Πληροφορίες

Σε αυτήν την απεικόνιση σχετικά με τη λειτουργία CRISPR, τι σημαίνουν αυτά τα αντικείμενα (παρέχεται εικόνα);

Σε αυτήν την απεικόνιση σχετικά με τη λειτουργία CRISPR, τι σημαίνουν αυτά τα αντικείμενα (παρέχεται εικόνα);


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Στην εργασία για τα CRISPRs, φαίνεται το ακόλουθο σχήμα:

Πρόσθεσα τα ανοιχτό πράσινα κουτιά.

Τι σημαίνουν τα κόκκινα βέλη και η γραμμή με έναν γεμάτο κύκλο στην άκρη αριστερά; Τι σημαίνει το βέλος στη μέση (επίσης ακριβώς μπροστά από το cas9); Το μοβ τετράγωνο πρέπει να νοηθεί ως τμήμα RNA στο διάγραμμα Β (μπλε βέλος);

Βγαλμένο από εδώ.

Η λεζάντα είναι (αναφέρεται):

Το σύστημα τύπου ΙΙ-Α από το S. pyogenes παρουσιάζεται ως παράδειγμα. (Α) Το οπερόνιο του γονιδίου cas με tracrRNA και τον πίνακα CRISPR. (Β) Η φυσική οδός της αντιιικής άμυνας περιλαμβάνει τη συσχέτιση του Cas9 με τα διπλά αντι-επαναλαμβανόμενα RNA (tracrRNA: crRNA), συμπαραγωγή του RNA με ριβονουκλεάση III, περαιτέρω περικοπή, σχηματισμό βρόχου R και διάσπαση DNA στόχου. (Γ) Λεπτομέρειες της φυσικής διάσπασης του DNA με το διπλό tracrRNA:crRNA.


Η κατεύθυνση του βέλους δηλώνει την κατεύθυνση της μεταγραφής και η θέση της δηλώνει την τοποθεσία έναρξης της μεταγραφής. Ο κύκλος είναι πιθανώς ο τερματισμός της μεταγραφής (δεν μπορώ να έχω πρόσβαση σε αυτό το άρθρο προς το παρόν, αλλά αυτό πρέπει να σημαίνει).

Τα μοβ κουτιά αναφέρονται στους πρωτοδιαχωριστές που προέρχονται από ξένο DNA. Αυτά τα στοιχεία βοηθούν στην αναγνώριση και τη διάσπαση του ξένου DNA. Αυτά μεταγράφονται ως RNA που με τη σειρά τους καθοδηγούν το σύμπλεγμα Cas στο DNA στόχο. Κατά κάποιο τρόπο, αυτοί οι πρωτοδιαστήματα παρέχουν κάποιο είδος ανοσολογικής μνήμης στα βακτήρια. Δείτε το παρακάτω σχήμα (Από Nuñez et αϊ. 2015 ):


Ποιοτικός έλεγχος, μοντελοποίηση και οπτικοποίηση οθονών CRISPR με MAGeCK-VISPR

Οι οθόνες CRISPR υψηλής απόδοσης έχουν υποσχεθεί πολλά στη λειτουργική γονιδιωματική. Παρουσιάζουμε το MAGeCK-VISPR, έναν ολοκληρωμένο έλεγχο ποιότητας (QC), ανάλυση και ροή εργασίας οπτικοποίησης για οθόνες CRISPR. Το MAGeCK-VISPR καθορίζει μια σειρά μέτρων QC για την αξιολόγηση της ποιότητας ενός πειράματος και περιλαμβάνει έναν αλγόριθμο μέγιστης πιθανότητας να καλέσει ταυτόχρονα βασικά γονίδια υπό πολλαπλές συνθήκες. Ο αλγόριθμος χρησιμοποιεί ένα γενικευμένο γραμμικό μοντέλο για την αποσυμπίεση διαφορετικών αποτελεσμάτων και χρησιμοποιεί τη μεγιστοποίηση προσδοκιών για να εκτιμήσει επαναληπτικά την αποτελεσματικότητα του νοκ-άουτ sgRNA και την ουσιώδη γονίδιο. Το MAGeCK-VISPR περιλαμβάνει επίσης το VISPR, ένα πλαίσιο για τη διαδραστική απεικόνιση και διερεύνηση των αποτελεσμάτων QC και ανάλυσης. Το MAGeCK-VISPR διατίθεται ελεύθερα στη διεύθυνση http://bitbucket.org/liulab/mageck-vispr.


Ιστορικό

Η ξηρασία είναι ένας από τους πιο σκληρούς περιβαλλοντικούς παράγοντες που περιορίζουν την ανάπτυξη, την ανάπτυξη και την επιβίωση των φυτών [1]. Λόγω της υπερθέρμανσης του πλανήτη, η ξηρασία έχει γίνει ένα ζήτημα που απαιτεί επείγουσα λύση στη γεωργική παραγωγή [2]. Ντομάτα (Solanum lycopersicum) είναι μια σημαντική καλλιέργεια λαχανικών που καλλιεργείται σε όλο τον κόσμο, αλλά οι πιο οικονομικές ποικιλίες της είναι ιδιαίτερα ευαίσθητες στην ξηρασία [3, 4]. Έτσι, μια πιο εις βάθος διερεύνηση των ρυθμιστικών μηχανισμών ανοχής των φυτών τομάτας στην ξηρασία είναι η πιο ελκυστική και εφικτή επιλογή για την ανακούφιση της απώλειας σε περιβάλλοντα που πλήττονται από την ξηρασία.

Έχει εντοπιστεί μια σειρά φυσιολογικών και βιοχημικών οδών, που εμπλέκονται ή επηρεάζονται από το στρες ξηρασίας [5]. Οι δυσμενείς περιβαλλοντικές συνθήκες επηρεάζουν σοβαρά τα φυτά κυρίως λόγω της υπερβολικής συσσώρευσης αντιδραστικών ειδών οξυγόνου (ROS) [6]. Τα αντιοξειδωτικά ένζυμα συμπεριλαμβανομένης της ασκορβικής υπεροξειδάσης (APX), της υπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD), της υπεροξειδάσης (POD) και της καταλάσης (CAT), παίζουν κρίσιμο ρόλο στην αντιμετώπιση της συνεχούς παραγωγής ROS [7, 8]. Η διαρροή ηλεκτρολυτών και η συσσώρευση μαλονδιαλδεhyδης (MDA) μπορεί να υποδηλώνουν βλάβη της κυτταρικής μεμβράνης από το στρες ξηρασίας [9].

Μη εκφραστής του σχετιζόμενου με την παθογένεια γονιδίου 1 (NPR1, επίσης γνωστός ως NIM1), ένας ειδικός υποδοχέας του σαλικυλικού οξέος (SA), θεωρείται ως αναπόσπαστο μέρος της συστημικής επίκτητης αντίστασης (SAR) [10]. Το NPR1 είναι μια συντηρημένη πρωτεΐνη με Broad-Complex, Tramtrack και Bric-a-brac/poxvirus και domain ψευδάργυρου (BTB/POZ) και τομέα επανάληψης Ankyrin, αμφότερες από τις οποίες είναι απαραίτητες για αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-πρωτεΐνης και για τη δυνατότητα NPR1 να λειτουργεί ως συν-ενεργοποιητής [11]. Η φυλογενετική ανάλυση αποκάλυψε ότι υπάρχουν τρεις λειτουργικά διακριτές κλάδες της οικογένειας πρωτεϊνών που μοιάζουν με NPR1 [12]. Μέλη της κατηγορίας συμπεριλαμβανομένων των AtNPR1 και AtNPR2 συχνά συμμετέχουν θετικά στη ρύθμιση SAR [12, 13]. Ωστόσο, τα μέλη του clade συμπεριλαμβανομένων των AtNPR3 και AtNPR4 συνδέονται πάντα με αρνητικό κανονισμό SAR, αλλά απαιτούνται για την τοποθέτηση του SAR [14]. Επιπλέον, το AtBOP1 και το AtBOP2 που ανήκουν σε άλλο clade σχετίζονται με την ανάπτυξη πλευρικών οργάνων [15].

Προηγούμενες αναφορές το έδειξαν Arabidopsis thaliana NPR1 (AtNPR1) ρυθμίζει θετικά την απόκριση των φυτών στο βιοτικό στρες [16, 17]. Πριν από τη μόλυνση, η πρωτεΐνη NPR1 βρίσκεται σε οξειδωμένη ολιγομερή μορφή στο κυτταρόπλασμα [17]. Μόλις μολύνουν τα παθογόνα, η συσσώρευση SA οδηγεί σε αλλαγή του ενδοκυτταρικού οξειδοαναγωγικού δυναμικού, που επιτρέπει στο NPR1 να μετατοπιστεί στον πυρήνα και να αλληλεπιδράσει με τους παράγοντες μεταγραφής TGA-bZIP για να ενεργοποιήσει πολλαπλά γονίδια που σχετίζονται με την παθογένεση (PR) [18, 19]. Υπερβολική έκφραση του AtNPR1 ή τα ορθολόγια του ενισχύουν την αντοχή σε ασθένειες σε διαγονιδιακά Α. θαλιάνα [13], καρότα [20], εσπεριδοειδή [21], μήλα [22] και αμπέλια [23] φυτά. Ωστόσο, οι πληροφορίες σχετικά με την επίπτωση του NPR1 στην απόκριση των φυτών στο αβιοτικό στρες είναι ακόμα περιορισμένες [24]. Πρόσφατη αναφορά στο Α. θαλιάνα έχει δείξει ότι το AtNPR1 εμπλέκεται στο ψυχρό εγκλιματισμό μέσω αλληλεπίδρασης με παράγοντες HSFA1 [24]. Το μονοπάτι σηματοδότησης SA που εξαρτάται από το NPR1 είναι ζωτικής σημασίας για την ενίσχυση της ανοχής στο αλάτι και τις οξειδωτικές καταπονήσεις σε Α. θαλιάνα [25]. Ετερόλογη έκφραση του AtNPR1 στα φυτά καπνού μπορεί να ενισχύσει την ανοχή στο οξειδωτικό στρες [26]. Επιπλέον, ένα καταπιεσμένο MdNPR1 η μεταγραφή εμφανίζεται στα φύλλα μηλιών που έχουν υποστεί ξηρασία [27]. Αντίθετα, η υπερέκφραση του AtNPR1 στο ρύζι αποδεικνύεται ότι προσδίδει υπερευαισθησία στις καταπονήσεις άλατος και ξηρασίας [28]. Αυτά τα φαινομενικά αντιφατικά αποτελέσματα αμφισβητούν το ρόλο του NPR1 γονίδιο στη διαμεσολάβηση αντοχής στην ξηρασία των φυτών.

Η ντομάτα είναι μια πολύ δημοφιλής καλλιέργεια λόγω των μεγάλων θρεπτικών και εμπορικών αξιών της και χρησιμοποιείται συχνά για τη μελέτη της γονιδιακής λειτουργίας [29]. Έτσι, για να βελτιώσουμε περαιτέρω την κατανόηση της λειτουργίας του NPR1 στα φυτά, είναι απαραίτητο να χαρακτηριστεί SlNPR1Οι λειτουργίες του στην ανοχή των φυτών της τομάτας στην ξηρασία. Σε αυτή τη μελέτη, απομονωθήκαμε SlNPR1 από την ντομάτα ‘Ailsa Craig’, διερεύνησε το προφίλ έκφρασης της σε όλους τους ιστούς των φυτών και υπό συνθήκες ξηρασίας. Η συσσωρευμένη τακτικά διακεκομμένη σύντομη παλίνδρομη επανάληψη (CRISPR)/ CRISPR που σχετίζεται με την πρωτεΐνη-9 νουκλεάση (Cas9) έχει χρησιμοποιηθεί σε διάφορους τομείς έρευνας και εμπορικής ανάπτυξης στη βασική επιστήμη, την ιατρική και τη γεωργία λόγω της υψηλής απόδοσης, του χαμηλού κόστους, και σχεδιαστική ευελιξία [30]. Χρησιμοποιήσαμε ανάλυση βιοπληροφορικής για να προβλέψουμε τη λειτουργία του SlNPR1, και στη συνέχεια δημιούργησε το slnpr1 μεταλλάξεις που χρησιμοποιούν το σύστημα CRISPR/ Cas9. Επιπλέον, για να ανακαλύψουμε έναν πιθανό ρυθμιστικό μηχανισμό με τη μεσολάβηση SlNPR1, συγκρίναμε την ανοχή στην ξηρασία του slnpr1 μεταλλαγμένα (L16, L21 και L62) και φυτά άγριου τύπου (WT) σε φυσιολογικά και μοριακά επίπεδα, αναλύοντας το κλείσιμο των στομάτων, τη βλάβη της μεμβράνης, τις αντιοξειδωτικές-ενζυμικές δραστηριότητες και την γονιδιακή έκφραση που σχετίζεται με την ξηρασία. Αυτά τα αποτελέσματα παρέχουν πληροφορίες για τα υποκείμενα SlNPR1 ρυθμιστικός μηχανισμός μεσολάβησης ξηρασίας σε φυτά τομάτας.


Η Novartis εστιάζει στη βελτίωση του ελέγχου PARKIN

Την περασμένη εβδομάδα, καθώς όλοι προετοιμάζονταν για τις γιορτές των Χριστουγέννων, οι ερευνητές της φαρμακευτικής εταιρείας Novartis δημοσίευσαν νέα έρευνα για ένα γονίδιο που σχετίζεται με τον Πάρκινσον ’, που ονομάζεται PARKIN (ή PARK2).

Χρησιμοποίησαν μια νέα τεχνολογία επεξεργασίας γονιδίων – που ονομάζεται CRISPR – για να διεξαγάγουν μια μεγάλη μελέτη διαλογής για τον εντοπισμό πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην ενεργοποίηση του PARKIN.

Στη σημερινή ανάρτηση θα εξετάσουμε τι κάνει το PARKIN, θα αναθεωρήσουμε την έκθεση έρευνας και θα συζητήσουμε πώς αυτά τα αποτελέσματα θα μπορούσαν να είναι πολύ επωφελή για την κοινότητα του Πάρκινσον ’.

Όπως θα γνωρίζουν πολλοί άνθρωποι στην κοινότητα του Πάρκινσον, το 2017 αντιπροσώπευε την 200ή επέτειο από την πρώτη αναφορά της νόσου του Πάρκινσον από τον Τζέιμς Πάρκινσον.

Είναι επίσης η 20ή επέτειος από την ανακάλυψη της πρώτης γενετικής μετάλλαξης (ή παραλλαγής) που αυξάνει τον κίνδυνο εμφάνισης Parkinson’. Αυτή η γενετική παραλλαγή εμφανίζεται σε μια περιοχή του DNA (ένα γονίδιο) που ονομάζεται ‘alpha synuclein’. Ναι, η ίδια άλφα συνουκλεΐνη που φαίνεται να παίζει τόσο κρίσιμο ρόλο στο Parkinson’ (Κάντε κλικ εδώ για να διαβάσετε περισσότερα για την 20η επέτειο).

Το 2018, θα παρακολουθούμε την 20ή επέτειο της δεύτερης γενετικής παραλλαγής που σχετίζεται με το Πάρκινσον.

Αυτό το γονίδιο ονομάζεται PARKIN:

Τίτλος: Οι μεταλλάξεις στο γονίδιο parkin προκαλούν αυτοσωματικό υπολειπόμενο νεανικό παρκινσονισμό.
Συγγραφείς: Kitada T, Asakawa S, Hattori N, Matsumine H, Yamamura Y, Minoshima S, Yokochi M, Mizuno Y, Shimizu N
Εφημερίδα: Φύση. 1998 Απρ 9 392(6676):605-8
PMID: 9560156

Το 1998, Ιάπωνες ερευνητές δημοσίευσαν αυτήν την έκθεση βασισμένη σε 5 άτομα από 4 ιαπωνικές οικογένειες που επηρεάστηκαν από νεανική εμφάνιση Πάρκινσον ’. Στην οικογένεια 1, το προσβεβλημένο άτομο ήταν μια γυναίκα, 43 ετών, γεννημένη από γονείς πρώτης ξαδέλφης και τα δύο μικρότερα αδέρφια της είναι υγιή. Η κατάστασή της διαγνώστηκε στην εφηβεία της και μετά είχε προχωρήσει πολύ αργά. Η απάντησή της στο L-dopa ήταν πολύ θετική, αλλά η δυσκινησία που προκλήθηκε από την L-dopa ήταν συχνή. Στην οικογένεια 2-4, τα προσβεβλημένα άτομα (γεννημένα από μη συγγενείς γονείς) εμφάνισαν πολύ παρόμοια κλινικά χαρακτηριστικά με το άτομο στην οικογένεια 1. Η ηλικία έναρξης ήταν μεταξύ 18 και 27 ετών.

Χρησιμοποιώντας προηγούμενη έρευνα και διάφορες τεχνικές, οι ερευνητές μπόρεσαν να απομονώσουν γενετικές παραλλαγές που μοιράστηκαν μεταξύ των 5 προσβεβλημένων ατόμων. Τελικά περιόρισαν την αναζήτησή τους σε ένα τμήμα DNA που περιέχει 2.960 ζεύγη βάσεων, το οποίο κωδικοποίησε μια πρωτεΐνη 465 αμινοξέων.

Αποφάσισαν να ονομάσουν αυτήν την πρωτεΐνη PARKIN.

Πόσο από το Πάρκινσον είναι γενετικό;

Περίπου το 15% των ατόμων με νόσο του Πάρκινσον έχουν οικογενειακό ιστορικό της πάθησης - παππούς, θεία ή ξάδερφος.

Επί του παρόντος, περίπου το 10-20% των περιπτώσεων της νόσου του Πάρκινσον μπορεί να οφείλεται σε γενετικές παραλλαγές που συνεπάγονται υψηλότερο κίνδυνο εμφάνισης της πάθησης. Σε άτομα με «νεανική έναρξη» (διαγνωσμένη κάτω των 20 ετών) ή «πρώιμης έναρξης» νόσο του Πάρκινσον (διαγνωσμένη κάτω των 40 ετών), οι γενετικές παραλλαγές μπορεί να ευθύνονται για την πλειοψηφία των περιπτώσεων, ενώ σε μεταγενέστερες περιπτώσεις (& gt40 ετών ηλικία) η συχνότητα των γενετικών παραλλαγών είναι πιο μεταβλητή.

Για μια πολύ καλή επισκόπηση OPEN ACCESS για τη γενετική της νόσου του Πάρκινσον - κάντε κλικ εδώ.

Υπάρχουν σίγουρα περιοχές του DNA στις οποίες οι γενετικές παραλλαγές μπορούν να αυξήσουν τον κίνδυνο εμφάνισης της νόσου του Πάρκινσον.

Αυτές οι περιοχές αναφέρονται ως γονίδια PARK.

Τι είναι το PARK σολενες;

Αυτή τη στιγμή γνωρίζουμε 23 περιοχές του DNA που περιέχουν μεταλλάξεις που έχουν αιτιώδεις συσχετίσεις με το Πάρκινσον. Σε αυτές τις περιοχές δόθηκε το όνομα των γονιδίων PARK. Η περιοχή δεν αναφέρεται πάντα σε ένα συγκεκριμένο γονίδιο, για παράδειγμα στην περίπτωση του παλιού μας φίλου άλφα συνουκλεΐνη, υπάρχουν δύο περιοχές γονιδίων PARK στο τμήμα του DNA που ονομάζουμε άλφα συνουκλεΐνη. Επομένως, παρακαλώ μην σκεφτείτε κάθε γονίδιο PARK ως ένα συγκεκριμένο γονίδιο.

Επιπλέον, μπορεί να υπάρχουν πολλαπλές γενετικές παραλλαγές μέσα σε ένα γονίδιο PARK που μπορεί να συμπεράνει τον κίνδυνο ανάπτυξης της νόσου του Πάρκινσον. Ο αυξημένος κίνδυνος δεν είναι πάντα το αποτέλεσμα μιας συγκεκριμένης μετάλλαξης σε μια περιοχή γονιδίου PARK.

Το PARKIN αναφέρεται ως PARK2.

Πού στο γονίδιο PARKIN εντοπίζεται η μετάλλαξη;

Εδώ λοιπόν τα πράγματα γίνονται λίγο πιο περίπλοκα.

Δεν υπάρχει ούτε μία γενετική παραλλαγή που να σχετίζεται με το Πάρκινσον. Στην πραγματικότητα, υπάρχουν επί του παρόντος 10 κοινές μεταλλάξεις στο γονίδιο PARKIN που μπορούν να προκαλέσουν την πρώιμη εμφάνιση της νόσου του Πάρκινσον. Το PARKIN έχει επίσης συσχετιστεί με διαφορετικούς τύπους καρκίνου-υπάρχουν 13 παραλλαγές που σχετίζονται με τον καρκίνο. Σημαντικό, μόνο δύο από οι σχετικές παραλλαγές του Πάρκινσον σχετίζονται με αυξημένο κίνδυνο καρκίνου (είναι R24P και R275W - κόκκινες+μαύρες κεφαλές βέλους στην παρακάτω εικόνα).

Σύγκριση μεταλλάξεων που σχετίζονται με το PARK2 Cancer και PD. Πηγή: Φύση

Επομένως, είναι σημαντικό να γνωρίζετε ακριβώς πού βρίσκεται η μετάλλαξή σας, εάν στην πραγματικότητα έχετε. Και αν έχετε τη μετάλλαξη R24P και R275W, δεν σημαίνει απαραίτητα ότι θα πάθετε συγκεκριμένο καρκίνο. Σημαίνει απλώς ότι είστε λίγο πιο προδιατεθειμένοι σε αυτό. Είναι καλό λοιπόν να το γνωρίζετε και να κάνετε τακτικούς ελέγχους.

Και τι κάνει το PARKIN;

Η πρωτεΐνη PARKIN έχει πολλές λειτουργίες μέσα σε ένα κύτταρο. Αλλά θεωρείται πρωτίστως ένα Ε3 ουμπικουιτίνη λιγάση – αυτό είναι ένα από τα πολλά ένζυμα που εμπλέκονται σε μια διαδικασία που ονομάζεται πανταχού παρούσα.

Τι είναι η πανταχού παρούσα;

Η ουβικιτίνη είναι μια μικρή πρωτεΐνη που, όπως υποδηλώνει το όνομα, είναι πανταχού παρούσα σε όλα τα κύτταρα και επηρεάζει όλες τις πτυχές της κυτταρικής βιολογίας. Ένζυμα όπως το PARKIN συνδέουν την ουβικιτίνη σε συγκεκριμένες πρωτεΐνες (η πρωτεΐνη περνάει από τη διαδικασία της ουβικιτίνης) και αυτό έχει διαφορετικά αποτελέσματα σε αυτήν την πρωτεΐνη. Η ουβικουιτίνη μπορεί να προκαλέσει τη μετακίνηση μιας πρωτεΐνης σε διαφορετική κυτταρική θέση ή να επηρεάσει το επίπεδο δραστηριότητας αυτής της πρωτεΐνης και μπορεί ακόμη και να προωθήσει ή να αποτρέψει ορισμένες αλληλεπιδράσεις μεταξύ διαφορετικών πρωτεϊνών.

Αλλά η πιο μελετημένη διαδικασία που σχετίζεται με την πανταχού παρουσία είναι η σήμανση συγκεκριμένων πρωτεϊνών προς απόρριψη. Μια πρωτεΐνη επισημασμένη με ubiquitin με έναν συγκεκριμένο τρόπο θα αποσταλεί για διάθεση και θα διασπαστεί σε μια δομή που ονομάζεται Πρωτεασώμα:

Το PARKIN συμμετέχει στο βήμα Ubiquitin-E3. Πηγή: 2bscientific

Για μια πιο εμπεριστατωμένη εξήγηση του μονοπατιού Ubiquitin Proteasome, παρακαλούμε δείτε αυτό το βίντεο που παρέχεται από το Scottish Enterprise:

Εντάξει, αλλά είπατε ότι η πρωτεΐνη PARKIN έχει πολλές λειτουργίες. Τι άλλο κάνει;

Συμμετέχει επίσης στη διαδικασία απόρριψης παλαιών ή δυσλειτουργικών μιτοχόνδρια.

M itochondria – που μπορείτε να θυμηθείτε από προηγούμενες αναρτήσεις SoPD – είναι οι σταθμοί ισχύος κάθε κυψέλης. Βοηθούν στο να διατηρούνται τα φώτα αναμμένα. Χωρίς αυτούς, το πάρτι τελείωσε και το κελί πεθαίνει.

Τα μιτοχόνδρια και η θέση τους στο κελί. Πηγή: NCBI

Mayσως θυμάστε από το μάθημα βιολογίας του λυκείου ότι τα μιτοχόνδρια είναι μικροσκοπικά αντικείμενα σε σχήμα φασολιού μέσα στο κύτταρο. Μετατρέπουν τα θρεπτικά συστατικά από τα τρόφιμα σε Τριφωσφορική αδενοσίνη (ή ATP). Το ATP είναι το καύσιμο με το οποίο λειτουργούν τα κύτταρα. Δεδομένου του κρίσιμου ρόλου τους στον ενεργειακό εφοδιασμό, τα μιτοχόνδρια είναι άφθονα (ορισμένα κύτταρα έχουν χιλιάδες) και είναι πολύ οργανωμένα μέσα στο κύτταρο, μεταφέροντάς τα όπου χρειάζονται.

Όπως εσύ, εγώ και όλα τα άλλα πράγματα στη ζωή, ωστόσο, τα μιτοχόνδρια έχουν ημερομηνία λήξης.

Καθώς τα μιτοχόνδρια γερνούν και φθείρονται (ή καταστρέφονται) με τον καιρό, το κύτταρο θα τα ανακυκλώσει μέσω μιας διαδικασίας που ονομάζεται μιτοφαγία (συνδυασμός λέξεων μιτοχόνδρια και αυτοφαγία – το σύστημα διάθεσης απορριμμάτων κάθε κυψέλης).

Το PARKIN παίζει σημαντικό ρόλο στη μιτοφαγία.

Τι κάνει το PARKIN στη Mitophagy;

ΠΑΡΚΙΝ αλληλεπιδρά με μια άλλη πρωτεΐνη που σχετίζεται με το Πάρκινσον ’ που ονομάζεται ΡΟΖ1.

Το PINK1 δρα σαν ένα είδος λαβής στην επιφάνεια των μιτοχονδρίων. Σε κανονικά, υγιή μιτοχόνδρια, η πρωτεΐνη PINK1 προσκολλάται στην επιφάνεια των μιτοχονδρίων και απορροφάται αργά μέχρι να εξαφανιστεί εντελώς από την επιφάνεια και να υποβαθμιστεί. Στα ανθυγιεινά μιτοχόνδρια, ωστόσο, αυτή η διαδικασία αναστέλλεται και το PINK1 αρχίζει να συσσωρεύεται στην εξωτερική επιφάνεια των μιτοχονδρίων.

Πολλές λαβές βγαίνουν από την επιφάνεια των μιτοχονδρίων.

Τώρα, εάν το PINK1 είναι μια λαβή, τότε το PARKIN είναι η σημαία που του αρέσει να κρατάει στη λαβή PINK1. Ενώ εκτίθεται στην επιφάνεια των μιτοχονδρίων, το PINK1 αρχίζει να αρπάζει την πρωτεΐνη PARKIN. Αυτό το ζευγάρωμα (μαζί με ένα κομμάτι πανταχού παρόντος) είναι ένα σήμα προς το κύτταρο ότι το συγκεκριμένο μιτοχόνδριο (ενικό) δεν είναι υγιές και πρέπει να αφαιρεθεί.

Pink1 και Parkin σε κανονικές (δεξιά) και ανθυγιεινές (αριστερές) καταστάσεις. Πηγή: Hindawi

Ελλείψει κανονικών πρωτεϊνών PINK1 ή PARKIN, δεν υπάρχει σύστημα σημαίας λαβής και τα άρρωστα/κατεστραμμένα μιτοχόνδρια αρχίζουν να συσσωρεύονται. Δεν απορρίπτονται κατάλληλα και ως αποτέλεσμα το κύτταρο αρρωσταίνει και τελικά πεθαίνει.

Εκτός από τη μιτοφαγία, το PARKIN μπορεί επίσης να λειτουργήσει ως πρωτεΐνη καταστολής όγκων, πράγμα που σημαίνει ότι εμποδίζει τα κύτταρα να αναπτυχθούν και να διαιρεθούν πολύ γρήγορα ή ανεξέλεγκτα (Κάντε κλικ εδώ για να διαβάσετε περισσότερα σχετικά με αυτό). Και το PARKIN μπορεί επίσης να ρυθμίσει την παροχή και την απελευθέρωση μικροσκοπικών σάκων νευροδιαβιβαστή (που ονομάζονται συναπτικά κυστίδια) από τα νευρικά κύτταρα (Κάντε κλικ εδώ για να διαβάσετε περισσότερα σχετικά με αυτό).

Πώς προκαλείται η μετάλλαξη PARKIN;

Η νεανική μορφή εμφάνισης του Πάρκινσον που σχετίζεται με το PARK2 ’s προκαλείται από ένα αυτοσωματική υπολειπόμενη μετάλλαξη - σημαίνει ότι ένα αντίγραφο της μετάλλαξης πρέπει να παρέχεται και από τους δύο γονείς για να αναπτυχθεί μια κατάσταση.

Αυτόματη υπολειπόμενη γενετική μεταφορά. Πηγή: Wikipedia

Εντάξει, τι είναι λοιπόν αυτή η έρευνα που δημοσίευσε πρόσφατα η Novartis;

Περιλαμβάνει μια νέα τεχνολογία γονιδιακής επεξεργασίας που ονομάζεται CRISPR.

Τι είναι το CRISPR;

Έχω γράψει στο παρελθόν μια μεγάλη ανάρτηση εξηγώντας την επιστήμη πίσω από το CRISPR (Κάντε κλικ εδώ για να διαβάσετε αυτήν την ανάρτηση).

Εν ολίγοις, ντολαμπερό Rσυνήθως Εγώnterpaced μικρόορτ Παλινδρομικό RΤα epeats (ή CRISPR) είναι μια σειρά από επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες (ακριβείς επαναλήψεις) DNA που βρέθηκαν σε συγκεκριμένα βακτήρια, τα οποία αποτελούν έναν αμυντικό μηχανισμό πρώτης γραμμής κατά της μόλυνσης από δυσάρεστες ιούς.

Κατά τη διάρκεια της μόλυνσης ενός βακτηρίου, ένας φάγος (ένας ιός που μολύνει τα βακτήρια) θα εγχύσει το DNA του στο κύτταρο. Αυτό το DNA θα αναγνωριστεί ως ξένο DNA από δύο πρωτεΐνες (που ονομάζονται Cas1 και Cas2) και θα το τεμαχίσουν σε μικρά κομμάτια τα οποία στη συνέχεια θα εισαχθούν στο βακτηριακό DNA (μια περιοχή που αναφέρεται ως τόπος CRISPR). Και μόλις ενσωματωθεί στο DNA, αυτός ο τόπος CRISPR μπορεί να μεταδοθεί σε οποιαδήποτε περαιτέρω κύτταρα, εάν αυτό το βακτήριο αποφασίσει να διαιρεθεί.

Οι περιοχές CRISPR του DNA μεταγράφονται τακτικά (δηλαδή η διαδικασία παραγωγής RNA). Το RNA για κάθε περιοχή αποστάτη καλείται crRNA (CRISPR-RNA), και είναι βασικά ένα μικρό μόριο RNA του οποίου η αλληλουχία ταιριάζει με μια περιοχή DNA φάγου. Αυτό το CRRNA στη συνέχεια συνδέεται με ένα άλλο κομμάτι RNA για να γίνει αυτό που ονομάζεται α tracrRNA.

Αυτό το tracrRNA στη συνέχεια ενώνεται με την πρωτεΐνη Cas9 και μαζί αρχίζουν να περιφέρονται γύρω από τα βακτήρια αναζητώντας τμήματα DNA για να ελέγξουν για το συγκεκριμένο crRNA. Σαν φύλακας που τριγυρνάει περιπολικά, ψάχνοντας για σημάδια προβλήματος σε μια φυλακή.

Πώς λειτουργεί το CRISPR στα βακτήρια. Πηγή: Sciencedirect

Περίμενε ένα λεπτό. Τι είναι το Cas9;

Cas9 (ή ντοRISPR όπως καικοινωνική πρωτεΐνη 9) είναι το σημαντικό κομμάτι του παζλ. Είναι η πρωτεΐνη που κάνει τα μαγικά.

Τι είναι η ενδονουκλεάση;

Όπως πρότεινα παραπάνω, η αντιγραφή του DNA δεν είναι ποτέ τέλεια και περιστασιακά υπάρχουν λάθη. Εκατομμύρια χρόνια εξέλιξης δημιούργησε ένα πολύ εξελιγμένο, αλλά εξαιρετικά αποτελεσματικό σύστημα παρακολούθησης του DNA εντός των κυττάρων. Πολλές διαφορετικές πρωτεΐνες εμπλέκονται σε αυτή τη διαδικασία και οι ενδονουκλεάσες παίζουν σημαντικό ρόλο.

Οι ενδονουκλεάσες είναι ένα ένζυμο που συνδέεται με το DNA και το κόβει. Είναι σημαντικό ότι λειτουργεί στη μέση της αλυσίδας του DNA, ενώ μια άλλη κατηγορία ενζύμων (που ονομάζονται εξωνουκλεάσες) λειτουργεί από το τέλος των αλυσίδων.

Άρα το Cas9 είναι ένα ένζυμο που μπορεί να κόψει το DNA στη μέση της αλυσίδας του DNA;

Ακριβώς. Και το κάνει αυτό με έναν πολύ στοχευμένο τρόπο, καθοδηγούμενος από κομμάτια RNA (το crRNA που αναφέρθηκε παραπάνω) που παράγονται από τις περιοχές CRISPR του βακτηριακού DNA. Το crRNA αναφέρεται τώρα συχνά ως «οδηγό RNA».

Η πρωτεΐνη Cas9 αλληλεπιδρά με το DNA. Πηγή: Stackexchange

Και εάν ένα συγκεκριμένο ένζυμο Cas9 ενώσει τις δυνάμεις του με ένα tracrRNA και στη συνέχεια βρει ένα αντίστοιχο κομμάτι DNA φάγου να επιπλέει μέσα στα βακτήρια, τότε τα βακτήρια θα γνωρίζουν ότι αυτός ο συγκεκριμένος τύπος φάγου το έχει μολύνει και το DNA του φάγου θα πρέπει να απορριφθεί το συντομότερο δυνατό Το Πρέπει να προσθέσω ότι αυτό δεν είναι μια συνειδητή διαδικασία για τα βακτήρια - είναι απλώς μια επίκτητη, αυτόματη ανοσοαπόκριση που βοηθά στην προστασία των βακτηρίων.

Είναι ενδιαφέρον ότι μόνο το 40% των προσδιοριζόμενων βακτηρίων και το 90% των αρχαιοτήτων (οργανισμοί μεμονωμένων κυττάρων που είναι ξεχωριστά από τα βακτήρια) διαθέτουν αυτό το σύστημα CRISPR-Cas9. Ο τρόπος με τον οποίο ο υπόλοιπος βακτηριακός κόσμος προστατεύεται από τους φάγους και άλλες βλάβες είναι ένας τομέας τεράστιων ερευνητικών προσπαθειών.

Ακούγεται ενδιαφέρον, αλλά πώς εφαρμόζεται αυτό στους ανθρώπους;

Πολύ πίσω στην παλιά εποχή (σκεφτείτε το 2013) δύο ερευνητικές εκθέσεις ανέφεραν επιτυχή χρήση του συστήματος CRISPR-Cas9 σε ανθρώπινα κύτταρα:


Τίτλος: Μηχανική πολλαπλού γονιδιώματος χρησιμοποιώντας συστήματα CRISPR/Cas.
Συγγραφείς: Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N, Hsu PD, Wu X, Jiang W, Marraffini LA, Zhang F.
Εφημερίδα: Επιστήμη. 2013 Φεβ 15339(6121):819-23.
PMID: 23287718 (Αυτό το άρθρο είναι ΑΝΟΙΚΤΗ ΠΡΟΣΒΑΣΗ αν θέλετε να το διαβάσετε)


Τίτλος: Μηχανική ανθρώπινου γονιδιώματος που καθοδηγείται από RNA μέσω του Cas9.
Συγγραφείς: Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE, Norville JE, Church GM.
Εφημερίδα: Επιστήμη. 2013 Φεβ 15339(6121):823-6.
PMID: 23287722 (Αυτό το άρθρο είναι ΑΝΟΙΚΤΗ ΠΡΟΣΒΑΣΗ αν θέλετε να το διαβάσετε)

Σε αυτές τις δύο ερευνητικές εκθέσεις, οι ερευνητές πήραν μια περιοχή CRISPR από δύο διαφορετικά βακτήρια Streptococcus thermophilus και Streptococcus pyogenes, και στη συνέχεια σχεδίασαν και εισήγαγαν αποστάτες/crRNA για ένα συγκεκριμένο ανθρώπινο γονίδιο σε αυτήν την περιοχή CRISPR. Στη συνέχεια, εισήγαγαν αυτήν την περιοχή CRISPR και την πρωτεΐνη Cas9 στα ανθρώπινα κύτταρα και παρακολούθησαν για να δουν τι θα συμβεί στο συγκεκριμένο γονίδιο.

Τα αποτελέσματα ήταν πολύ σαφή - είχαν αποδείξει πολύ ακριβή επεξεργασία ανθρώπινου DNA.

Και δεν είναι ψευδείς ειδήσεις να υπονοούμε ότι αυτά τα ευρήματα άλλαξαν κυριολεκτικά τον κόσμο.

Από το 2013, το CRISPR-Cas9 έχει γίνει ένα θέμα που συζητείται σε καθημερινή βάση σε εργαστήρια σε όλο τον κόσμο. Όλοι στη βιοϊατρική έρευνα προσπαθούν τώρα να ενσωματώσουν αυτήν την τεχνολογία σε κάποια πτυχή της εργασίας τους. Και η προσέγγιση έχει απλοποιηθεί πολύ: τώρα οι ερευνητές απλώς εισάγουν σε ένα κύτταρο την πρωτεΐνη Cas9 και συγκεκριμένα οδηγό RNA για το γονίδιο στόχο που θέλουν να μεταλλαχθούν και στη συνέχεια αφήνουν το κύτταρο να κάνει τα υπόλοιπα.

Και η τεχνολογία CRISPR-Cas9 έχει επίσης ανασχεδιαστεί με διάφορους τρόπους ώστε να επιτρέπεται η εισαγωγή εναλλακτικών λειτουργιών. Για παράδειγμα, η πρωτεΐνη Cas9 έχει ανασχεδιαστεί έτσι ώστε αντί να κόβει το DNA, η πρωτεΐνη Cas9 ενεργοποιεί τώρα αυτήν την περιοχή του DNA όπου κατευθύνεται ως το οδηγό RNA (Κάντε κλικ εδώ για να διαβάσετε περισσότερα για αυτό).

Πραγματικά δεν νομίζω ότι υπερβάλλω όταν γράφω ότι οι δυνατότητες της τεχνολογίας είναι πραγματικά απεριόριστος (Κάντε κλικ εδώ για να διαβάσετε διάφορα άρθρα OPEN ACCESS στο Cell press που τονίζουν αυτό το γεγονός). Ο μόνος παράγοντας που μας περιορίζει είναι η φαντασία μας.

Πώς μπορούμε λοιπόν να χρησιμοποιήσουμε αυτήν την τεχνολογία για το Parkinson’

Ενώ η παράδοση της τεχνολογίας CRISPR-Cas9 σε άτομα με Πάρκινσον είναι πολύ μακριά στο μέλλον (αν είναι δυνατόν), υπάρχουν ακόμα πολλοί τρόποι με τους οποίους η τεχνολογία μπορεί να εφαρμοστεί τώρα με ευεργετικά αποτελέσματα για την κοινότητα.

Και οι ερευνητές της φαρμακευτικής εταιρείας Novartis έδωσαν πρόσφατα ένα πολύ ωραίο παράδειγμα αυτού εντοπίζοντας θετικούς και αρνητικούς ρυθμιστές του γονιδίου PARKIN.

Ακολουθεί η ερευνητική τους έκθεση:


Τίτλος: Η οθόνη CRISPR σε γενετικό επίπεδο για τους ρυθμιστές PARKIN αποκαλύπτει τη μεταγραφική καταστολή ως καθοριστικό παράγοντα της μιτοφαγίας.
Συγγραφείς: Potting C, Crochemore C, Moretti F, Nigsch F, Schmidt I, Manneville C, Carbone W, Knehr J, DeJesus R, Lindeman A, Maher R, Russ C, McAllister G, Reece-Hoyes JS, Hoffman GR, Roma G, Müller M, Sailer AW, Helliwell SB.
Εφημερίδα: Proc Natl Acad Sci U S A. 2017 Δεκ. 21. pii: 201711023.
PMID: 29269392 (Αυτή η ερευνητική έκθεση είναι ΑΝΟΙΚΤΗ ΠΡΟΣΒΑΣΗ αν θέλετε να τη διαβάσετε)

Στη μελέτη τους, οι ερευνητές της Novartis κατασκεύασαν αρχικά ένα κύτταρο που παρήγαγε μια πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη κάθε φορά που ενεργοποιήθηκε το γονίδιο PARKIN. Στη συνέχεια εισήγαγαν την πρωτεΐνη Cas9 σε αυτά τα κύτταρα. Στη συνέχεια μόλυναν τα κύτταρα με μια μεγάλη δεξαμενή ιών – οι ιοί ήταν πανομοιότυποι εκτός από μια κρίσιμη διαφορά: κάθε ιός είχε ένα μοναδικό οδηγό RNA. Η μεγάλη δεξαμενή ιών είχε συλλογικά αρκετά guideRNA για να καλύψει 18.360 γονίδια (στην πραγματικότητα, υπήρχαν κατά μέσο όρο πέντε guideRNA για κάθε γονίδιο) –, δηλαδή πολλοί ιοί. ΤΕΡΑΣΤΙΑ ΠΙΣΙΝΑ!

Αφού μολύνθηκαν τα κύτταρα έτσι ώστε κάθε κύτταρο έλαβε μόνο έναν ιό, οι ερευνητές αύξησαν τα κύτταρα σε καλλιέργεια για 8 ημέρες και στη συνέχεια ταξινόμησαν τα κύτταρα με βάση το επίπεδο πράσινου φθορισμού τους. Όσο πιο πράσινο είναι το κελί, τόσο περισσότερη ενεργοποίηση PARKIN. Χωρίς πράσινο φθορισμό, χωρίς ενεργοποίηση PARKIN. Έκαναν επίσης αυτή την ανάλυση μετά από 15 ημέρες σε κυτταροκαλλιέργεια για να λάβουν υπόψη τις πιθανές εξαρτώμενες από το χρόνο αποτελέσματα της διαδικασίας CRISPR.

Τα κύτταρα που έφεραν το χαμηλότερο 25% και το υψηλότερο 25% του πράσινου φθορισμού αναλύθηκαν για να προσδιοριστεί ποια οδηγά RNA υπήρχαν στο κύτταρο. Αυτή η ανάλυση έδωσε τελικά στους ερευνητές μια λίστα με 53 θετικούς και αρνητικούς ρυθμιστές του PARKIN. Στην παρακάτω εικόνα μπορείτε να δείτε γονίδια που κατευθύνουν τους στόχους των RNA. Οι γραφικές παραστάσεις στα αριστερά ονόματα γονιδίων που όταν μεταλλάχθηκαν από το CRISPR-Cas9 είχαν ως αποτέλεσμα λιγότερη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (χωρίς ενεργοποίηση PARKIN) και οι γραφικές παραστάσεις στη δεξιά ονομασία εκείνων των γονιδίων που αύξησαν τα επίπεδα της πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (περισσότερη ενεργοποίηση PARKIN). Σημειώστε ότι το PARK2 (ή το PARKIN) υπάρχει και στα δύο γραφήματα στην αριστερή πλευρά, πράγμα που σημαίνει ότι εάν το PARKIN είναι μεταλλαγμένο, υπάρχει μικρότερη ενεργοποίηση του PARKIN.

Οι ερευνητές της Novartis εξέτασαν τρία γονίδια συγκεκριμένα – ΘΑΠ11, HCFC1, ή OGT – η οποία όταν μεταλλάχθηκε, είχε ως αποτέλεσμα περισσότερη πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (ή περισσότερη ενεργοποίηση PARKIN). Και τα τρία αυτά γονίδια ήταν παρόντα τόσο στην ανάλυση των 8 ημερών όσο και στην ανάλυση των 15 ημερών, υποδηλώνοντας ότι είναι αρνητικοί ρυθμιστές του PARKIN. Και δεδομένου ότι μια προηγούμενη μελέτη είχε πράγματι αναφέρει ότι η εξάντληση του THAP11 είχε ως αποτέλεσμα αυξημένα επίπεδα PARK2 (Κάντε κλικ εδώ για αυτήν την έκθεση), οι ερευνητές εστίασαν την προσοχή τους στο THAP11.

Οι ερευνητές άρχισαν να πειραματίζονται με διαφορετικούς τύπους κυττάρων (συμπεριλαμβανομένων των κυτταρικών σειρών του ανθρώπινου εγκεφάλου) και παρατήρησαν ότι ελλείψει THAP11, τα επίπεδα PARKIN αυξήθηκαν, όπως και τα επίπεδα της ουβικουϊτίνης που επεξεργάζεται η PARKIN. Στη συνέχεια προκάλεσαν μιτοχονδριακή βλάβη στα κύτταρα και διαπίστωσαν ότι τα επίπεδα PARKIN και τα επίπεδα ουβικιτίνης που επεξεργάζεται το PARKIN αυξήθηκαν σημαντικά σε σύγκριση με τα κύτταρα ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι ένα φάρμακο που αναστέλλει το THAP11 μπορεί να αντιπροσωπεύει μια νέα θεραπευτική προσέγγιση για την αύξηση των επιπέδων PARKIN σε μια κατάσταση όπως το Parkinson&# 8217s.

Τι σημαίνουν όλα αυτά;

Το Parkinson’ χαρακτηρίζεται από προβλήματα σε πολλές διαφορετικές βιολογικές οδούς, συμπεριλαμβανομένης της μιτοχονδριακής δυσλειτουργίας και της διάθεσης κυτταρικών αποβλήτων (αυτοφαγία). Φάρμακα που έχουν σχεδιαστεί για να ενεργοποιούν γονίδια που εμπλέκονται σε αυτές τις διαδικασίες θα μπορούσαν να αντιπροσωπεύουν πολύ χρήσιμα εργαλεία σε οποιαδήποτε μελλοντική θεραπεία του Πάρκινσον ’s.

Επιστήμονες στη φαρμακευτική εταιρεία Novartis δημοσίευσαν πρόσφατα έρευνα που περιγράφει τα αποτελέσματα μιας μαζικής μελέτης διαλογής που πραγματοποίησαν για τον εντοπισμό θετικών και αρνητικών ρυθμιστικών παραγόντων του γονιδίου PARKIN που σχετίζεται με το Πάρκινσον, το οποίο εμπλέκεται σε πτυχές της διάθεσης απορριμμάτων και της διατήρησης υγιών μιτοχονδρίων. Τα αποτελέσματά τους παρέχουν δύο σημαντικές πληροφορίες:

  1. Απόδειξη αρχής ότι τέτοιες μελέτες προσυμπτωματικού ελέγχου μπορούν να παρέχουν ενδιαφέρουσες πληροφορίες, και
  2. Μια λίστα με πολύ ενδιαφέροντες στόχους για να σχεδιάσουν αναστολείς για τους οποίους μπορεί να δοκιμαστεί σε μοντέλα Parkinson’s

Θα είναι πολύ ενδιαφέρον να δούμε τη συνέχεια της έρευνας αυτής της μελέτης (ελπίζουμε το 2018, καθώς θα έχουν κατοχυρώσει διπλώματα ευρεσιτεχνίας για όλους τους ενδιαφέροντες στόχους που παρουσιάζονται εδώ, χωρίς αμφιβολία). Όπως ανέφερα παραπάνω, το PARKIN ασχολείται επίσης με τον καρκίνο, οπότε υπάρχει τεράστιο κέρδος για φάρμακα που ρυθμίζουν αυτό το γονίδιο και εταιρείες όπως η Novartis θα το γνωρίζουν καλά και θα πιέζουν σκληρά προς αυτή την κατεύθυνση.

Αυτή η έρευνα αντιπροσωπεύει επίσης μια ισχυρή εφαρμογή της τεχνολογίας επεξεργασίας γονιδίων CRISPR-Cas9 για την κοινότητα του Πάρκινσον ’s, και έχω πολύ μικρή αμφιβολία ότι θα υπάρξουν πολύ περισσότερες τέτοιες έρευνες το 2018. Σε ορισμένες περιπτώσεις, αυτή η έρευνα ελπίζουμε ότι θα προσδιορίσει βιολογικές οδούς που θα μπορούσαν να στοχεύσουν με τα διαθέσιμα φάρμακα που θα μπορούσαν να επαναχρησιμοποιηθούν για το Πάρκινσον ’.

Πολλοί ενδιαφέροντες θεραπευτικοί στόχοι πρόκειται να εντοπιστούν. Παρακολουθήστε αυτόν τον χώρο.


Πρόσθεσε τα γονίδια για το μηχάνημα CRISPR σχεδόν αμέσως μετά τη δημιουργία κάθε εμβρύου μέσω εξωσωματικής γονιμοποίησης, αλλά αρκετοί ερευνητές που μελέτησαν προσεκτικά τη διαφάνεια προειδοποιούν ότι μπορεί να έχει κάνει την επεξεργασία του αφού το έμβρυο της Νανά είχε ήδη περάσει από το μονοκύτταρο στάδιο. Αυτό σημαίνει ότι θα μπορούσε να είναι ένα γενετικό «μωσαϊκό» που έχει κάποια ανεπηρέαστα κύτταρα με φυσιολογικά CCR5- και τελικά μπορεί να μην έχει προστασία από τον ιό HIV.

Ο ανοσολόγος Philip Murphy βοήθησε να ανακαλυφθεί ο ρόλος του CCR5 στη μόλυνση από τον ιό HIV το 1996 και δημοσίευσε πρώιμες μελέτες που δείχνουν πώς η μετάλλαξη ζεύγους 32 βάσεων αποδίδει αντίσταση στον HIV. Ο Murphy, του Εθνικού Ινστιτούτου Αλλεργιών και Λοιμωδών Νοσημάτων στο Bethesda του Μέριλαντ, προειδοποιεί ότι οι επεξεργασίες του He's CRISPR σε οποιοδήποτε κορίτσι θα μπορούσαν να προκαλέσουν βλάβη παράγοντας μια τροποποιημένη πρωτεΐνη με απρόβλεπτες λειτουργίες. "Αυτή είναι μια πιθανή επιπλοκή της επεξεργασίας που λαμβάνει πολύ λιγότερη προσοχή από τις πιθανές επεξεργασίες και εφέ εκτός στόχου", λέει ο Murphy.

Η πρωτεΐνη CCR5 λειτουργεί φυσικά ως υποδοχέας για χημειοκίνες, οι οποίες είναι αγγελιοφόροι του ανοσοποιητικού συστήματος, αλλά ο ακριβής αντίκτυπος της πρωτεΐνης παραμένει μυστηριώδης. Ο Μέρφι, σε πείραμα ποντικών που δημοσίευσε το 2005, έδειξε ότι το CCR5 προάγει τη διακίνηση σημαντικών ανοσοκυττάρων στον εγκέφαλο κατά τη διάρκεια της μόλυνσης από τον ιό του Δυτικού Νείλου. Αργότερα το βρήκε CCR5Δ32 οι ομόζυγοι άνθρωποι που μολύνονται με αυτόν τον ιό είναι πιο επιρρεπείς σε σοβαρή εγκεφαλίτιδα και ακόμη και θάνατο από άλλους ανθρώπους. Κάποιες μελέτες σε ποντίκια και ανθρώπους έχουν επίσης βρει αυτό CCR5Δ32 Οι ομοζυγωτές εμφανίζουν πιο σοβαρά συμπτώματα από τον ιό της γρίπης, ωστόσο, άλλοι ερευνητές απορρίπτουν αυτήν την ανησυχία, επισημαίνοντας αντικρουόμενες επιδημιολογικές αναλύσεις.

Οι εξελικτικοί βιολόγοι έχουν αναρωτηθεί γιατί αυτή η μετάλλαξη έχει επιβιώσει στους πληθυσμούς της Βόρειας Ευρώπης - ουσιαστικά δεν υπάρχει στην Ανατολική Ασία - και ορισμένοι την έχουν συνδέσει με προηγούμενα πλεονεκτήματα επιβίωσης ενάντια σε μάστιγες όπως η βουβωνική πανώλη και η ευλογιά. Αλλά αυτά τα επιχειρήματα έχουν αποκτήσει μικρή απήχηση. «Όλες οι συσχετίσεις της νόσου CCR5 με εξαίρεση το HIV/AIDS χρειάζονται ουσιαστικά περισσότερη πειραματική υποστήριξη προτού κάποιος μπορέσει να μειώσει τους κινδύνους CCR5 μοντάζ με σιγουριά», λέει ο Murphy.

Σε μια προσπάθεια να καταλάβουμε καλύτερα αν CCR5Δ32 οι ομοζυγωτές υπέστησαν οποιαδήποτε βλάβη από τη μετάλλαξη, του Nielsen Φυσική Ιατρική Η μελέτη αναλύει την επιβίωση σε περίπου 400.000 άτομα από την καταγωγή του Ηνωμένου Βασιλείου που παρείχαν οικειοθελώς το DNA τους για τον προσδιορισμό της αλληλουχίας στη Βρετανική Βιοκοινοτική Τράπεζα. Η μελέτη διαπίστωσε ότι CCR5Δ32 Οι ομοζυγωτές είχαν περίπου 20% λιγότερες πιθανότητες από τον υπόλοιπο πληθυσμό να φτάσουν στην ηλικία των 76 ετών. «Τα πρώτα μωρά με γενετική επεξεργασία στον κόσμο« πιο πιθανό »να πεθάνουν μικρά», ένας τίτλος στο Ηνωμένο Βασίλειο ο Τηλεγράφος ανακοινώθηκε.

Αλλά οι άνθρωποι κατά μέσο όρο συμμετείχαν στη μελέτη σε ηλικία 56,5 ετών, επομένως—παρά τις προτάσεις των Τηλεγράφος ρεπορτάζ και πολλές άλλες ειδήσεις σε αξιόπιστες εκδόσεις—η μελέτη δεν λέει τίποτα για το εάν η μετάλλαξη επηρεάζει την επιβίωση των νέων ή των άνω των 76 ετών. Σε tweets, ο Nielsen τόνισε ότι η ομάδα του είχε επίσης «πολύ μεγάλα» εύρη σφαλμάτων, επειδή σχετικά λίγα CCR5Δ32 οι ομοζυγωτές στη μελέτη είχαν πεθάνει μέχρι τώρα. Επιπλέον, η Lulu σαφώς δεν είναι α CCR5Δ32 ομόζυγο, οπότε τα ευρήματα δεν ισχύουν για αυτήν. As for Nana, she doesn’t have the 32-base-pair mutation, and her Chinese genetic background means any changes to CCR5 might have a different impact, anyway.

The speculation about the twins’ enhanced brain functions has even shakier support. Researchers showed in 2016 that knocking out one or both CCR5s in mice enhances their memory and cognition. A subsequent study that crippled CCR5 in mice found that, compared with control animals, the mutants recovered from strokes more quickly and had improved motor and cognitive functions following traumatic brain injury. The later study, in the 21 February issue of Κύτταρο, also included an analysis of 68 stroke patients who had one copy of CCR5 with the HIV resistance mutation it concluded they had improved recovery, too. Extrapolating from this work, the MIT Technology Review headlined a story “China’s CRISPR twins might have had their brains inadvertently enhanced.”

Neurobiologist Alcino Silva of UC Los Angeles, a co-author of both mouse studies, says his team’s findings “strongly suggest that the CCR5 manipulation changed cognitive function,” but the researchers have seen both positive and negative effects. “It is unfortunate that there is the misperception that we know how to engineer ‘smarter’ babies,” Silva says—a point the MIT Technology Review article does underscore. He concludes it is “way too early” to conduct experiments like the one He did. “We do not know enough, and the consequences can be disastrous,” he says.

Or the editing of CCR5 in Lulu and Nana could have no detectable consequences at all. With no one providing updates on the health of the children, that outcome, perhaps the most likely one, may never be headline news.


Mammalian cells are constantly subjected to a variety of DNA damaging events that lead to the activation of DNA repair pathways. Understanding the molecular mechanisms of the DNA damage response allows the development of therapeutics which target elements of these pathways. Double-strand breaks (DSB) are particularly deleterious to cell viability and genome stability. Typically, DSB repair is studied using DNA damaging agents such as ionising irradiation or genotoxic drugs. These induce random lesions at non-predictive genome sites, where damage dosage is difficult to control. Such interventions are unsuitable for studying how different DNA damage recognition and repair pathways are invoked at specific DSB sites in relation to the local chromatin state. The RNA-guided Cas9 (CRISPR-associated protein 9) endonuclease enzyme is a powerful tool to mediate targeted genome alterations. Cas9-based genomic intervention is attained through DSB formation in the genomic area of interest. Here, we have harnessed the power to induce DSBs at defined quantities and locations across the human genome, using custom-designed promiscuous guide RNAs, based on in silico predictions. This was achieved using electroporation of recombinant Cas9-guide complex, which provides a generic, low-cost and rapid methodology for inducing controlled DNA damage in cell culture models.

One of the most critical processes for living organisms is to maintain genome integrity using DNA damage surveillance and repair mechanisms. These mechanisms prevent cells from progressing through cell division, which would propagate the defective genome to daughter cells [1]. If lesions are not repaired, mutations can accumulate, leading to cell senescence, ageing and the onset of disease, such as cancer.

Approximately 10� double-strand breaks (DSBs) occur per cell cycle in human cells [2,3]. DSBs are considered one of the most genotoxic types of DNA damage because both DNA strands are severed, and thus any error in correctly re-joining the broken ends may lead to insertions, translocations, deletions and chromosome fusions that further promote genome instability [4]. Multiple competing repair programmes exist in order to repair such lesions, including error-free (homologous recombination (HR)) and error-prone (non-homologous end joining (NHEJ), mismatch-mediated end joining (MMEJ)) pathways [4]. The choice of which repair pathway is invoked depends on the nature of the break, on the local chromatin context and on cell cycle stage. When the nature or level of DNA damage is beyond repair, apoptotic mechanisms are activated [5]. This apoptotic response is frequently exploited by cytotoxic drugs such as bleomycin or cisplatin, which induce severe aberrations within the DNA structure. Understanding the mechanisms involved in pathway choice for DSB repair is crucial to develop targeted therapeutic interventions in cancer cells, as, for example, is the case of poly-ADP ribose polymerase (PARP) inhibitors in Brca1-deficient cancers [6].

In order to study DSB response mechanisms, damage must first be induced. To date, this has largely been achieved using untargeted genotoxic drugs and/or irradiation. While this allows some definition of how DSB repair varies according to cell type, it does not allow interrogation of how repair is influenced by local chromatin states, which can alter upon damage [7]. More targeted approaches have also been developed for the study of DSBs, reliant upon the inducible expression of restriction endonucleases that sever the DNA helix at specific locations. These experimental systems encompass the use of Ppol [8], SceI [9] and AsiSI enzymes [10]�h of which cuts the DNA in different locations, and which may be introduced to cells either transiently, or via genomic incorporation of an inducible transgene. In particular, inducible expression of AsiSI using the DSB Inducible via AsiSI (DiVA) cell line has been instrumental in beginning to unpick the complexity of DNA repair pathway choice in different genomic contexts [10].

However, each of these systems only addresses a very limited selection of chromosome regions due to the requirement for specific restriction enzyme cut sites. SceI is a mega-nuclease with no endogenous recognition site in mammalian genomes, and thus its target sequence must be transgenically introduced into the desired location in the genome. Ppol has several recognition sites within ribosomal RNA repeats and thus only allows the study of the nucleolar DNA damage response. AsiSI is methylation-sensitive and cuts at non-methylated CpG-rich sequences, which are primarily located at promoters and enhancers [10]. There is an urgent need within the field to expand the toolbox to allow wider interrogation of DNA responses in different chromatin contexts, and𠅎qually importantly𠅍ifferent cell types.

Therefore, we wished to design a methodology to induce a tuneable number of DSBs in a broad range of genomic contexts. This can be used to probe the context specificity of DNA damage responses and pathway choice. Programmable endonucleases such as Transcription activator-like effector nucleases (TALENS) or Zinc finger nucleases (ZFNs), and CRISPR-Cas9, have all been widely used to allow DSB induction at arbitrary genomic loci. However, typically, these programmed approaches are designed to generate a single DSB at a single specific site for the purpose of gene targeting, with broader induction of DNA damage seen as a disadvantage [11,12,13,14,15]. Here, in contrast, we use electroporation of recombinant Cas9 and synthetic promiscuous guide RNAs to introduce multiple DSBs in mammalian cell culture, with both the number of breaks and the desired target context being tuneable (Figure 1A). This will allow us to assess the DNA damage response across a wide range of damage severity, at specified genomic locations, in any electroporatable cell type.


Challenges: Why Real Engagement on CRISPR Has Remained So Elusive

Regardless of any potential pitfalls, the mandate for public engagement is difficult to ignore. CRISPR is a prime example of postnormal science. Decision stakes are high, and margins of error are thin, especially once we cross the bright red line of editing the human germline and begin making edits heritable. At the same time, CRISPR raises a host of ethical, social, and regulatory conundrums that all introduce systems uncertainty that make it difficult to map the best paths forward.

This makes effective public engagement more important than ever before. Outside of the United States, increasing pressure to engage different publics on CRISPR has led to sporadic efforts, often funded or led by philanthropic organizations such as the United Kingdom’s Wellcome Trust. However, sporadic efforts likely will not be enough, and the question remains as to why increasing calls for action have not led to broader investment in sustainable infrastructures for public engagement, especially with an eye toward informing policy and rulemaking on technologies like CRISPR. We argue that at least three influences have slowed progress on this front and require attention from the scientific and policy-making community.

No One-Size-Fits-All Models: The Need for Systems Thinking.

Even if incentive systems and infrastructures were in place, a second challenge for scalable public engagement exercises remains: the absence of a single modality of engagement (Fig. 2) that can be deployed across intended outcomes and contexts. As a result, there are no blueprints with universal or even broad applicability. This does not mean, of course, that there are no commonalities. Public engagement efforts often share overlapping goals and, in many cases, try to adhere to the principles outlined in Fig. 2. But the concrete modalities employed by sponsors of public engagement exercises vary across at least five different dimensions: 1) intended outcomes, 2) (the stage of) the issue/controversy, 3) social and policy contexts, 4) intended participants/stakeholders, and 5) resources available.

Engagement exercises designed to create a consensus report on policy options, for instance, will require input from (and representation of) very different stakeholders than public engagement exercises with patient groups that are designed to cocreate agendas for developing CRISPR-based therapies. Similarly, engaging small groups of highly interested publics can help flag concerns or unintended outcomes early in the issue cycle. Those types of upstream initiatives, however, require a very different level of resources and attention to political context compared to public engagement later in the issue cycle, when visible public conflicts about values and other political considerations have already shaped the opinion landscape.

Designing effective public engagement, therefore, involves careful calibration along the five dimensions outlined above (and potentially more). Realistically, scientists and other sponsors of public engagement exercises have control over only some of the dimensions, such as timing, intended outcomes, or available resources. This makes it even more important to design public engagement exercises that are responsive—in both content and modality—to the realities of the policy environments, consumer concerns, or societal debates they are trying to inform. We thus need to apply integrated systems thinking (54) to improve our “science of public engagement.” Effective public engagement on CRISPR and other emerging genome editing technologies, in other words, will require sustained interdisciplinary collaborations across the social sciences and natural sciences to develop and evaluate modalities for public engagement that are responsive to stakeholder needs and designed to maximize intended outcomes.

The Need to Build Infrastructures and Incentive Structures for Scientists.

A second challenge involves incentive systems and infrastructures related to public engagement for scientists within academia, government, and the private sector. While industry scientists likely have a different balance between research and other responsibilities as compared to their academic colleagues, for example, there are no obvious incentives for either group to add public engagement to their existing workload. In fact, the absence of easy-to-follow blueprints for public engagement and the level of controversy that can surround engagement efforts (52) likely serve as disincentives for scientists worried about their personal careers. It is therefore both surprising and encouraging to see signs of a sea change.

In a recent large-scale census survey of science faculty at 73 colleges and universities within the US land-grant system, “a majority … indicated that pursuing public engagement activities is highly important to them, with younger science faculty … placing significantly higher importance on such activities” (55). The same survey, however, also showed very mixed perceptions of how valued public engagement and related activities were among colleagues and administrators at their university. Building both infrastructures for sustained public engagement and incentive structures for scientists to become active participants in these infrastructures is therefore in the self-interest of scientific institutions. Aside from achieving the goals for public engagement we discuss in Fig. 2, there may also be some collateral benefits from public engagement. As a report on a 2015 meeting at the University of Michigan on academic engagement in public and political discourse put it, “If academia does not embrace the opportunity represented by public engagement it runs the risk of losing the best and brightest young scholars who ‘want to make a difference’ through their work, further reducing diversity in its ranks” (56). Engagement, in other words, has to become part of the DNA of academic institutions.

Even if an openness to engage with public stakeholders were to become more prevalent among the scientific community, there are few existing mechanisms that scientists can easily leverage to get such efforts off the ground. This problem is further exacerbated by the fact that COVID-19 has made it impossible for scientists to utilize the face-to-face mechanisms that are in place in the foreseeable future. Building infrastructure—both offline and online—is therefore imperative. And models for doing this do exist. Anticipating a need for both academic and societal infrastructures to foster broader societal debates about emerging technologies, the US NSF funded two large collaborative Centers for Nanotechnology in Society in 2005 to study the ethical, legal, economic, and policy implications of the relatively new, nature-altering science called nanotechnology.

Calling for a similar harnessing of the work of social scientists, ethicists, bench scientists, and other societal stakeholders to help guide societal responses to CRISPR, some scholars have proposed the idea of “a global observatory for gene editing, as a crucial step to determining how the potential of science can be better steered by the values and priorities of society. This would be an international network of scholars … dedicated to gathering information from dispersed sources, bringing to the fore perspectives that are often overlooked, and promoting exchange across disciplinary and cultural divides” (57). Regardless of the specific form that such interdisciplinary infrastructure-building efforts might take, they will be crucial for providing equitable, inclusive, and legitimate platforms for the broad conversations about CRISPR that we know are on the horizon.

Engagement “with Teeth?”

A final challenge relates to the degree to which engagement efforts can and should provide meaningful input into formal policy making. Philosophically, many (if not all) of the goals of public engagement we outline in Fig. 2 are based on at least an implicit assumption that there will be some feedback loop from each modality of public engagement to the decisions made by legislative bodies, or other rulemaking at the policy level. The tricky part with this assumption is that that there is little evidence to support it. This is not too surprising for at least two reasons.

First, many federal agencies—at least in the United States—are limited by law in the degree to which they can provide the public with formal opportunities to make decisions: “In general, agencies are not permitted to delegate their decision authority to the public, and creating a fair, legitimate, and inclusive process for empowerment beyond basic voting is complex and challenging” (58). Within these legal frameworks, advisory bodies like NIH’s Recombinant DNA Advisory Committee (RAC) for human genome editing trials have historically allowed for what could be called “passive” forms of engagement that provided opportunities to interested publics and stakeholders to overhear and provide public comment on parts of RAC meetings. Unfortunately, as the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine's consensus report on human genome editing put it, the RAC, “[i]n its current form … lacks scholarly expertise in public opinion or public engagement research, and is therefore not as well positioned to spearhead efforts to seek input from, or dialogues with, different communities of people at large who have an interest in the issue at hand” (9). Even with the Novel and Exceptional Technology and Research Advisory Committee that replaced the RAC as the “committee for advice and transparent discussions about the scientific, safety, ethical, and social issues associated with emerging biotechnologies” (59), that expertise, and therefore capacity constraints, remains in place.

Second, partly as a result of the constraints faced by federal agencies in integrating meaningful public engagement into their decision-making, some see federal bioethics commissions as a conduit between public views and the policy realm. Interestingly, both bench scientists and ethicists have questioned the ability of bioethics commissions to adequately represent public views. Biochemists Jennifer Doudna and Samuel H. Sternberg (60) call for a societal debate that goes beyond “researchers and bioethicists, but also [involves] a great range of stakeholders, including social scientists, policy-makers, faith leaders, regulators, and members of the public … [and] the conversation should begin immediately, before further applications of the technology thwar[t] any attempts to reign it in." Concerns about bioethics commissions being effective conduits for input from a broad range of publics are also raised by ethicists, who worry “that the structure of decision-making in those commissions means that the public is unlikely to have its values properly portrayed and, more problematically, the public cannot be portrayed as saying ‘no’” (61).

This is not to say that public engagement will or should replace policy making. But, in an ideal world, public policy on CRISPR should be responsive to the types of broad and inclusive engagement discussed in this essay. As John Holdren et al. (31) put it during the previous administration, “Public participation is important for promoting accountability, for improving decisions, for increasing trust, and for ensuring that officials have access to widely dispersed information.” As more and more CRISPR applications emerge in human, plant, and animal biology, one could envision a future in which regulation or even legislation explicitly responds to insights from public engagement efforts, even if it is just to outline reasons why they were not taken into account. Either way, future science policy should be informed at least as much by broad public engagement on CRISPR as it is informed by the science itself.


After the PTAB’s ruling, what next?

Although PTAB ruling may appear to have given the Broad Institute an outright win, the outlook is not quite so clear-cut. The battle over CRISPR-related IP rights looks far from over for various reasons.

First, UC Berkeley is weighing its decision to appeal the PTAB’s ruling. It remains convinced that “the Doudna/Charpentier team was the first group to invent this technology for use in all settings and all cell types, and was the first to publish and file patent applications directed toward that invention, and that the Broad Institute’s patents directed toward use of the CRISPR-Cas9 system in particular cell types are not patentably distinct from the Doudna/Charpentier invention.”

Second, various commentators consider it likely that the parties will eventually come to some sort of settlement involving the cross-licensing of their technology. Given unresolved issues of IP rights ownership of CRISPR vectors – which enable delivery of the mechanism to recipient DNA – this seems likely. “ If UC gets patent claims to CRISPR vectors granted, it would have rights to stop others from making, using, or selling them,” explains Phillip Webber, biotech patent attorney at the law firm Dehns in Oxford, UK. This would mean that even Editas Medicine, which holds an exclusive license to use Zhang’s CRISPR methods, would need to take a license from UC Berkeley.

Third, both the Broad Institute and UC Berkeley have filed and are defending patent applications in Europe. Catherine Coombes, a patent lawyer at HGF in New York notes in Φύση that European case law may bring about a different outcome from that of the PTAB. If the European Patent Office finds that UC Berkeley’s research provided “sufficient motivation”, for other researchers to try the CRISPR-Cas9 system in mammalian cells then UC Berkeley’s patent may be judged to cover applications in all cell types, giving it the edge over the Broad Institute’s patents in Europe.

And finally, many other research groups are also getting in on the CRISPR-Cas9 patenting game. According to IPStudies, a Swiss-based IP management consultancy, more than 900 patent families currently exist, all claiming rights on different aspects of CRISPR-Cas9 systems. As these groups assert their rights, and demand royalties, many more legal battles are likely to ensue both for the Broad Institute and UC Berkeley.

But while the courts continue to grapple with these issues, the science continues to advance. Researchers at the Broad Institute, again led by Feng Zhang, have already identified – and submitted a patent application for – an interesting alternative to Cas9 called Cpf1. This new enzyme offers scientists greater scope to edit the genes of certain bacteria. While no CRISPR-therapy yet exists, there is talk of a number of trials starting this year. So watch this space.

The WIPO Magazine is intended to help broaden public understanding of intellectual property and of WIPO’s work, and is not an official document of WIPO. The designations employed and the presentation of material throughout this publication do not imply the expression of any opinion whatsoever on the part of WIPO concerning the legal status of any country, territory or area or of its authorities, or concerning the delimitation of its frontiers or boundaries. This publication is not intended to reflect the views of the Member States or the WIPO Secretariat. The mention of specific companies or products of manufacturers does not imply that they are endorsed or recommended by WIPO in preference to others of a similar nature that are not mentioned.


Ιστορικό

CRISPR/Cas9 technology has enabled rapid genetic mutation in mammalian cells and the ability to conduct genome-wide screens using tailored lentiviral libraries [1,2,3,4,5,6,7,8,9]. The system consists of a sgRNA (single guide RNA) that directs the paradigm Cas9 nuclease from Streptococcus pyogenes to bind and cleave genomic DNA strands at the location corresponding to the guide sequence [10]. The resulting double strand cleavage triggers cellular repair mechanisms including non-homologous end-joining (NHEJ), which in the imperfect sense generates insertions or deletions (indel) mutations and associated nonsense transcripts. This technology makes pooled sgRNA libraries a powerful tool to perform genome-wide screens for both dominant and recessive genes. The resulting unique cellular subtypes generated are typically screened in pools for identifying hallmarks, i.e., survival or fluorescence reporter activation and guide distributions are then identified by next generation sequencing (NGS). Newer Cas9 technologies have also been developed to up- or down-regulate gene expression level, setting the stage for screens involving more subtle changes leading to desired phenotypic outputs [1, 11,12,13]. In addition, non-coding DNA is also rapidly becoming a popular target for such screens [14, 15].

In contrast to other methods such as near-haploid genetic screens where viral insertion sites must be determined by sequencing [16], the pooled library lentiviral-derived sgRNA sequences are pre-determined. Thus, guide sequences amplified from the genomic DNA of selected cells serve as a simple proxy to identify active genes or pathways in selected cells. However, as with other large scale technologies, the results of such screens are often primary next generation sequencing files, which unfortunately because of their size and format are unwieldy depots of information for bench scientists. Moreover, data processing, particularly from raw sequences to sgRNAs, often requires processing from different sources. An optimal solution is therefore to combine workflow steps into a single package. Here, we sought to create a complete CRISPR analysis software package with a simplified graphical workflow that can enable bench scientists to keep pace with large-scale data generation in by quickly processing NGS sequence files and generating graphical outputs with statistical representation. We demonstrate the power of ENCoRE to rapidly deliver results in a cell survival screen using Tumor Necrosis Factor-alpha (TNFa) challenge, which identified known members as well as two genes not yet implicated in the extrinsic apoptosis pathway, Smg7 και Ces2aΤο Further characterization of cell lines containing mutations in these genes shows that they lie predominantly in the extrinsic apoptosis pathway and are not generally protective against cell death stimuli. Both cell lines show an increase in p53 protein, consistent with an abrogated p53 pro-apoptotic signaling cascade, with Smg7 −/− cells showing the most substantial increase following TNFa treatment.


Download and print this article for your personal scholarly, research, and educational use.

Buy a single issue of Επιστήμη for just $15 USD.

Επιστήμη

Vol 343, Issue 6166
03 January 2014

Article Tools

Please log in to add an alert for this article.

By Ophir Shalem , Neville E. Sanjana , Ella Hartenian , Xi Shi , David A. Scott , Tarjei S. Mikkelsen , Dirk Heckl , Benjamin L. Ebert , David E. Root , John G. Doench , Feng Zhang

Επιστήμη 03 Jan 2014 : 84-87

Genome-editing technology allows improved positive or negative selection screens.


Δες το βίντεο: What is CRISPR? (Οκτώβριος 2022).