Πληροφορίες

Στα στυπώματα γουέστερν, πρέπει τα στοιχεία ελέγχου φόρτωσης να είναι πρωτεΐνες που είναι σε ίσες ποσότητες σε κάθε λωρίδα;

Στα στυπώματα γουέστερν, πρέπει τα στοιχεία ελέγχου φόρτωσης να είναι πρωτεΐνες που είναι σε ίσες ποσότητες σε κάθε λωρίδα;


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Έχω κάνει πρόσφατα ένα Western Blot και κάνω ανάλυση δεδομένων για τα στίγματα μου. Μελετώ την πρωτεΐνη GSK3, η οποία είναι μια φωσφοπρωτεΐνη.

Έχω επισημάνει τη μεμβράνη μου έναντι ενεργού GSK3 και ανενεργού GSK3. Έχω επισημάνει επίσης τη μεμβράνη έναντι του ολικού GSK3. Έχω χρησιμοποιήσει το Ponceau S ως χειριστήριο φόρτωσης. Από τη χρώση μου στο Ponceau S είδα ότι υπάρχουν διαφοροποιήσεις στις ποσότητες πρωτεΐνης που φορτώνονται ανά λωρίδα. Υπάρχουν λοιπόν διακυμάνσεις στα ποσά του συνολικού GSK3 ανά λωρίδα (οι εντάσεις των ζωνών δεν είναι όλες ίσες).

Αναρωτιέμαι αν οι εντάσεις ζώνης του συνολικού GSK3 δεν είναι συνεπείς μεταξύ των λωρίδων, σε αυτήν την περίπτωση η χρήση του συνολικού GSK3 θα ήταν ένας καλός έλεγχος φόρτωσης για την ομαλοποίηση των δεδομένων μου; Έχω διαβάσει για την περίπτωση των φωσφοπρωτεϊνών, μπορείτε να κανονικοποιήσετε την ολική πρωτεΐνη (χρησιμοποιώντας ένα αντίσωμα που αναγνωρίζει όλες τις μορφές της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει).

Έχω διαβάσει ότι οι έλεγχοι φόρτωσης είναι ενδογενείς πρωτεΐνες που δεν επηρεάζονται από πειραματικές συνθήκες και χρησιμοποιούνται ως δείκτης συγκέντρωσης δείγματος. Αλλά αν τα ποσά στο συνολικό GSK3 ποικίλλουν μεταξύ των λωρίδων, πώς μπορεί αυτό να είναι ένας καλός έλεγχος φόρτωσης; Ομοίως, γιατί πολλοί ερευνητές χρησιμοποιούν το Ponceau S ως στοιχείο ελέγχου φόρτωσης, εάν οι εντάσεις της ζώνης μεταξύ των λωρίδων ποικίλλουν (εάν δεν φορτώνετε ίσες ποσότητες δείγματος);

Με άλλα λόγια, για να είναι μια πρωτεΐνη έλεγχος φόρτωσης, πρέπει να είναι σε ίσες ποσότητες για όλα τα δείγματα/λωρίδες σας;

Οποιαδήποτε γνώση εκτιμάται.


Τα χειριστήρια δεν χρειάζεται να φορτώνονται σε ίσες ποσότητες ανά λέξη, αλλά πρέπει να εκφράζονται σχετικά ισότιμα ​​μεταξύ των λωρίδων. Χρειάζονται ίση έκφραση, έτσι ώστε οι έλεγχοι να μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την κανονικοποίηση των τιμών των πειραματικών πρωτεϊνών.

Είναι σύνηθες να χρησιμοποιούνται γονίδια καθαρισμού, όπως η βήτα ακτίνη, τα οποία συνήθως εκφράζονται εξίσου μεταξύ των θεραπειών για έλεγχο της φόρτωσης. Είναι σημαντικό να διασφαλιστεί ότι οι θεραπείες δεν επηρεάζουν αυτές τις πρωτεΐνες.

Για παραδείγματα και λόγους, βλ.

https://www.abcam.com/primary-antibodies/loading-control-guide

https://www.bio-rad-antibodies.com/western-blot-loading-controls-antibodies.html

https://www.labome.com/method/Loading-Controls-for-Western-Blots.html


Western Blot: Προετοιμασία δείγματος

Ο νέος μας οδηγός τσέπης περιέχει ένα σύνολο βημάτων που θα σας βοηθήσουν με τον πειραματικό σχεδιασμό σας.

Εγγραφείτε στα email μας

Μάθετε πρώτοι πότε λανσάρουμε νέα προϊόντα και πόρους για να σας βοηθήσουμε να πετύχετε περισσότερα στο εργαστήριο.


7 Συμβουλές για τη βελτιστοποίηση των πειραμάτων Western Blotting

Η κηλίδωση Western δεν είναι μια ακριβής επιστήμη: η επίτευξη τέλειων αποτελεσμάτων, έτοιμων για δημοσίευση αμέσως, δεν είναι ακριβώς ο κανόνας. Ωστόσο, υπάρχουν βήματα που μπορείτε να ακολουθήσετε για να βελτιώσετε τα πειράματά σας με στύπωμα και να διασφαλίσετε ότι θα ξεκινήσουν με τον καλύτερο δυνατό τρόπο. Αυτή η διαδικασία ρύθμισης είναι γνωστή ως βελτιστοποίηση και πολλά στάδια του πρωτοκόλλου κηλίδωσης Western μπορούν να υποβληθούν σε αυτήν.

1. SDS-PAGE

Τα πειράματα Western blotting ξεκινούν πολύ πριν αρχίσετε να εργάζεστε με τη μεμβράνη σας. Θα μπορούσαμε να πάμε πολύ πίσω ως προετοιμασία δείγματος, αλλά προς το συμφέρον του χώρου ας ξεκινήσουμε με το δείγμα διαχωρισμόςΤο Με αυτό, βγάζετε ό,τι βάζετε—χωρίς ένα καλό τζελ SDS-PAGE δεν θα έχετε καλή μεμβράνη και όλα θα ξετυλιχτούν από εκεί. Εάν ρίχνετε τα δικά σας τζελ, φροντίστε να εξασφαλίσετε ομοιομορφία στο μακιγιάζ τους. Επιλέξτε το σωστό ποσοστό ακρυλαμιδίου (ανατρέξτε στο πρωτόκολλο στυπώματος Western Proteintech [PDF]). Αποφύγετε αυτό το «χαμογελαστό» αποτέλεσμα της βαφής, αντιστεκόμενοι στον πειρασμό να τρέχετε τα τζελ σας σε υψηλές τάσεις και να γεμίζετε τα κενά φρεάτια με ισοδύναμο όγκο 1x buffer δείγματος.

Πάνω απ 'όλα, φορτώστε μια ομοιόμορφη ποσότητα πρωτεΐνης προσδιορίστε τη συγκέντρωση πρωτεΐνης με δοκιμασία και ετοιμαστείτε να μειώσετε την ποσότητα φόρτωσής σας εάν λάβετε "ραβδώσεις" λεκέδων. Το εργαστήριο επικύρωσης Proteintech διαπιστώνει ότι 30 μg πρωτεΐνης ανά λωρίδα συνήθως δίνει ζώνες χωρίς ραβδώσεις και καλά διαχωρισμένες ζώνες.

2. Μεμβράνη

Η επιλογή της μεμβράνης σας μπορεί να κάνει τεράστια διαφορά στο αποτέλεσμα των πειραμάτων σας με στυπώσεις Western. Οι δύο κύριοι τύποι μεμβρανών είναι το PVDF και η νιτροκυτταρίνη, αλλά υπάρχουν τώρα αρκετές εκδόσεις του καθενός στην αγορά αναλωσίμων, συμπεριλαμβανομένων, για παράδειγμα, μεμβρανών βελτιστοποιημένων για ανοσοανίχνευση με βάση τον φθορισμό ή πρωτεΐνες χαμηλού μοριακού βάρους.

Το PVDF εκτιμάται για τη σκληρότητα, τη σταθερότητα και την αντοχή του στα περισσότερα οξέα και αλκάλια (που σημαίνει ότι είναι η μεμβράνη της επιλογής για εσάς που επιθυμείτε να απογυμνώσετε και να επανεξετάσετε τα στίγματα σας). Οι μεμβράνες PVDF προσφέρουν επίσης καλύτερη κατακράτηση πρωτεΐνης από τη νιτροκυτταρίνη.

Οι μεμβράνες νιτροκυτταρίνης μπλοκάρονται εύκολα και γενικά παρέχουν υψηλές αναλογίες σήματος προς θόρυβο. Ωστόσο, δεν θα μπορείτε να τα απογυμνώσετε και να τα ξαναεξετάσετε, και επίσης να δώσετε προσοχή στο μέγεθος πόρων της μεμβράνης νιτροκυτταρίνης.

Τέλος, μια λέξη για την εργαστηριακή παράδοση: Μη φοβάστε να αλλάξετε τύπους μεμβράνης λόγω των εργαστηριακών κανόνων. Το να δοκιμάσετε κάτι διαφορετικό μπορεί να είναι το κλειδί για το βέλτιστο Western blot.

3. Συγκέντρωση αντισωμάτων

Υποθέτοντας ότι έχετε καταβάλει την απαιτούμενη προσπάθεια για την επιλογή του αντισώματός σας, το επόμενο βήμα θα πρέπει να είναι ο προσδιορισμός της βέλτιστης συγκέντρωσης αντισώματος που λειτουργεί.

Ο ρυθμός δέσμευσης μεταξύ αντισώματος και αντιγόνου (η σταθερά συγγένειας) επηρεάζεται από τις σχετικές συγκεντρώσεις τους στο διάλυμα (μεταξύ άλλων μεταβλητών, όπως η θερμοκρασία και το pH). Οι ποσότητες αντιγόνου συνήθως καθορίζονται στο Western blotting (δηλαδή η πρωτεΐνη σας στερεώνεται στη μεμβράνη), επομένως θα πρέπει συχνά να τροποποιείτε τη συγκέντρωση αντισωμάτων για να αποκτήσετε καλύτερα στυπώματα. Κάνοντας αυτό με οργανωμένο τρόπο - δοκιμάζοντας αρκετές αραιώσεις αντισωμάτων διατηρώντας σταθερές όλες τις άλλες παραμέτρους - θα σας βοηθήσει να προσδιορίσετε τη βέλτιστη συγκέντρωση αντισωμάτων για τα πειράματά σας.

Αυτό το βήμα ονομάζεται τιτλοδότηση αντισωμάτων και πρέπει να εκτελείται κάθε φορά που χρησιμοποιείτε ένα νέο αντίσωμα ή σύνολο πειραματικών συνθηκών. Θα πρέπει επίσης να γίνει εάν παρατηρήσετε ποτέ ότι μια νέα παρτίδα πολυκλωνικού αντισώματος δεν λειτουργεί το ίδιο με την προηγούμενη.

Πώς να τιτλοδοτήσετε ένα αντίσωμα

Πολλές εταιρείες παρέχουν συνιστώμενες αραιώσεις στα φύλλα δεδομένων αντισωμάτων τους, και αυτές είναι συνήθως καλές τιμές για να ξεκινήσετε, ωστόσο, συνιστάται να δίνετε τίτλους αντισωμάτων, καθώς οι συνθήκες που χρησιμοποιούνται για τη λήψη αυτών των συνιστώμενων αραιώσεων μπορεί να είναι πολύ διαφορετικές από αυτές που έχετε. χρησιμοποιώ ξανά. Εάν ένα φύλλο δεδομένων προϊόντος προτείνει τη χρήση αραίωσης 1:1000, δοκιμάστε μια σειρά 1:250, 1:500, 1:1000, 1:2000 και 1:4000.

Σε γενικές γραμμές, εάν βάλετε τη συνιστώμενη αραίωση με διπλασιασμό και μείωσή της στο μισό (και μια αραίωση ανάμεσα σε καθεμία από αυτές) θα πρέπει να είστε στο σωστό δρόμο. Εάν δεν υπάρχει προτεινόμενη αραίωση για να ξεκινήσετε, δοκιμάστε 1 μg/ml καθαρισμένου αντισώματος ως σημείο εκκίνησης (οι συγκεντρώσεις θα πρέπει να βρίσκονται στο φύλλο δεδομένων) και φύγετε από εκεί. Θυμηθείτε να διατηρήσετε όλες τις άλλες παραμέτρους πρωτοκόλλου ίδιες, όπως τύπο δείγματος, χρόνους επώασης, χρόνους πλύσης και θερμοκρασίες.

Σημείωση για δευτερογενή αντισώματα

Μπορεί να χρειαστεί επίσης να δοκιμάσετε διαφορετικές συγκεντρώσεις δευτερογενών αντισωμάτων - ειδικά στην περίπτωση ανίχνευσης χημειοφωταύγειας. Η συγκέντρωση του επισημασμένου με HRP δευτερογενούς αντισώματος επηρεάζει άμεσα την εμφάνιση των ζωνών. Πολύ λίγο ένζυμο HRP θα έχει ως αποτέλεσμα χαμηλό σήμα χημειοφωταύγειας και φως ή λείπουν ζώνες. Από την άλλη πλευρά, μια πολύ υψηλή συγκέντρωση θα παράγει «καμένα» συγκροτήματα. Αυτό προκαλείται από μια ταχεία εξάντληση του υποστρώματος στο κέντρο των ταινιών. Το μήκος της επώασης με αντιδραστήριο χημειοφωταύγειας θα κάνει επίσης τη διαφορά (βλέπε #6, Ανίχνευση, παρακάτω).

4. Συνθήκες αποκλεισμού

Διατίθενται διάφορα buffer αποκλεισμού και δεν λειτουργούν όλα σε κάθε περίπτωση. Είναι σημαντικό να δοκιμάσετε πολλά ρυθμιστικά διαχωριστικά για κάθε ζεύγος αντισώματος-αντιγόνου. Να θυμάστε ότι τα ανασταλτικά ρυθμιστικά διαλύματα με βάση το γάλα περιέχουν πράγματα όπως ενδογενή βιοτίνη, γλυκοπρωτεΐνες και ένζυμα που μπορεί να παρεμβαίνουν στο σήμα. Τα ρυθμιστικά με βάση το γάλα, για παράδειγμα, περιέχουν ενεργές φωσφατάσες που θα σαμποτάρουν την ανίχνευση φωσφορυλιωμένων πρωτεϊνών σε αυτές τις περιπτώσεις, δοκιμάστε εναλλακτικές λύσεις όπως αποκλειστές με βάση λευκωματίνη ορού βοοειδών.

5. Πλύσιμο

Ως επί το πλείστον, όποτε είχα υψηλό σήμα φόντου, η αναθεώρηση των βημάτων πλύσης στην επόμενη εκτέλεση έχει αποδειχθεί χρήσιμη. Συνήθως, το έκανα αυτό αυξάνοντας τη συγκέντρωση Tween-20 από 0,05% σε 0,1%. Μπορείτε επίσης να αλλάξετε την ένταση του πλυσίματος χρησιμοποιώντας οποιαδήποτε από τις ακόλουθες τακτικές: Αύξηση του χρόνου και της έντασης του πλυσίματος, εκτέλεση πρόσθετων αλλαγών στο buffer ή χρήση ισχυρότερων απορρυπαντικών (π.χ. SDS αντί Tween 20). Απλά μην το παρακάνετε.

6. Ανίχνευση

Το στάδιο ανίχνευσης είναι αναπόσπαστο μέρος για τη λήψη ενός καλού σήματος στυπώματος Western. Υπάρχουν πολλά αντιδραστήρια χημειοφωταύγειας εκεί έξω - και εναλλακτικές λύσεις χημειοφωταύγειας, όπως η ανίχνευση φθορισμού - επομένως υπάρχουν πολλές επιλογές εάν η τρέχουσα μέθοδος ανίχνευσης δεν πληροί τα εργαστηριακά πρότυπα. Μπορείτε να επιλέξετε αντιδραστήρια με μεγαλύτερη ευαισθησία ή αυτά που παράγουν σήμα μεγαλύτερης διάρκειας, για παράδειγμα. Η τελευταία επιλογή θα αυξήσει την αναπαραγωγιμότητα των λεκέδων σας αμέτρητα.

Σε απλούστερο επίπεδο, η ανίχνευση χημειοφωταύγειας μπορεί να βελτιστοποιηθεί με χρόνους έκθεσης φιλμ. Αυτό είναι πιθανώς το βήμα βελτιστοποίησης που εκτελείται συχνότερα, καθώς είναι γρήγορο και εύκολο. Πάντα να εκθέτετε τα στίγματα σας για μια σειρά από μεμονωμένα χρονικά σημεία (αλλά θυμηθείτε ότι μετά από περίπου 10 έως 15 λεπτά, όλο το υπόστρωμα HRP θα εξαντληθεί). Η επιλογή της ταινίας σας θα κάνει επίσης τη διαφορά. Πάντα έβρισκα τα φιλμ που έχουν σχεδιαστεί ειδικά για ανίχνευση χημειοφωταύγειας - αντί για οποιοδήποτε τυπικό ραδιοευαίσθητο φιλμ - να είναι η βέλτιστη επιλογή.

7. Κόψτε ένα βήμα!

Είναι λογικό ότι εάν έχετε λιγότερα βήματα για να πραγματοποιήσετε, υπάρχουν λιγότερα που μπορούν να πάνε στραβά με το πείραμά σας και υπάρχουν λιγότερα βήματα για να βελτιστοποιήσετε καταρχήν. Η τεχνολογική πρόοδος και οι απλές τροποποιήσεις αντιδραστηρίων, όπως η απεικόνιση φθορισμού και τα αντιδραστήρια συζευγμένα με HRP, αντίστοιχα, μπορούν να βοηθήσουν εδώ.

Παρόλο που τα συστήματα απεικόνισης φθορισμού μπορεί να μην είναι ακόμη διαθέσιμα σε κάθε μεμονωμένο εργαστήριο, ενδέχεται να υπάρχουν βασικές ή κεντρικές εγκαταστάσεις στο ίδρυμά σας που προσφέρουν αυτήν την τεχνολογία. Ένα άμεσο πλεονέκτημα των συστημάτων ανίχνευσης με βάση τον φθορισμό είναι ότι επιτρέπουν την ανίχνευση περισσότερων του ενός αντισωμάτων ταυτόχρονα, εξαλείφοντας την ανάγκη απογύμνωσης και επανελέγχου των κηλίδων σας. (Σας συνιστούμε, ωστόσο, να μην πραγματοποιήσετε τις αρχικές σας προσπάθειες για στύπωση Western χρησιμοποιώντας πολλαπλά πρωτογενή αντισώματα στην ίδια επώαση - ειδικά εάν η απεικόνιση φθορισμού δεν είναι διαθέσιμη και επιλέγετε να χρησιμοποιήσετε ανίχνευση χημειοφωταύγειας. Εάν θέλετε να το κάνετε αυτό τελικά, αφήστε το μέχρι να γνωρίζετε πολύ καλύτερα τις πρωτεΐνες και τα αντισώματά σας.)

Εναλλακτικά, μπορείτε να παραλείψετε εντελώς τη δευτερογενή ανίχνευση πρωτογενών αντισωμάτων και να βελτιώσετε το πρωτόκολλο Western blotting, χρησιμοποιώντας πρωτεύοντα αντισώματα συζευγμένα με HRP. Ομολογουμένως αυτά δεν είναι διαθέσιμα για κάθε πρωτεϊνικό στόχο, ωστόσο, όσοι αναγνωρίζουν κοινούς ελέγχους φόρτωσης και ετικέτες πρωτεΐνης θα μπορούσαν να σας εξοικονομήσουν πολύ χρόνο και θα μπορούσαν να είναι μια καλή επένδυση. Η Proteintech έχει πολλά από αυτά!

Συνοψίζοντας

Οι κύριοι στόχοι της βελτιστοποίησης είναι η αύξηση του λόγου σήματος προς θόρυβο συγκεκριμένων ζωνών και η μείωση των μη ειδικών ζωνών (εάν υπάρχουν). Ομολογουμένως, εάν επιλέξετε να βελτιστοποιήσετε όλες τις παραπάνω μεταβλητές, θα σας πάρει αρκετό χρόνο, ωστόσο, ακόμη και μία ή δύο αλλαγές μπορεί να κάνουν τη διαφορά και να σας εξοικονομήσουν χρόνο μακροπρόθεσμα. Σε γενικές γραμμές, θεωρώ τη βελτιστοποίηση ένα εξαιρετικά αξιόλογο εγχείρημα - και μια απαραίτητη στρατηγική εάν θέλετε να επιτύχετε Western blots ποιότητας δημοσίευσης.


Western Blotting: Quantification πρωτεΐνης

Μετά τη λύση των κυττάρων, είναι σημαντικό να προσδιοριστεί η συνολική συγκέντρωση πρωτεΐνης του δείγματος. Η ακριβής ποσοτικοποίηση του δείγματος θα σας επιτρέψει να φορτώσετε την κατάλληλη ποσότητα πρωτεΐνης σε κάθε λωρίδα. Αυτό αποφεύγει την υπερφόρτωση της λωρίδας, αλλά εξακολουθεί να επιτρέπει την επαρκή ανίχνευση της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει. Η σωστή ποσοτικοποίηση είναι επίσης κρίσιμη κατά την εκτέλεση ημι-ποσοτικών ή ποσοτικών γουέστερν. Για ακριβή προσδιορισμό των σχετικών ποσοτήτων έκφρασης πρωτεΐνης, η ίδια ποσότητα πρωτεΐνης πρέπει να φορτωθεί σε κάθε λωρίδα.

Υπάρχουν αρκετές διαφορετικές μέθοδοι για τον ποσοτικό προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης στα δείγματα. Ορισμένα (π.χ. μέτρηση περιεκτικότητας σε άζωτο ή ραδιενεργά σήμανση κυττάρων) δεν βασίζονται στις απορροφητικές ιδιότητες του δείγματος πρωτεΐνης. Ενώ αυτές μπορεί να είναι ευαίσθητες και ακριβείς δοκιμασίες, οι πιο συχνά χρησιμοποιούμενες δοκιμασίες βασίζονται στον φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης και αυτές θα είναι το επίκεντρο αυτού του οδηγού.

Οι φασματοφωτομετρικές μέθοδοι για τη μέτρηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης είναι δημοφιλείς δοκιμασίες. Γενικά είναι εύκολο να ευκολυνθούν, είναι ευαίσθητα και δεν βασίζονται στη χρήση επικίνδυνων παραγόντων. Υπάρχουν αρκετές διαφορετικές μέθοδοι και κιτ διαθέσιμα για τη χρήση ενός φασματοφωτόμετρου για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης. Η επιλογή της καλύτερης μεθόδου βασίζεται σε διάφορους παράγοντες. Ένας ποσοτικός προσδιορισμός πρωτεΐνης θα πρέπει να είναι εύκολος στη χρήση και να μην είναι δαπανηρός. Το εύρος της ανάλυσης θα πρέπει να σας επιτρέπει να ποσοτικοποιείτε με ακρίβεια όλα τα δείγματα πρωτεΐνης. Γενικά είναι επιθυμητή μια γραμμική απόκριση σε ένα ευρύ φάσμα. Η ευαισθησία της ανάλυσης θα καθορίσει το χαμηλότερο επίπεδο πρωτεΐνης που μπορεί να ανιχνευθεί. Οι δοκιμασίες έχουν επίσης διαφορετικές ιδιότητες ρυθμιστικά συστατικά, όπως απορρυπαντικά, μπορούν να επηρεάσουν τον προσδιορισμό.

Οι διαφορετικές δυνατότητες και περιορισμοί αρκετών δοκιμασιών συζητούνται παρακάτω.

Απορρόφηση στα 280 nm

Ένα γρήγορο, αλλά λιγότερο ειδικό μέτρο συγκέντρωσης πρωτεΐνης είναι η απορρόφηση του δείγματος στα 280 nm. Οι περισσότερες πρωτεΐνες έχουν μέγιστη απορρόφηση στα 280 nm σε αντίθεση με τα νουκλεϊκά οξέα που απορροφούν στα 260 nm. Τα αρωματικά υπολείμματα, όπως η τρυπτοφάνη, η τυροσίνη και η φαινυλαλανίνη είναι υπεύθυνα για την παρατηρούμενη απορρόφηση, επομένως οι πρωτεΐνες που δεν έχουν αυτά τα υπολείμματα δεν μπορούν να μετρηθούν χρησιμοποιώντας αυτή τη δοκιμασία. Απαιτεί περίπου 50 μg για ακριβείς μετρήσεις.

Αν και η μόλυνση με νουκλεϊκό οξύ μπορεί να επηρεάσει τη μέτρηση της συγκέντρωσης πρωτεΐνης στα 280 nm, μπορεί να ληφθεί πιο ακριβές μέτρο μετρώντας την απορρόφηση του δείγματος στα 260 nm και στα 280 nm και χρησιμοποιώντας τον ακόλουθο υπολογισμό:

Πρωτεΐνη mg/ml = 1,55 Α280 - 0,76 Α260

  • Καλό για δείγματα που περιέχουν μία μόνο πρωτεΐνη γνωστής γραμμομοριακής απορροφητικότητας
  • Χρήσιμο στη χρωμογραφία για τον προσδιορισμό του προφίλ έκλουσης της πρωτεΐνης
  • Εύκολη, γρήγορη δοκιμή
  • Μέτρια ευαισθησία

Μειονεκτήματα:

  • Χρειάζεται φασματοφωτόμετρο ικανό για ανάγνωση στην περιοχή UV
  • Πρέπει να χρησιμοποιείτε κουβέτες χαλαζία
  • Δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί με πρωτεΐνες που δεν περιέχουν αρωματικά υπολείμματα
  • Η μόλυνση με νουκλεϊκό οξύ μπορεί να είναι πρόβλημα

Μέθοδος Biuret

Η δοκιμή διουρίας είναι μια δοκιμή για την ανίχνευση της παρουσίας πεπτιδικών δεσμών. Υπό αλκαλικές συνθήκες, το Cu2+ σχηματίζει ένα σύμπλεγμα σε ιώδες χρώμα. Η συγκέντρωση πρωτεΐνης είναι άμεσα ανάλογη με την ένταση του χρώματος, απορροφάται στα 540 nm.

Το αντιδραστήριο Biuret περιέχει υδροξείδιο του νατρίου, ένυδρο θειικό χαλκό (II) και τρυγικό κάλιο (για τη σταθεροποίηση των συμπλοκών). Η μείωση του χαλκού έχει ως αποτέλεσμα μια αλλαγή χρώματος, η οποία μπορεί να διαβαστεί στα 550 nm. Το γραμμικό εύρος είναι τυπικά 0,5-20 mg πρωτεΐνης.

  • Δεν βασίζεται στη σύνθεση αμινοξέων της πρωτεΐνης
  • Δεν απαιτεί φασματοφωτόμετρο με δυνατότητα μέτρησης στην περιοχή UV
  • Καλό για δείγματα ολόκληρων ιστών και άλλες πηγές υψηλής συγκέντρωσης πρωτεΐνης
  • Σχετικά λίγα υλικά παρεμβαίνουν στον προσδιορισμό

Μειονεκτήματα:

  • Τα ρυθμιστικά διαλύματα, όπως το Tris και η αμμωνία, μπορούν να επηρεάσουν την αντίδραση
  • Δεν μπορεί να μετρηθεί η συγκέντρωση των πρωτεϊνών που καθιζάνουν χρησιμοποιώντας θειικό αμμώνιο
  • Όχι τόσο ευαίσθητη όσο άλλες μέθοδοι – απαιτεί υψηλότερες ποσότητες πρωτεΐνης
  • Πρέπει να δημιουργηθεί μια τυπική καμπύλη
  • Η μόλυνση με νουκλεϊκό οξύ μπορεί να είναι πρόβλημα
  • Πρωτεΐνες με ασυνήθιστα υψηλό ή χαμηλό ποσοστό αρωματικών αμινοξέων θα δώσουν υψηλές ή χαμηλές μετρήσεις

Η μέθοδος Lowry

Η ανάπτυξη της μεθόδου Lowry (που πήρε το όνομά του από τον Oliver Lowry) εισήγαγε μια πιο ευαίσθητη ανάλυση για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης πρωτεΐνης. Η μέθοδος Lowry είναι ευαίσθητη, εξαιρετικά αναπαραγώγιμη, φθηνή και εύκολη στην εκτέλεση.

Μια τροποποίηση της δοκιμής Biuret, η μέθοδος Lowry βασίζεται στην αντίδραση του χαλκού με πρωτεΐνες, αλλά το δείγμα επωάζεται επίσης με το αντιδραστήριο Folin-Ciocalteu. Η μείωση του αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu υπό αλκαλικές συνθήκες έχει ως αποτέλεσμα ένα έντονο μπλε χρώμα (μπλε ετεροπολυμολυβδαίνιο) που απορροφάται στα 750 nm. Η μέθοδος Lowry χρησιμοποιείται καλύτερα με συγκεντρώσεις πρωτεΐνης 0,01-1,0 mg/mL.

  • Εύχρηστος
  • Πολύ αναπαραγώγιμο
  • Φτηνός
  • Ευαίσθητο και ευρύ γραμμικό εύρος

Μειονεκτήματα:

  • Πρέπει να κάνετε μια τυπική καμπύλη για κάθε δοκιμασία
  • Ο χρόνος και η ανάμιξη των αντιδραστηρίων πρέπει να είναι ακριβείς
  • Η ευαισθησία εξαρτάται από τη σύνθεση της πρωτεΐνης καθώς η αντίδραση εξαρτάται εν μέρει από τα πολικά αμινοξέα
  • Παρεμβολές από ορισμένα ρυθμιστικά, ιδιαίτερα απορρυπαντικά
  • Κατάλληλο για τον προσδιορισμό της συγκέντρωσης δειγμάτων της ίδιας πρωτεΐνης και όχι ως απόλυτη μέτρηση
  • Ο προσδιορισμός μπορεί να είναι μακρύς

Δοκιμασία δικινχονικού οξέος (BCA)

Το BCA είναι παρόμοιο με το Lowry, εκτός του ότι χρησιμοποιείται δικινχονικό οξύ (BCA) αντί του αντιδραστηρίου Folin-Ciocalteu. Μετά τη μείωση των ιόντων Cu2+, δύο μόρια BCA χηλικών ενώσεων με κάθε ιόν Cu+ έχουν ως αποτέλεσμα τον σχηματισμό ενός έντονου μοβ χρώματος που απορροφά στα 560 nm.

Το BCA είναι τόσο ευαίσθητο όσο η μέθοδος Lowry και λειτουργεί καλά με συγκεντρώσεις πρωτεΐνης από 0,5 μg/mL έως 1,5 mg/mL. Αν και τα απορρυπαντικά δεν παρεμβαίνουν τόσο έντονα όσο στη μέθοδο Lowry, άλλοι ρύποι μπορεί να επηρεάσουν την αντίδραση. Επιπλέον, τα αρωματικά αμινοξέα μπορούν να επηρεάσουν την αντίδραση. Ωστόσο, σε υψηλότερες θερμοκρασίες (37-60 ° C), οι πεπτιδικοί δεσμοί μπορούν επίσης να συμβάλουν στον σχηματισμό του προϊόντος. Επομένως συνιστάται η αντίδραση σε υψηλότερες θερμοκρασίες για να αυξηθεί η ευαισθησία και να μειωθεί η μεταβλητότητα λόγω της σύνθεσης των αμινοξέων.

  • Εύχρηστος
  • Πολύ αναπαραγώγιμο
  • Φτηνός
  • Ευαίσθητο και ευρύ γραμμικό εύρος

Μειονεκτήματα:

  • Πρέπει να κάνετε μια τυπική καμπύλη για κάθε δοκιμασία
  • Παρεμβολή από υδατάνθρακες, κατεχολαμίνες, τρυπτοφάνη, λιπίδια, ερυθρό φαινόλης, κυστεΐνη, τυροσίνη, ακάθαρτη σακχαρόζη ή γλυκερόλη, ουρικό οξύ, σίδηρο και υπεροξείδιο του υδρογόνου
  • Το χρώμα συνεχίζει να αναπτύσσεται με την πάροδο του χρόνου, αλλά είναι σταθερό για μέτρηση μετά από 30 λεπτά στους 37°C

Δοκιμές δέσμευσης χρωμάτων

Οι δοκιμασίες δέσμευσης χρωστικών βασίζονται σε μια μετατόπιση απορρόφησης που συμβαίνει όταν μια βαφή συνδέεται με πρωτεΐνες. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν διάφορες διαφορετικές βαφές: Coomassie Brillant Blue G-250, πράσινη βρωμοκρεσόλη, κόκκινη πυρογαλόλη και ηωσίνη y. Η πιο συχνά χρησιμοποιούμενη δοκιμασία δέσμευσης χρωμάτων είναι η δοκιμασία Bradford.

Bradford Assay

Η δοκιμασία Bradford, που πήρε το όνομά της από την ανάπτυξή της, Marion M. Bradford, είναι μια εύκολη, ευαίσθητη και ακριβής μέθοδος για τον ποσοτικό προσδιορισμό των πρωτεϊνών. Η δέσμευση του Coomassie Brillant Blue G-250 σε πρωτεΐνες, προκαλεί μετατόπιση της βαφής από κόκκινο (465 nm) σε μπλε (595 nm) υπό όξινες συνθήκες. Είναι συμβατό με πιο κοινά αντιδραστήρια, αν και τα απορρυπαντικά μπορούν να προκαλέσουν παρεμβολές. Οι πρωτεΐνες με συγκέντρωση 20-2000 μg/mL μπορούν να μετρηθούν χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία Bradford.


Πολλαπλές ζώνες σε Western Blots - Αιτίες και λύσεις

Η δοκιμασία στυπώματος Western παρέχει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με μια πρωτεΐνη που περιλαμβάνει αφθονία, φαινομενική μοριακή μάζα, μετα-μεταφραστικές τροποποιήσεις και παραλλαγές συναρμογής. Ωστόσο, η ανάλυση της πρωτεΐνης μπορεί να είναι δύσκολη εάν εμφανίζονται πολλαπλές ζώνες στο στύπωμα. Όταν ασχολούμαστε με πολλαπλές ζώνες σε στυπώματα Western, είναι σημαντικό να προσδιορίσουμε εάν οφείλονται σε τεχνικά τεχνουργήματα ή αν αντιπροσωπεύουν πραγματικές παραλλαγές της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει. Αυτός ο οδηγός περιγράφει διάφορες αιτίες πολλαπλών ζωνών λόγω τεχνικών τεχνουργημάτων και πώς να προσδιορίσετε εάν πολλαπλές ζώνες αντιπροσωπεύουν πραγματικές παραλλαγές της πρωτεΐνης που σας ενδιαφέρει.

Πολλαπλές ζώνες που προκαλούνται από τεχνικά τεχνουργήματα

Τα τεχνικά τεχνουργήματα μπορούν να προκαλέσουν την εμφάνιση ζωνών που έχουν υψηλότερα ή χαμηλότερα μοριακά βάρη από την πραγματική πρωτεΐνη. Οι τύποι ταινιών που παρατηρούνται μπορούν να βοηθήσουν στον προσδιορισμό της αιτίας του τεχνητού.

Ζώνες χαμηλότερου και υψηλότερου μοριακού βάρους

Συγκέντρωση πρωτογενούς ή δευτερογενούς αντισώματος πολύ υψηλή

Εάν η συγκέντρωση είτε του πρωτογενούς είτε του δευτερογενούς αντισώματος είναι πολύ υψηλή, το αντίσωμα μπορεί να συνδεθεί μη ειδικά με πρωτεΐνες διαφορετικές από την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει. Η μη ειδική δέσμευση μπορεί να συμβεί με οποιαδήποτε πρωτεΐνη, επομένως μπορεί να παρατηρηθούν ζώνες υψηλότερου και χαμηλότερου μοριακού βάρους.

Τιτλοδοτήστε το αντίσωμα

Για να προσδιορίσετε εάν οι υψηλές συγκεντρώσεις αντισωμάτων οδηγούν σε πολλαπλές ζώνες, τιτλοποιήστε τα αντισώματα. Και τα δύο αντισώματα μπορούν να τιτλοδοτηθούν ταυτόχρονα χρησιμοποιώντας ένα στίγμα κουκκίδων με έναν πίνακα σκακιού όπως ο τρόπος.

Χωρίς πρωτογενή έλεγχο αντισωμάτων

Για να προσδιορίσετε γρήγορα εάν το πρωτεύον αντίσωμα είναι υπεύθυνο για την παραγωγή πολλαπλών ζωνών στο στύπωμα, εκτελέστε ολόκληρη τη διαδικασία στυπώματος Western αλλά παραλείψτε το πρωτεύον αντίσωμα. Εάν εξακολουθούν να παρατηρούνται πολλαπλές ζώνες, τότε το δευτερεύον αντίσωμα είναι υπεύθυνο για τα τεχνουργήματα.

Υπερβολική ποσότητα λύματος φορτωμένη σε τζελ

Εάν φορτωθεί πάρα πολύ προϊόν λύσης σε ένα πήκτωμα, τα αντισώματα μπορούν να συνδεθούν μη ειδικά με πρωτεΐνες υπερβολικής αφθονίας, με αποτέλεσμα πολλαπλές ζώνες.

Μειώστε την ποσότητα λύματος που χρησιμοποιείται

Για να προσδιοριστεί η κατάλληλη ποσότητα λύματος για φόρτωση στο πήκτωμα, φορτώστε μειούμενες αραιώσεις του λύματος στο πήκτωμα.

Αυξήστε τις πλύσεις

Εάν η πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει δεν είναι άφθονη, τότε μπορεί να χρειαστεί να φορτωθούν μεγάλες ποσότητες πρωτεΐνης για την ανίχνευση της πρωτεΐνης. Για να μειωθεί η μη ειδική σύνδεση με πρωτεΐνες μεγαλύτερης αφθονίας, αυξήστε τον αριθμό και τη διάρκεια των πλύσεων.

Το αντίσωμα είναι "βρώμικο"

Οι πολυκλωνικοί οροί ή τα μη καθαρισμένα αντισώματα μπορούν επίσης να περιέχουν λιγότερο άφθονα αντισώματα που συνδέονται με άφθονες, κοινές κυτταρικές πρωτεΐνες.

Χρησιμοποιήστε καθαρισμένο αντίσωμα συγγένειας

Όταν είναι δυνατόν, αγοράστε αντισώματα καθαρισμένα με συγγένεια. Εναλλακτικά, οι πολυκλωνικοί αντιοροί μπορούν να καθαριστούν με συγγένεια χρησιμοποιώντας ακινητοποιημένη Πρωτεΐνη Α, G ή L για τον καθαρισμό των μορίων IgG ή το ακινητοποιημένο αντιγόνο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον καθαρισμό αντιγόνων-ειδικών αντισωμάτων. Διατίθενται εμπορικά κιτ για καθαρισμό συγγένειας αντισωμάτων.

Ζώνες χαμηλότερου μοριακού βάρους

Αποικοδόμηση της πρωτεΐνης στόχου

Πολλαπλές ζώνες χαμηλότερου μοριακού βάρους συνήθως προκύπτουν από τον κακό χειρισμό των λύσεων/δειγμάτων πριν από την ανάλυση και μπορεί να είναι ενδεικτικό της υποβάθμισης του δείγματος.

Αναστολείς πρωτεάσης

Για να μειωθεί η διάσπαση των πρωτεϊνών από κυτταρικές πρωτεάσες, συμπεριλάβετε αναστολείς πρωτεάσης στο διάλυμα λύσης που χρησιμοποιείται για την παρασκευή του δείγματος.

Διατηρήστε τα δείγματα κρύα

Κρατήστε τα δείγματα στον πάγο κατά τη διάρκεια της προετοιμασίας και κατά τη διάρκεια όλων των χειρισμών για τον περιορισμό της δραστηριότητας της πρωτεάσης.

Περιορίστε την κατάψυξη/απόψυξη

Δείξτε δείγματα σε πολλαπλούς σωλήνες και καταψύξτε/ξεπαγώστε κάθε σωλήνα μόνο 1-2 φορές για να περιορίσετε την υποβάθμιση που προκαλείται από τις αλλαγές θερμοκρασίας.

Ζώνες υψηλότερου μοριακού βάρους

Οι ζώνες υψηλότερου μοριακού βάρους από μόνες τους μπορούν επίσης να οφείλονται σε τεχνικά τεχνουργήματα.

Η πρωτεΐνη -στόχος μπορεί να σχηματίσει πολυμερή

Τα πολυμερή πρωτεϊνών που δεν έχουν επιλυθεί μπορούν να οδηγήσουν σε ζώνες μοριακού βάρους υψηλότερες από το προβλεπόμενο μοριακό βάρος της πρωτεΐνης στόχου.

Βράζουμε σε ρυθμιστικό SDS-PAGE για 10 λεπτά

Για να μειωθούν πλήρως οι πρωτεΐνες, βράζετε το δείγμα σε ρυθμιστικό διάλυμα SDS-PAGE που περιέχει παράγοντα μετουσίωσης όπως διθειοθρεϊτόλη ή β-μερκαπτοαιθανόλη για 10 λεπτά αντί για τα συνηθισμένα 5 λεπτά.

Συγκρίνετε αναγωγική με μη αναγωγική γέλη

Για να προσδιορίσετε εάν η πρωτεΐνη που σας ενδιαφέρει σχηματίζει πολυμερή, προετοιμάστε τα δείγματα υπό αναγωγικές και μη αναγωγικές συνθήκες πριν από τη φόρτωση στο πήκτωμα.

Προσδιορισμός του κατά πόσον οι πολλαπλές ζώνες είναι επιστημονικά συναφείς

Πολλαπλές ζώνες που είναι επιστημονικά σχετικές μπορούν να παρατηρηθούν κατά την ανάλυση Western blot. Ζώνες υψηλότερου μοριακού βάρους εμφανίζονται όταν οι πρωτεΐνες δεσμεύονται σε τροποποιητές, ενώ οι ζώνες χαμηλότερου μοριακού βάρους παρατηρούνται όταν συνδέονται πρωτεΐνες.

Καθορίστε εάν οι ζώνες αναγνωρίζονται ειδικά από το αντίσωμα

Ένα από τα κριτήρια για τον προσδιορισμό του εάν πολλαπλές ζώνες οφείλονται σε τεχνικά τεχνουργήματα ή είναι επιστημονικά σχετικές, είναι να προσδιοριστεί εάν οι ζώνες αναγνωρίζονται ειδικά από το πρωτεύον αντίσωμα. Αυτό μπορεί να επιτευχθεί με τη χρήση δειγμάτων ελέγχου και/ή με ειδική αναστολή της αλληλεπίδρασης του αντισώματος με την πρωτεΐνη.

Δείγματα ελέγχου

Συμπεριλάβετε μάρτυρες στο τζελ που περιέχουν ή δεν έχουν την πρωτεΐνη που σας ενδιαφέρει. Για παράδειγμα, συμπεριλάβετε κυτταρικές σειρές που είναι πανομοιότυπες από όλες τις απόψεις εκτός από την έκφραση της πρωτεΐνης για να προσδιορίσετε τις ζώνες που εμφανίζονται λόγω μη ειδικών αλληλεπιδράσεων.

Πεπτίδια αποκλεισμού

Όταν είναι διαθέσιμα, τα πεπτίδια αποκλεισμού (εκείνα που ταιριάζουν με τον επίτοπο που αναγνωρίζεται από το αντίσωμα) μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον προσδιορισμό των ζωνών που αναγνωρίζονται ειδικά από το αντίσωμα. Προ-επώαση πρωτογενούς αντισώματος με αυξανόμενες συγκεντρώσεις πεπτιδίων αποκλεισμού πριν από την επώαση του στυπώματος με το αντίσωμα. Το πεπτίδιο αποκλεισμού θα αποτρέψει την αλληλεπίδραση του αντισώματος με τον στόχο πρωτεΐνης και η ζώνη θα "εξαφανιστεί" στο στύπωμα.

Ζώνες υψηλότερου μοριακού βάρους

Ζώνες υψηλότερου μοριακού βάρους εμφανίζονται συχνά όταν η πρωτεΐνη στόχος τροποποιείται μεταφραστικά. Η ακετυλίωση, η μεθυλίωση, η μυριστοϋλίωση, η φωσφορυλίωση, η γλυκοζυλίωση και η πανταπαρουσία είναι όλες τροποποιήσεις που αυξάνουν το μοριακό βάρος μιας πρωτεΐνης. Διάφορες τεχνικές μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να προσδιοριστεί εάν μια πρωτεΐνη τροποποιείται μεταφραστικά.

Λογισμικό ανάλυσης πρωτεϊνών

Χρησιμοποιήστε λογισμικό ανάλυσης πρωτεϊνών για να προβλέψετε τους τύπους τροποποιήσεων που μπορεί να αποκτήσει μια πρωτεΐνη μετά τη μετάφραση. Χρησιμοποιήστε το λογισμικό για να προβλέψετε το μοριακό βάρος της πρωτεΐνης με και χωρίς τροποποιήσεις.

Αντισώματα ειδικά για τροποποίηση

Διατίθενται στο εμπόριο πρωτογενή αντισώματα που αναγνωρίζουν συγκεκριμένες μετα -μεταφραστικές τροποποιήσεις (π.χ. αντισώματα ειδικά για φωσφορυλίωση τυροσίνης). Αυτά τα αντισώματα μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να επιβεβαιώσουν μεταμεταφραστικές τροποποιήσεις. Για να χρησιμοποιήσετε αυτά τα αντισώματα, καταβυθίστε την πρωτεΐνη που σας ενδιαφέρει χρησιμοποιώντας το πρωτεϊνικό αντίσωμα ειδικό για την πρωτεΐνη. Εκτελέστε το ανοσοκαταβυθισμένο κλάσμα σε ένα τζελ και στη συνέχεια εκτελέστε ένα στύπωμα Western χρησιμοποιώντας το συγκεκριμένο για τροποποίηση πρωτογενές αντίσωμα.

Χημικές επεξεργασίες για την αφαίρεση τροποποιήσεων

Οι πρωτεΐνες και τα εκχυλίσματα πρωτεϊνών μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία με χημικές ουσίες που θα αφαιρέσουν τροποποιήσεις (π.χ. η PNGase F χρησιμοποιείται για την αφαίρεση γλυκοσυλιώσεων). Η πλήρης αφαίρεση όλων των τροποποιήσεων θα πρέπει να έχει ως αποτέλεσμα μία μόνο ζώνη του προβλεπόμενου μοριακού βάρους στην ανάλυση στυπώματος Western. Κατά την επεξεργασία με χημικές ουσίες για την αφαίρεση τροποποιητών, είναι σημαντικό να συμπεριλαμβάνονται επίσης μη επεξεργασμένα δείγματα στο ίδιο πήκτωμα για να παρατηρούνται οι αλλαγές στο σχέδιο ζωνών.

Ζώνες χαμηλότερου μοριακού βάρους

Μπορούν να παρατηρηθούν ζώνες χαμηλότερου μοριακού βάρους εάν δημιουργηθούν πρόσθετες μορφές της πρωτεΐνης που μας ενδιαφέρει μέσω εναλλακτικού ματίσματος ή διάσπασης της πρωτεΐνης μετά τη μετάφραση. Το λογισμικό ανάλυσης RNA και πρωτεΐνης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την πρόβλεψη αυτών των συμβάντων, ωστόσο αυτές οι τροποποιήσεις θα πρέπει να προσδιοριστούν εμπειρικά για κάθε πρωτεΐνη.

Παραλλαγές συναρμογής

Το εναλλακτικό μάτισμα ενός mRNA μπορεί να δημιουργήσει πολλαπλά πρωτεϊνικά προϊόντα. Εάν ο επίτοπος που αναγνωρίζει το αντίσωμα είναι κοινός μεταξύ των πρωτεϊνών, τότε θα παρατηρηθούν πολλαπλές ζώνες.

Η πρωτεΐνη διασπάται

Μπορεί να παρατηρηθούν ζώνες χαμηλότερου μοριακού βάρους εάν η πρωτεΐνη διασπαστεί μετά τη μετάφραση. Τα πολυκλωνικά αντισώματα μπορεί να αναγνωρίζουν πολλαπλές ζώνες χαμηλότερου μοριακού βάρους λόγω της ικανότητάς τους να αναγνωρίζουν πολλαπλούς επιτόπους. Τα μονοκλωνικά αντισώματα αναγνωρίζουν μόνο μία ζώνη του προϊόντος (των) διάσπασης.


Συλλογή δεδομένων

Το σήμα χημειοφωταύγειας western blot μπορεί να καταγραφεί με φιλμ ακτίνων Χ, όργανα ψηφιακής απεικόνισης που βασίζονται σε κάμερα με συζευγμένη συσκευή (CCD) και φωσφοροεικονογράφο που ανιχνεύουν τη χημειοφωταύγεια. Παρόλο που η μεμβράνη ακτίνων Χ παρέχει ποιοτικά και ημι-ποσοτικά δεδομένα και είναι χρήσιμη για την επιβεβαίωση της παρουσίας πρωτεϊνών-στόχων, τα εργαλεία απεικόνισης με βάση την κάμερα CCD προσφέρουν τα πλεονεκτήματα της ποιοτικής ανάλυσης, της στιγμιαίας λήψης και ανάλυσης εικόνας, υψηλότερης ευαισθησίας, μεγαλύτερης ανάλυσης και μεγαλύτερου δυναμικό εύρος από το φιλμ. Επιπλέον, δεν χρειάζεται αποκλειστικός χώρος σκοτεινού δωματίου και εξοπλισμός προγραμματιστή. Τα όργανα απεικόνισης μπορούν να τοποθετηθούν απευθείας σε έναν πάγκο μαζί με άλλα εργαστηριακά μηχανήματα.

Κάμερες CCD για λήψη χημειοφωταύγειας εικόνας

ΠλεονεκτήματαΠεριορισμοί
Δυναμικό εύρος με τάξεις μεγέθους & gt4Οι εκτεταμένες εκθέσεις (>60 λεπτά) μπορούν να οδηγήσουν σε αυξημένο φόντο από το θόρυβο της κάμερας
Οι έξυπνοι αλγόριθμοι βοηθούν στον καθορισμό του βέλτιστου χρόνου έκθεσης
Βελτιωμένη ανάλυση και αποθήκευση εικόνας
Άμεση απεικόνιση των αποτελεσμάτων
Ποσοτικός
Τα συστήματα iBright Imaging διαθέτουν κάμερα CCD με ψύξη 9,1 MP που παρέχει υψηλή ευαισθησία και δυναμικό εύρος για να διευκολύνει τον εντοπισμό λεπτών διαφορών στα δείγματα.

Συχνά, είναι απαραίτητο να εκτεθούν πολλά φιλμ για διαφορετικές χρονικές περιόδους για να επιτευχθεί η σωστή ισορροπία μεταξύ σήματος και φόντου. Ο στόχος είναι να χρονομετρηθεί η έκθεση των μεμβρανών στο φιλμ έτσι ώστε το επιθυμητό σήμα να είναι σαφώς ορατό ενώ το φόντο παραμένει χαμηλό. Αυτό είναι δύσκολο να επιτευχθεί αφού η διαδικασία δεν μπορεί να παρατηρηθεί και να σταματήσει όταν επιτευχθεί το επιθυμητό τελικό σημείο. Εάν το φιλμ δεν είναι εκτεθειμένο για αρκετό χρονικό διάστημα (υπό έκθεση), το σήμα δεν θα είναι ορατό. Εάν το φιλμ εκτίθεται πολύ (υπερβολικά εκτεθειμένο), το σήμα μπορεί να χαθεί στο παρασκήνιο ή οι ξεχωριστές ζώνες να θολώσουν μαζί. Επιπλέον, η κρίση του βέλτιστου χρόνου έκθεσης είναι εξαιρετικά υποκειμενική, καθώς είναι δύσκολο να προσδιοριστεί οπτικά το ακριβές σημείο στο οποίο επιτυγχάνεται η καλύτερη ισορροπία σήματος προς θόρυβο. Συχνά εκτελούνται επανειλημμένες περιόδους έκθεσης της ταινίας και ανάπτυξης της ταινίας, οι οποίες μπορούν να προσθέσουν σημαντική επένδυση χρόνου. Μετά την καταγραφή των δεδομένων στο φιλμ, το φιλμ σαρώνεται συχνά για να δημιουργηθεί ένα ψηφιακό αντίγραφο των δεδομένων, το οποίο στη συνέχεια εξάγεται σε λογισμικό ανάλυσης για να διευκολύνει την περαιτέρω ανάλυση, όπως πυκνομετρία και εκτίμηση μοριακού βάρους.

Ένα από τα μεγαλύτερα πλεονεκτήματα των συστημάτων ψηφιακής απεικόνισης είναι η δυνατότητα μικρορύθμισης του χρόνου έκθεσης (ορισμένα συστήματα προσφέρουν τη δυνατότητα προσαρμογής του χρόνου έκθεσης στο χιλιοστό του δευτερολέπτου). Επιπλέον, πολλά συστήματα προσφέρουν συγκεκριμένες ρυθμίσεις αυτόματης έκθεσης που χρησιμοποιούν αλγόριθμους που καθορίζουν αυτόματα τον βέλτιστο χρόνο έκθεσης, ο οποίος όχι μόνο καταγράφει μια εικόνα με βέλτιστο σήμα προς θόρυβο, αλλά εξοικονομεί επίσης σημαντικό χρόνο έναντι των πολλαπλών εκθέσεων που συχνά απαιτούνται με φιλμ. Δεδομένου ότι τα δεδομένα συλλαμβάνονται ψηφιακά, μπορούν εύκολα να εξαχθούν σε λογισμικό ανάλυσης (καταργώντας το βήμα σάρωσης με φιλμ). Μερικά από τα πιο σύγχρονα συστήματα προσφέρουν τη δυνατότητα πραγματοποίησης ανάλυσης απευθείας στο όργανο. Αυτές οι ευκολίες καθιστούν την ψηφιακή απεικόνιση δημοφιλή αντικατάσταση της λήψης δεδομένων με βάση την ταινία.


Ηλεκτροφόρηση γέλης πολυακρυλαμιδίου (PAGE)

Μετά από αυτά τα στάδια προετοιμασίας δείγματος, η PAGE πραγματοποιείται για τον διαχωρισμό των μετουσιωμένων και αρνητικά φορτισμένων πρωτεϊνών με βάση το μοριακό τους βάρος. Ο διαχωρισμός των πρωτεϊνικών δειγμάτων εντός πηκτωμάτων πολυακρυλαμιδίου συμβαίνει λόγω της αντίστασης τριβής μιας πρωτεΐνης καθώς μεταναστεύει μέσω των πόρων που σχηματίζονται μεταξύ των πολυμερών αλυσίδων εντός της γέλης (Ornstein, 1964). Τα πηκτώματα πολυακρυλαμιδίου περιλαμβάνουν πολυμερισμένα μονομερή ακρυλαμιδίου μαζί με μονομερή Ν,Ν'-Μεθυλενοδισακρυλαμιδίου (Raymond & Weintraub, 1959), δημιουργώντας πόρους ομοιόμορφου μεγέθους, που εξαρτώνται τόσο από τη συγκέντρωση του μονομερούς όσο και από την αναλογία διασταυρούμενης σύνδεσης. As an electrical current is passed, proteins move through pores within the gel structure as such, altering the bis-acrylamide concentration regulates pore size and consequently the ability of larger proteins to migrate. Gels with a higher acrylamide concentration (e.g., 20%) impede the movement of larger proteins to a greater degree than those of a smaller molecular weight but better resolve those of lower molecular weights (e.g., 4EBP1

20 kDa) (Chrambach & Rodbard, 1971 ). Similarly, if the desired target is a large protein (e.g., mTOR

289 kDa), a lower concentration gel (e.g., 7.5%) may be required for optimal resolution. Alternatively gradient gels (e.g., 4–12%) provide uniform resolution across the molecular-weight spectrum (Rath et al., 2013 ). Other gel types such as agarose may be used, but are less common as they are predominantly used for very large molecular-weight proteins (e.g., titin isoforms 700–4200 kDa) giving superior separation when compared to polyacrylamide gels (Warren et al., 2003 ). Agarose gels may be hand-cast but require storage at 4°C to prevent drying out. Other hand-cast gels may also require use soon after casting and may vary between runs due to the short shelf life of some chemicals. The choice between commercial and hand-cast gels is generally the preference of the user, but commercial gels are generally more consistent. Ultimately, the concentration of the cross-linking molecules and the molecular weight of the protein(s) of interest are the determining factors for gel choice as taken together these will allow for efficient migration and optimal band resolution. The choice of gel concentration and composition is mainly determined by the molecular weight of the protein(s) of interest, as it will allow efficient migration and optimal band resolution.

Whereas electrophoresis of nucleic acids utilizes a constant pH within the buffer and gel to achieve discernable separation (Westermeier, 2005 ), protein samples require a discontinuous buffer system (Ornstein, 1964 ). Discontinuous systems utilize gels separated into two regions, comprising a “stacking gel” above a “resolving or separating gel” with larger and smaller pores, respectively. Discontinuous systems are designed to focus protein samples and allow clear resolution of proteins. Initially, proteins migrate quickly through the large pore stacking gel until they reach the resolving gel, whereupon the smaller pore size slows migration, causing the proteins to stack together into compact bands (Ornstein, 1964 ). The second principle utilizes the electrophoretic migration of both ions and proteins through a pH-buffered solution. Chloride ions present within the gel have a higher mobility and therefore migrate faster than denatured proteins, establishing a leading ion boundary (Ornstein, 1964 ). Within traditional Tris-HCl stacking gels (pH 6.8), a trailing boundary of glycinate ions form behind migrating proteins due to reduced mobility at a low pH (Walker, 1994 ). Ultimately, migrating proteins are sandwiched between the two ion boundaries, stacking the sample into tightly focused bands, whereupon they migrate into the resolving gel containing smaller pores, slowing the progression of proteins dependent on their size as previously mentioned. Tris-HCl resolving gels are typically formed at pH 8.8 this higher pH allows the ionization of the trailing glycinate, increasing its mobility (Ornstein, 1964 ). Consequently, both chloride and glycinate boundaries will migrate past the protein samples, no longer constricting them into focused bands, allowing the unimpeded separation of proteins. Alternative gels and discontinuous buffer systems are available that may be better suited to the resolution of either larger or smaller molecular-weight proteins depending on sample composition. For example, Bis-Tris systems utilize different buffers containing either 3-(Ν-morpholino)propanesulfonic acid (MOPS) or 2-(Ν-morpholino)ethanesulfonic acid (MES), which function as trailing boundary ions instead of glycinate (Hachmann & Amshey, 2005 ). These allow greater resolution of mid-sized (

75 kDa) or smaller (<36 kDa) proteins with MOPS or MES, respectively. Bis-Tris gels are cast at pH 6.8, offering significantly longer shelf life compared with Tris-HCl gels as they do not undergo acrylamide hydrolysis due to their acidic nature. Generally, electrophoresis is undertaken using a constant voltage, rather than a constant current, due to the linear relation of protein migration and voltage. As current is dependent on the voltage and resistance, a constant current will not control protein migration as changes in resistance (i.e., warming of the buffer) will cause the voltage to fluctuate. Depending on the apparatus, electrophoresis is typically performed for 60 min with a constant voltage of 200 V to give a suitable separation of protein lysates however, less time may be required for smaller molecular-weight proteins.


Περιεχόμενα

The western blot is extensively used in biochemistry for the qualitative detection of single proteins and protein-modifications (such as post-translational modifications). At least 8-9% of all protein-related publications are estimated to apply western blots. [5] It is used as a general method to identify the presence of a specific single protein within a complex mixture of proteins. A semi-quantitative estimation of a protein can be derived from the size and color intensity of a protein band on the blot membrane. In addition, applying a dilution series of a purified protein of known concentrations can be used to allow a more precise estimate of protein concentration. The western blot is routinely used for verification of protein production after cloning. It is also used in medical diagnostics, e.g., in the HIV test or BSE-Test.

The confirmatory HIV test employs a western blot to detect anti-HIV antibody in a human serum sample. Proteins from known HIV-infected cells are separated and blotted on a membrane as above. Then, the serum to be tested is applied in the primary antibody incubation step free antibody is washed away, and a secondary anti-human antibody linked to an enzyme signal is added. The stained bands then indicate the proteins to which the patient's serum contains antibody. [6] A western blot is also used as the definitive test for variant Creutzfeldt-Jakob Disease, a type of prion disease linked to the consumption of contaminated beef from cattle with Bovine spongiform encephalopathy (BSE, commonly referred to as 'mad cow disease'). [7]

Another application is in the diagnosis of tularemia. An evaluation of the western blot's ability to detect antibodies against F. tularensis revealed that its sensitivity is almost 100% and the specificity is 99.6%. [8]

Some forms of Lyme disease testing employ western blotting. [9] A western blot can also be used as a confirmatory test for Hepatitis B infection and HSV-2 (Herpes Type 2) infection. [10] [11] In veterinary medicine, a western blot is sometimes used to confirm FIV+ status in cats. [12]

Further applications of the western blot technique include its use by the World Anti-Doping Agency (WADA). Blood doping is the misuse of certain techniques and/or substances to increase one's red blood cell mass, which allows the body to transport more oxygen to muscles and therefore increase stamina and performance. There are three widely known substances or methods used for blood doping, namely, erythropoietin (EPO), synthetic oxygen carriers and blood transfusions. Each is prohibited under WADA's List of Prohibited Substances and Methods. The western blot technique was used during the 2014 FIFA World Cup in the anti-doping campaign for that event. [13] In total, over 1000 samples were collected and analyzed by Reichel, et al. [14] in the WADA accredited Laboratory of Lausanne, Switzerland. Recent research utilizing the western blot technique showed an improved detection of EPO in blood and urine based on novel Velum SAR precast horizontal gels optimized for routine analysis. [15] With the adoption of the horizontal SAR-PAGE in combination with the precast film-supported Velum SAR gels the discriminatory capacity of micro-dose application of rEPO was significantly enhanced.

The western blot method is composed of a gel electrophoresis to separate native proteins by 3-D structure or denatured proteins by the length of the polypeptide, followed by an electrophoretic transfer onto a membrane (mostly PVDF or Nitrocellulose) and an immunostaining procedure to visualize a certain protein on the blot membrane. SDS-PAGE is generally used for the denaturing electrophoretic separation of proteins. SDS is generally used as a buffer (as well as in the gel) in order to give all proteins present a uniform negative charge, since proteins can be positively, negatively, or neutrally charged. This type of electrophoresis is known as SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis). Prior to electrophoresis, protein samples are often boiled to denature the proteins present. This ensures that proteins are separated based on size and prevents proteases (enzymes that break down proteins) from degrading samples. Following electrophoretic separation, the proteins are transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF). The membrane is often then stained with Ponceau S in order to visualize the proteins on the blot and ensure a proper transfer occurred. Next the proteins are blocked with milk (or other blocking agents) to prevent non-specific antibody binding, and then stained with antibodies specific to the target protein. [4] [16] Lastly, the membrane will be stained with a secondary antibody that recognizes the first antibody staining, which can then be used for detection by a variety of methods. The gel electrophoresis step is included in western blot analysis to resolve the issue of the cross-reactivity of antibodies.

Gel electrophoresis Edit

The proteins of the sample are separated using gel electrophoresis. Separation of proteins may be by isoelectric point (pI), molecular weight, electric charge, or a combination of these factors. The nature of the separation depends on the treatment of the sample and the nature of the gel.

By far the most common type of gel electrophoresis employs polyacrylamide gels and buffers loaded with sodium dodecyl sulfate (SDS). SDS-PAGE (SDS polyacrylamide gel electrophoresis) maintains polypeptides in a denatured state once they have been treated with strong reducing agents to remove secondary and tertiary structure (e.g. disulfide bonds [S-S] to sulfhydryl groups [SH and SH]) and thus allows separation of proteins by their molecular mass. Sampled proteins become covered in the negatively charged SDS, effectively becoming anionic, and migrate towards the positively charged (higher voltage) anode (usually having a red wire) through the acrylamide mesh of the gel. Smaller proteins migrate faster through this mesh, and the proteins are thus separated according to size (usually measured in kilodaltons, kDa). The concentration of acrylamide determines the resolution of the gel – the greater the acrylamide concentration, the better the resolution of lower molecular weight proteins. The lower the acrylamide concentration, the better the resolution of higher molecular weight proteins. Proteins travel only in one dimension along the gel for most blots.

Samples are loaded into πηγάδια in the gel. One lane is usually reserved for a σημάδι ή σκάλα, which is a commercially available mixture of proteins of known molecular weights, typically stained so as to form visible, coloured bands. When voltage is applied along the gel, proteins migrate through it at different speeds dependent on their size. These different rates of advancement (different electrophoretic mobilities) separate into bands μέσα στο καθένα λωρίδαΤο Protein bands can then be compared to the ladder bands, allowing estimation of the protein's molecular weight.

It is also possible to use a two-dimensional gel which spreads the proteins from a single sample out in two dimensions. Proteins are separated according to isoelectric point (pH at which they have a neutral net charge) in the first dimension, and according to their molecular weight in the second dimension.

Transfer Edit

To make the proteins accessible to antibody detection, they are moved from within the gel onto a membrane, a solid support, it’s an essential part of the process. There are two types of membrane: nitrocellulose (NC) or polyvinylidene difluoride (PVDF). NC membrane has high affinity for protein and its retention abilities. however, NC is brittle, and does not allow the blot to be used for re-probing. whereas, PVDF membrane allows the blot to be re-probed. [17] The most commonly used method for transferring the proteins is called electroblotting. Electroblotting uses an electric current to pull the negatively charged proteins from the gel towards the positively charged anode, and into the PVDF or NC membrane. The proteins move from within the gel onto the membrane while maintaining the organization they had within the gel. An older method of transfer involves placing a membrane on top of the gel, and a stack of filter papers on top of that. The entire stack is placed in a buffer solution which moves up the paper by capillary action, bringing the proteins with it. In practice this method is not commonly used due to the lengthy procedure time.

As a result of either transfer process, the proteins are exposed on a thin membrane layer for detection. Both varieties of membrane are chosen for their non-specific protein binding properties (i.e. binds all proteins equally well). Protein binding is based upon hydrophobic interactions, as well as charged interactions between the membrane and protein. Nitrocellulose membranes are cheaper than PVDF, but are far more fragile and cannot withstand repeated probings.

Total protein staining Edit

Total protein staining allows the total protein that has been successfully transferred to the membrane to be visualised, allowing the user to check the uniformity of protein transfer and to perform subsequent normalization of the target protein with the actual protein amount per lane. Normalization with the so-called "loading control" was based on immunostaining of housekeeping proteins in the classical procedure, but is heading toward total protein staining recently, due to multiple benefits. [18] At least seven different approaches for total protein staining have been described for western blot normalization: Ponceau S, stain-free techniques, Sypro Ruby, Epicocconone, Coomassie R-350, Amido Black, and Cy5. [18] In order to avoid noise of signal, total protein staining should be performed before blocking of the membrane. Nevertheless, post-antibody stainings have been described as well. [19]

Blocking Edit

Since the membrane has been chosen for its ability to bind protein and as both antibodies and the target are proteins, steps must be taken to prevent the interactions between the membrane and the antibody used for detection of the target protein. Blocking of non-specific binding is achieved by placing the membrane in a dilute solution of protein – typically 3–5% bovine serum albumin (BSA) or non-fat dry milk (both are inexpensive) in tris-buffered saline (TBS) or I-Block, with a minute percentage (0.1%) of detergent such as Tween 20 or Triton X-100. Although non-fat dry milk is preferred due to its availability, an appropriate blocking solution is needed as not all proteins in milk are compatible with all the detection bands. [20] The protein in the dilute solution attaches to the membrane in all places where the target proteins have not attached. Thus, when the antibody is added, it cannot bind to the membrane, and therefore the only available binding site is the specific target protein. This reduces background in the final product of the western blot, leading to clearer results, and eliminates false positives.

Incubation Edit

During the detection process the membrane is "probed" for the protein of interest with a modified antibody which is linked to a reporter enzyme when exposed to an appropriate substrate, this enzyme drives a colorimetric reaction and produces a color. For a variety of reasons, this traditionally takes place in a two-step process, although there are now one-step detection methods available for certain applications.

Primary antibody Edit

The primary antibodies are generated when a host species or immune cell culture is exposed to the protein of interest (or a part thereof). Normally, this is part of the immune response, whereas here they are harvested and used as sensitive and specific detection tools that bind the protein directly.

After blocking, a solution of primary antibody (generally between 0.5 and 5 micrograms/mL) diluted in either PBS or TBST wash buffer is incubated with the membrane under gentle agitation for typically an hour at room temperature, or overnight at 4°C. The antibody solution is incubated with the membrane for anywhere from 30 minutes to overnight. It can also be incubated at different temperatures, with lesser temperatures being associated with more binding, both specific (to the target protein, the "signal") and non-specific ("noise"). Following incubation, the membrane is washed several times in wash buffer to remove unbound primary antibody, and thereby minimize background. [20] Typically, the wash buffer solution is composed of buffered saline solution with a small percentage of detergent, and sometimes with powdered milk or BSA.

Secondary antibody Edit

After rinsing the membrane to remove unbound primary antibody, the membrane is exposed to another antibody known as the secondary antibody. Antibodies come from animal sources (or animal sourced hybridoma cultures). The secondary antibody recognises and binds to the species-specific portion of the primary antibody. Therefore, an anti-mouse secondary antibody will bind to almost any mouse-sourced primary antibody, and can be referred to as an 'anti-species' antibody (e.g. anti-mouse, anti-goat etc.). To allow detection of the target protein, the secondary antibody is commonly linked to biotin or a reporter enzyme such as alkaline phosphatase or horseradish peroxidase. This means that several secondary antibodies will bind to one primary antibody and enhance the signal, allowing the detection of proteins of a much lower concentration than would be visible by SDS-PAGE alone.

Horseradish peroxidase (HRP) is commonly linked to secondary antibodies to allow the detection of the target protein by chemiluminescence. The chemiluminscent substrate is cleaved by HRP, resulting in the production of luminescence. Therefore, the production of luminescence is proportional to the amount of HRP-conjugated secondary antibody, and therefore, indirectly measures the presence of the target protein. A sensitive sheet of photographic film is placed against the membrane, and exposure to the light from the reaction creates an image of the antibodies bound to the blot. A cheaper but less sensitive approach utilizes a 4-chloronaphthol stain with 1% hydrogen peroxide the reaction of peroxide radicals with 4-chloronaphthol produces a dark purple stain that can be photographed without using specialized photographic film.

As with the ELISPOT and ELISA procedures, the enzyme can be provided with a substrate molecule that will be converted by the enzyme to a colored reaction product that will be visible on the membrane (see the figure below with blue bands).

Another method of secondary antibody detection utilizes a near-infrared (NIR) fluorophore-linked antibody. The light produced from the excitation of a fluorescent dye is static, making fluorescent detection a more precise and accurate measure of the difference in the signal produced by labeled antibodies bound to proteins on a western blot. Proteins can be accurately quantified because the signal generated by the different amounts of proteins on the membranes is measured in a static state, as compared to chemiluminescence, in which light is measured in a dynamic state. [21]

A third alternative is to use a radioactive label rather than an enzyme coupled to the secondary antibody, such as labeling an antibody-binding protein like Σταφυλόκοκκος Protein A or Streptavidin with a radioactive isotope of iodine. Since other methods are safer, quicker, and cheaper, this method is now rarely used however, an advantage of this approach is the sensitivity of auto-radiography-based imaging, which enables highly accurate protein quantification when combined with optical software (e.g. Optiquant).

One step Edit

Historically, the probing process was performed in two steps because of the relative ease of producing primary and secondary antibodies in separate processes. This gives researchers and corporations huge advantages in terms of flexibility, reduction of cost, and adds an amplification step to the detection process. Given the advent of high-throughput protein analysis and lower limits of detection, however, there has been interest in developing one-step probing systems that would allow the process to occur faster and with fewer consumables. This requires a probe antibody which both recognizes the protein of interest and contains a detectable label, probes which are often available for known protein tags. The primary probe is incubated with the membrane in a manner similar to that for the primary antibody in a two-step process, and then is ready for direct detection after a series of wash steps.

Detection and visualization Edit

After the unbound probes are washed away, the western blot is ready for detection of the probes that are labeled and bound to the protein of interest. In practical terms, not all westerns reveal protein only at one band in a membrane. Size approximations are taken by comparing the stained bands to that of the marker or ladder loaded during electrophoresis. The process is commonly repeated for a structural protein, such as actin or tubulin, that should not change between samples. The amount of target protein is normalized to the structural protein to control between groups. A superior strategy is the normalization to the total protein visualized with trichloroethanol [22] [23] or epicocconone. [24] This practice ensures correction for the amount of total protein on the membrane in case of errors or incomplete transfers. (see western blot normalization)

Colorimetric detection Edit

The colorimetric detection method depends on incubation of the western blot with a substrate that reacts with the reporter enzyme (such as peroxidase) that is bound to the secondary antibody. This converts the soluble dye into an insoluble form of a different color that precipitates next to the enzyme and thereby stains the membrane. Development of the blot is then stopped by washing away the soluble dye. Protein levels are evaluated through densitometry (how intense the stain is) or spectrophotometry.

Chemiluminescent detection Edit

Chemiluminescent detection methods depend on incubation of the western blot with a substrate that will luminesce when exposed to the reporter on the secondary antibody. The light is then detected by CCD cameras which capture a digital image of the western blot or photographic film. The use of film for western blot detection is slowly disappearing because of non linearity of the image (non accurate quantification). The image is analysed by densitometry, which evaluates the relative amount of protein staining and quantifies the results in terms of optical density. Newer software allows further data analysis such as molecular weight analysis if appropriate standards are used.

Radioactive detection Edit

Radioactive labels do not require enzyme substrates, but rather, allow the placement of medical X-ray film directly against the western blot, which develops as it is exposed to the label and creates dark regions which correspond to the protein bands of interest (see image above). The importance of radioactive detections methods is declining due to its hazardous radiation [ αναφορά που απαιτείται ] , because it is very expensive, health and safety risks are high, and ECL (enhanced chemiluminescence) provides a useful alternative.

Fluorescent detection Edit

The fluorescently labeled probe is excited by light and the emission of the excitation is then detected by a photosensor such as a CCD camera equipped with appropriate emission filters which captures a digital image of the western blot and allows further data analysis such as molecular weight analysis and a quantitative western blot analysis. Fluorescence is considered to be one of the best methods for quantification but is less sensitive than chemiluminescence. [25]

Secondary probing Edit

One major difference between nitrocellulose and PVDF membranes relates to the ability of each to support "stripping" antibodies off and reusing the membrane for subsequent antibody probes. While there are well-established protocols available for stripping nitrocellulose membranes, the sturdier PVDF allows for easier stripping, and for more reuse before background noise limits experiments. Another difference is that, unlike nitrocellulose, PVDF must be soaked in 95% ethanol, isopropanol or methanol before use. PVDF membranes also tend to be thicker and more resistant to damage during use.


Επιλογές πρόσβασης

Αποκτήστε πλήρη πρόσβαση στο περιοδικό για 1 έτος

Όλες οι τιμές είναι τιμές NET.
Ο ΦΠΑ θα προστεθεί αργότερα στο ταμείο.
Ο υπολογισμός του φόρου θα οριστικοποιηθεί κατά το ταμείο.

Αποκτήστε περιορισμένο χρονικό διάστημα ή πλήρη πρόσβαση στο άρθρο στο ReadCube.

Όλες οι τιμές είναι τιμές NET.


Επιπλέον πληροφορίες

Ανταγωνιστικά συμφέροντα

The authors have no competing interests to declare.

Συνεισφορές συγγραφέων

EZ performed the proteomic analysis and contributed to its design, the 2-DE and gel image analysis, and the statistical analysis on the proteomic data, and drafted the manuscript. AM contributed to the overall experimental design of the proteomic analysis and to the preparation of the manuscript. ST and MP performed the LC-MS/MS analyses and identified the relevant spots MP and ART ran the Western blot analyses. SY and CG conceived the overall experimental design, and managed the chicken growth and sampling phases. MC generally coordinated the study, contributed to the proteomic experiment design, and was involved in fund raising and manuscript preparation. All authors have read and approved the final manuscript.