώσεις μας, αυτή είναι η πρώτη επίδειξη ρύθμισης της διακίνησης ισχυρών εσωτερικών διορθωτών καναλιών καλίου Kir2 με κυρίαρχη αρνητική αλληλεπίδραση με υπομονάδες άγριου τύπου.

Ο εντοπισμός των καναλιών καλίου στους σκελετικούς μύες είναι σημαντικός για τη λειτουργία τους Τα κανάλια Kir2 παίζουν σημαντικό ρόλο στη ρύθμιση του δυναμικού ηρεμίας των κυττάρων, στον έλεγχο της διεγερσιμότητας των μυϊκών κυττάρων, προσδιορίζοντας την έκταση της αδρανοποίησης των διαύλων νατρίου και στην εκκαθάριση της εξαρτώμενης από τη δραστηριότητα συσσώρευσης K + από Τ-σωληνίσκοι. Έχουμε δείξει με ανοσοκυτταροχημεία ότι τα κανάλια Kir2.1 και Kir2.2 του κύριου σκελετικού μυός είναι καλά τοποθετημένα για αυτές τις λειτουργίες, με τα κανάλια Kir2.1 να βρίσκονται στην πλασματική μεμβράνη και στις περιφερειακές περιοχές των σωληναρίων Τ και το Kir2.2 να βρίσκεται σε κεντρικές περιοχές των Τ-σωληναρίων και της νευρομυϊκής σύνδεσης (Εικ. 6). Αυτά τα αποτελέσματα συμφωνούν καλά με τον προτεινόμενο εντοπισμό καναλιών ανόρθωσης προς τα μέσα που βασίζονται σε ηλεκτροφυσιολογικές μελέτες σε σκελετικό μυ βατράχου (8, 12,�) και σε μελέτες βιοχημικής κλασμάτωσης μεμβράνης σε σκελετικό μυ αρουραίου (1). Πράγματι, μια συναρπαστική περίπτωση για τον εντοπισμό του καναλιού Kir σε σωληνάρια Τ και πλάσμα μεμβράνης έγινε από τον Wallinga et αϊ. (15), ο οποίος έδειξε με τη μοντελοποίηση ότι η διατήρηση της διέγερσης των σκελετικών μυών και η σύζευξη διέγερσης-συστολής κατά τη διάρκεια πυρκαγιάς επαναλαμβανόμενης δράσης απαιτεί την παρουσία καναλιών Kir σε αυτές τις θέσεις για την απομάκρυνση του K + και την πρόληψη θετικών μετατοπίσεων στο δυναμικό της μεμβράνης ηρεμίας. Τα αποτελέσματά μας συμφωνούν επίσης με μελέτες στον καρδιακό μυ στις οποίες έχει αποδειχθεί ο εντοπισμός των σωληνίσκων Τ και της πλασματικής μεμβράνης και ο ρόλος τους στη συσσώρευση K + (5, 6, 10, 11).

Although Kir2.2 and Kir2.6 share more than 98% identity and are thought to have arisen from gene duplication (22) with several diversifications acquired throughout evolution, their trafficking and localization are widely different. Exogenous expression of Kir2.6 in both COS-1 cells and mouse skeletal muscle showed colocalization with the ER marker PDI, indicating that Kir2.6 is retained in the ER and trafficked poorly to the plasma membrane ( Figs. 1 , ​ ,7, 7 , and ​ and9). 9 ). In contrast Kir2.1 and Kir2.2 trafficked out of the ER through the Golgi, shown by colocalization with Golgi markers, and finally expressed on T-tubules and the plasma membrane ( Figs. 1 , ​ ,7, 7 , and ​ and10 10 and supplemental Fig. S2).

Even though Kir2.6 primarily is retained in the ER, a small proportion of the channel is trafficked to the cell surface in COS-1 cells. We speculated that this surface Kir2.6 formed functional homotetrameric channels. Indeed, electrophysiological investigation confirmed that Kir2.6 can form functional channels on the plasma membrane, in agreement with findings from Ryan et αϊ. (22). Kir2.6 currents display characteristic inward rectification, with more pronounced inward currents at potentials negative to μικ than at potentials positive to μικΤο However, when compared with Kir2.2, whole cell currents reveal a marked reduction in magnitude, implying that fewer channels are present on the plasma membrane.

It is possible that high expression levels and longer expression times in some cultured cells may allow Kir2.6 channels to escape cellular trafficking and quality control mechanisms and may account for larger Kir2.6 current magnitudes observed by Ryan et αϊ. (22) in 293T cells. In mouse skeletal muscle, however, even after 7� days of expression in vivo, we found no evidence for Kir2.6 trafficking beyond the ER when Kir2.6 was expressed alone, suggesting that it is effectively retained in the ER ( Fig. 7 ). When expressed with Kir2.1 in mouse skeletal muscle, a very low level of Kir2.6 trafficked to the Golgi ( Fig. 9 ). In primate skeletal muscle, it is possible that a tissue-specific and species-specific accessory subunit or chaperone may aid the forward trafficking of Kir2.6 thus, a greater fraction of Kir2.6 might traffic to surface membranes in human skeletal muscle.

Although the Kir2.6 sequence includes all known anterograde trafficking signals that are present in other Kir2.x channels, it is still retained in the ER ( Figs. 1 , ​ ,5, 5 , ​ ,7, 7 , ​ ,9, 9 , and ​ and10). 10 ). Our studies show that a previously unidentified site, proline 156, is the most essential amino acid for surface trafficking of Kir2.2, and notably, the leucine at position 156 of Kir2.6 caused its retention in the ER ( Figs. 3 and ​ and8). 8 ). Alignment of all known human Kir family sequences to identify conserved amino acids shows that the amino acid pair cysteine 155 and proline 156 is conserved among nearly all eukaryotic Kir subunits, but a leucine is present in place of the proline in Kir2.6 ( Fig. 11 ΕΝΑ). Prolines have an established role in α-helical turn structure and are commonly found as the first residue of an α-helix (48). Indeed, in the three-dimensional structure of Kir2.2 (Protein Data Bank file 3JYC ), proline 156 is located at a turn that forms the beginning of the M2 inner helix ( Fig. 11 σι) (49). Significantly, the adjacent cysteine 155 is part of an intrasubunit disulfide with conserved cysteine 123 that is essential for channel function and that bridges the two extracellular loops in eukaryotic Kir2 channels (49,�). It has been shown that mutation of either of these conserved cysteines of Kir2.1 in one subunit of a channel tetramer is sufficient to eliminate wild type Kir2.1 currents in a dominant negative manner (50). We assume that proline 156 in Kir2.2 induces bending that initiates the M2 helix. Leucine at this position in Kir2.6 likely impacts channel conformation and may alter folding efficiency or disulfide bond formation that could result in retention of Kir2.6 in the ER.

Alignment of Kir2 family reveals a conserved proline located between the P-loop and the M2 helix. ΕΝΑ, multisequence alignment of human Kir family members was performed with Clustal W (1.81) with Kir sequences from IUPHAR. Leucine 156 in Kir2.6 is instead a conserved proline that initiates the M2 transmembrane helix in nearly all other Kir channels (site is shown in bold text). σι, two subunits of chicken Kir2.2 (Protein Data Bank code 3JYC ) are shown, with conserved proline 156 and an adjacent disulfide bond between cysteine 155 and cysteine 123 (49).

Interestingly, the absence of a conserved proline has been implicated in a loss of function of two voltage-gated potassium channel subunits. Kv6.3 and Kv8.1 are electrically silent homotetrameric channels because of retention in the ER, a phenomenon likely resulting from divergence of a proline-containing motif. Study of chimeric subunits between Kv6.3 and Kv2.1 and point mutation analysis in Kv8.1 revealed that a PΧP motif, located in the S6 transmembrane domain in the gating hinge, is altered to PΧT or PΧA in the silent channels, respectively (53, 54) (Protein Data Bank file 2A79 ).

We have shown that Kir2.6 associates with Kir2.1 and Kir2.2 by immunoprecipitation ( Fig. 4 ), with important consequences on channel trafficking, plasma membrane abundance, and localization ( Figs. 3 , ​ ,5, 5 , ​ ,9, 9 , and ​ and10). 10 ). Kir2 channels are known to form by homotetrameric and heterotetrameric assembly of Kir2.x subunits, with the resulting channels reflecting the physiological properties of their subunits (3). However, the subunit composition, the extent of heteromultimerization, and the roles of individual subunits in different cell types are not known. Gene knock-out studies in mice showed that Kir2.1 and Kir2.2 contribute to K + currents in heart in a nonadditive manner, suggesting that these subunits can coassemble in vivo (21). In cardiac myocytes, the diversity of channel conductances, Ba 2+ block properties, and pH sensitivity also support a model in which channels are composed of homotetrameric and heterotetrameric subunits (33,�). Our data showing the overlapping distribution of endogenous Kir2.1 and Kir2.2 channels in skeletal muscle T-tubules are consistent with the idea that a fraction of these subunits coassemble in vivo in skeletal muscle ( Fig. 6 ).

Our trafficking studies, in which Kir2.6 causes ER retention of other Kir2.x subunits and colocalization of subunits, provide strong support for heteromultimeric formation of Kir2 channels in skeletal muscle, cardiac muscle cells, and COS-1 cells ( Figs. 3 , ​ ,5, 5 , ​ ,9, 9 , and ​ and10). 10 ). Kir2.6 is the dominant subunit when it forms a heteromultimer with Kir2.1 or Kir2.2 in vivo and has a stronger dominant negative trafficking effect on Kir2.2 compared with Kir2.1, suggesting that those subunits that are most similar in sequence may have a greater propensity to coassemble. A dominant negative trafficking phenomenon also is a well known explanation for disease-associated mutations in Andersen-Tawil syndrome where Kir2.1 𹒕� and Kir2.1 �� do not traffic to the plasma membrane. Instead, they are distributed inside the cell, although they retain their ability to coassemble with wild type channels (18). Bendahhou et αϊ. (18) speculate that deletion of amino acids 95�, located in the outer M1 helix, results in protein misfolding and consequent ER retention. Coexpression of wild type Kir2.1 with Kir2.1 𹒕� or Kir2.1 �� trapped the wild type subunit at intracellular sites. Reduction in Kir2.1 expression on the plasma membrane can interfere with regulation of electrical excitability and muscle resting potential (18).

It is interesting to note that another gene encoding Kir2.5/Kir2.2v, also closely related to Kir2.2, may act as a negative regulator of Kir2.2 channel activity as well, but in that case the Kir2.5 subunit is electrically silent possibly because of alterations of the conserved GYG selectivity filter or C terminus (55).

Although our studies do not address the function of Kir2.6 mutations that are associated with TPP, we speculate that some of those mutations may alter channel trafficking, leading to changes in the magnitude of Kir2 currents on surface membrane and T-tubules. Two of the TPP-associated mutations, Kir2.6 R399X and Kir2.6 Q407X, cause truncation of the Kir2.6 C terminus and result in the absence of a putative PDZ-binding motif (22), a region known to be important for subcellular localization of Kir2 channels (7, 10, 11, 28, 30, 31).

The Kir2.6 gene contains a thyroid-responsive element that may regulate gene transcription (22) and consequently lead to changes in its protein abundance, ER retention of Kir2.x subunits, and reduction in inward rectifier currents. Thus, thyrotoxicity may alter a delicate balance of electrical activity in muscle. Modeling studies and human disease-associated mutations in the genes encoding Kir2.1 and Kir2.6 suggest that too little or too much inward rectifier current can alter the electrical excitability of muscle and lead to paralysis (15, 17, 22, 56). Because TPP patients normalize when treated with antithyroid agents (reviewed in Ref. 57), the consequences of high T3 on muscle conductance is of interest.

In summary, we suggest that Kir2.6 is a regulatory subunit that is mainly retained in the ER as a consequence of leucine 156. Association between Kir2.6 and Kir2.1 or Kir2.2 promotes ER retention of the heterotetramer. The amount of inward rectifier channels on the plasma membrane may depend on the ratio between the Kir2.1, Kir2.2, and Kir2.6 subunits. We speculate that homeostasis is maintained in healthy individuals, enabling a stable amount of cell surface channel expression. Together, our data support the concept that ER retention is an important mechanism in controlling skeletal muscle excitability.


Δες το βίντεο: Einhell BT BC 10 E Blue vs Einhell BT BC 12 TK1382 (Οκτώβριος 2022).