Πληροφορίες

Καθαρισμός γραμμικού πλασμιδίου μετά από πέψη περιορισμού;

Καθαρισμός γραμμικού πλασμιδίου μετά από πέψη περιορισμού;


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Εξέφρασα ένα διάνυσμα ζύμης στο E.coli και καθαρίστηκαν περίπου 13 μg αυτού. Στη συνέχεια το γραμμικοποίησα χρησιμοποιώντας ένα περιοριστικό ένζυμο και προσπάθησα να το καθαρίσω με γέλη. Το επιχείρησα δύο φορές. Το πήκτωμα έδειξε μια διαυγή φωτεινή λωρίδα στο σωστό σημείο, αλλά μετά τον καθαρισμό γέλης κατέληξα με μόνο 0,7 μg γραμμικού πλασμιδίου. Αμφιβάλλω ότι έκανα το ίδιο λάθος δύο φορές. Ποιος είναι ο καλύτερος τρόπος καθαρισμού ενός γραμμικού πλασμιδίου μετά την πέψη;

Επεξεργασία:

Το πλασμίδιο είναι περίπου 3,5 kb. Επωάζω μια ολονύκτια καλλιέργεια E. coli, μίνι -προετοιμάζω το επόμενο πρωί, εκλούεται σε νερό. Καταλήγω με 13μg DNA σε 200μl Η2Ο. Προσθέτω το PmeI (10μl) και το ρυθμιστικό CutSmart (23μl) από το NEB, επωάζω όλη τη νύχτα. Την επόμενη μέρα, τρέχω τα 230μl μέσω ενός τζελ 1% και παίρνω μια μονή ζώνη γύρω στα 3,5 kb. Αφαιρώ τη ζώνη και πραγματοποιώ καθαρισμό πηκτής χρησιμοποιώντας το κιτ Biobasic, προσθέτω μετουσιωτικό (πιθανώς υδροχλωρική γουανιδίνη), περιμένω 10 λεπτά μέχρι να διαλυθεί το τζελ, περάσω από τη στήλη, πλένω 2Χ με ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης με προσθήκη αιθανόλης, εκλούεται σε νερό.

Ευχαριστώ, Μαξ


Δεν μπορώ να πω ακριβώς τι πρόβλημα αντιμετωπίζετε, αλλά μπορείτε να ακολουθήσετε αυτά τα βήματα για αποτελεσματική περιοριστική πέψη και έκλουση.

  • Ποτέ μην δημιουργείτε μια αντίδραση πέψης με περισσότερο από 1 μg DNA ανά 20 μl. εάν χρειάζεστε περισσότερο DNA που έχει υποστεί πέψη, τότε ρυθμίστε πολλαπλές αντιδράσεις 20 μl με μέγιστο 1 μg DNA σε καθεμία (500-700 ng είναι το ιδανικό).
  • 10μl ένζυμο για αντίδραση 230μl: κακή ιδέα. Ρυθμίστε αντιδράσεις 10 × 20μl με όχι περισσότερο από 0.5μl ένζυμο ανά σωλήνα αντίδρασης.
  • Αποφύγετε τις ολονύκτια επωάσεις. Θα πρέπει να επαρκούν 4 ώρες (το NEB PmeI είναι 10 μονάδες/μl και 1 μονάδα είναι η ποσότητα που απαιτείται για τη διάσπαση 1 μg DNA σε 1 ώρα σε μια αντίδραση 50 μl. Προσθέτετε 5 μονάδες σε 20 μl. Η ολονύκτια επώαση είναι υπερβολική)
  • Απενεργοποιήστε το ένζυμο μετά την αντίδραση.
  • Απλώς τρέξτε λίγο δείγμα από έναν σωλήνα στο τζελ για να δείτε αν έχει συμβεί πέψη. Αφού επιβεβαιώσετε την πέψη, χρησιμοποιήστε απλώς το κιτ καθαρισμού PCR. Μπορείτε να λιώσετε τους σωλήνες σας.
  • Προαιρετικά: Εκλούστε σε Tris-Cl pH 7,5 αντί για νερό ή χρησιμοποιήστε ζεστό νερό (60⁰C).

Γιατί κάνω καθαρισμό με τζελ; μπορείτε απλά να χρησιμοποιήσετε ένα κιτ παρόμοιο με το κιτ εκχύλισης τζελ QIAGEN και να κάνετε καθαρισμό και έκλουση πλασμιδίου που δεν βασίζεται σε γέλη, χρησιμοποιώντας τα ρυθμιστικά διαλύματα που χρησιμοποιούνται ως συνήθως! Τα κιτ καθαρισμού DNA PCR θα κάνουν επίσης!


Καθαρισμός γραμμικού πλασμιδίου μετά από περιοριστική πέψη; - Βιολογία

Το απομονωμένο πλασμίδιο όταν είναι κυρίως σε υπερσπειρωμένη μορφή διευκολύνει τις περισσότερες κατάντη διαδικασίες, αλλά είναι απαραίτητο και για περιοριστική πέψη; Εάν υπάρχει λιγότερο υπερτυλιγμένο και περισσότερο σχισμένο κυκλικό ή γραμμικό πλασμίδιο, τότε επηρεάζει την αποτελεσματικότητα της επιμόλυνσης, πώς επηρεάζει την αποτελεσματικότητα της πέψης; Δεν θα χωνευτεί καθόλου; Αν αφομοιωθεί, μπορεί't να χρησιμοποιηθεί για σκοπούς κλωνοποίησης;

Τα περιοριστικά ένζυμα είναι τα πιο αποτελεσματικά στο λιγότερο δομημένο DNA. Και σε αντίθεση με το ανώτερο μήνυμα, υπάρχουν περιπτώσεις όπου το υπερτυλιγμένο DNA είναι πολύ λιγότερο ευαίσθητο στην πέψη, επειδή η δομή του DNA μπορεί να κρύβει τη θέση διάσπασης του περιοριστικού ενζύμου. Το NEB έχει δημιουργήσει έναν πίνακα που συγκρίνει την ενζυμική δραστηριότητα σε υπερτυλιγμένα πλασμίδια και σε γραμμικό λάμδα DNA:

Η πέψη με ένζυμα περιορισμού δεν επηρεάζεται εάν το DNA είναι υπερτυλιγμένο. Για μεγαλύτερη αποτελεσματικότητα, θερμαίνετε το DNA στους 94 ° C για 10 λεπτά για να σπάσει η υπερσπειρωμένη δομή

Τα ένζυμα περιορισμού είναι τα πιο αποτελεσματικά στο λιγότερο δομημένο DNA. Και σε αντίθεση με το ανώτερο μήνυμα, υπάρχουν περιπτώσεις όπου το υπερτυλιγμένο DNA είναι πολύ λιγότερο ευαίσθητο στην πέψη, επειδή η δομή του DNA μπορεί να κρύβει τη θέση διάσπασης του περιοριστικού ενζύμου. Το NEB έχει δημιουργήσει έναν πίνακα που συγκρίνει την ενζυμική δραστηριότητα σε υπερτυλιγμένα πλασμίδια και σε γραμμικό λάμδα DNA:

Ακόμα κι αν υποψιάζεστε την αποτελεσματικότητα της πέψης με ένζυμο, μπορείτε να γραμμικοποιήσετε το DNA και στη συνέχεια να αφομοιώσετε.

Αληθής. Συμφωνώ με τις παραπάνω απαντήσεις. Θα έλεγα ότι κατά τη διάρκεια της περιοριστικής πέψης, η συγκέντρωση του DNA έχει μεγαλύτερη σημασία από τη μορφή του προτύπου DNA που λαμβάνεται. Ανάλογα με τον τύπο του προτύπου DNA, η συγκέντρωση πρέπει να προσαρμοστεί για να αποκτήσει αποτελεσματικά προϊόντα πέψης. Ακόμα κι αν βρείτε κάποιο άπεπτο διάνυσμα στην κορυφή στο τζελ, (Στην περίπτωση υπερβολικά περιτυλιγμένου DNA ως πρότυπο), το απαιτούμενο χωνευμένο προϊόν (ζώνη που σας ενδιαφέρει) μπορεί να καθαριστεί με γέλη και μπορεί πολύ καλά να χρησιμοποιηθεί για σκοπούς κλωνοποίησης, Δουλεύει.

Γεια σου Tias, ο Ντομινίκ είναι σωστός όσον αφορά τις περιοριστικές πέψεις.

Όσον αφορά τις επιμόλυνσεις, το υπερσπειρωμένο DNA μετασχηματίζεται

100 φορές πιο αποτελεσματικά από το γραμμικό (το χαλαρό/παρατσούκλι είναι ενδιάμεσο). Αυτό οφείλεται στον αυξημένο χώρο που παίρνουν οι χαλαρές και γραμμικές μορφές, καθιστώντας πιο δύσκολο ένα φορτισμένο μόριο μέσω της λιπιδικής μεμβράνης. Ωστόσο, το γραμμικό DNA ενσωματώνεται


Χρήση πλασμιδίων για κλωνοποίηση

Μία από τις πιο κοινές τεχνικές που διατίθενται στους επιστήμονες που εργάζονται στη μοριακή βιολογία είναι η κλωνοποίηση. Σε αυτή την τεχνική, αλληλουχίες DNA που περιέχουν γονίδια ενδιαφέροντος εισάγονται σε φορείς που στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για την εισαγωγή αυτών των γονιδίων σε κύτταρα ή οργανισμούς για να μελετηθούν τα αποτελέσματα της έκφρασης των γονιδίων.

Οι φορείς βασίζονται σε βακτηριακά πλασμίδια - μικρά κυκλικά κομμάτια DNA χωρισμένα στο κύριο βακτηριακό χρωμόσωμα που μπορεί να μεταφερθεί μεταξύ βακτηρίων. Οι επιστήμονες προμηθεύονται φορείς πλασμιδίων από εταιρείες βιολογικού εφοδιασμού, οι οποίοι τα δημιουργούν συνδέοντας μεταξύ τους προϋπάρχοντα γονίδια και αλληλουχίες DNA που δημιουργήθηκαν από την αρχή χρησιμοποιώντας την τεχνολογία προσδιορισμού αλληλουχίας. Στο παρακάτω σχήμα παρουσιάζεται ένας χάρτης ενός παραδείγματος εμπορικού φορέα (το σύστημα pGEM-T Easy).

Σημειώστε ότι αυτός ο χάρτης δείχνει έναν αριθμό περιοχών που περιέχονται στο διάνυσμα. Οι αριθμοί αναφέρονται στο πόσα ζεύγη βάσεων κατά μήκος της ακολουθίας (σε σύνολο 3015) βρίσκεται μια συγκεκριμένη περιοχή.

Στο πείραμά μας, ο φορέας pGEM-T Easy είχε ένα σύντομο θραύσμα του γονιδίου για την πρωτεϊνική κινάση 1 (PLK1) που κλωνοποιήθηκε στη θέση εισαγωγής (βρίσκεται περίπου στις «3 η ώρα» αν φανταστείτε την εικόνα του διανύσματος να είναι όψη ρολογιού). Αυτό το τμήμα του γονιδίου κωδικοποιεί μια περιοχή της πρωτεΐνης που ονομάζεται περιοχή polobox, η οποία βοηθά στον εντοπισμό της πρωτεΐνης σε διάφορα σημεία κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου.

Πριν από το σημερινό έργο, αυτό το κλωνοποιημένο διάνυσμα χρησιμοποιήθηκε για μετασχηματισμό Ε. Coli κύτταρα. Τα κύτταρα χρησιμοποιήθηκαν για τον εμβολιασμό πλάκας άγαρ που περιείχε αμπικιλλίνη και οι πλάκες επωάστηκαν όλη τη νύχτα. Λόγω της παρουσίας του γονιδίου αντίστασης στην αμπικιλλίνη στον φορέα pGEM-T, τα μόνα κύτταρα που αναπτύχθηκαν σε αποικίες ήταν αυτά που είχαν μετασχηματιστεί από το πλασμίδιο. Αυτές οι αποικίες χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για τον εμβολιασμό ενός ζωμού καλλιέργειας, ο οποίος σας παρασχέθηκε.

Το παρασκεύασμα μίνι-πλασμιδίου αλκαλικής λύσης

Η χρήση μετασχηματισμένων βακτηρίων είναι ένα πολύ αποτελεσματικό μέσο για τη δημιουργία DNA που απαιτείται για την έρευνα. Τα βακτήρια έχουν ελάχιστες απαιτήσεις για τη διατροφή και έτσι η παραγωγή μεγάλων ποσοτήτων DNA μπορεί να γίνει γρήγορα και με ελάχιστο κόστος. Μόλις δημιουργηθεί μια καλλιέργεια μετασχηματισμένων κυττάρων, αυτή η καλλιέργεια μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη σπορά νέων καλλιεργειών, επομένως ο μετασχηματισμός χρειάζεται μόνο μία φορά. Ωστόσο, αφού έχουμε τον πολιτισμό μας, χρειαζόμαστε έναν τρόπο ανάκτησης του DNA σε σχετικά καθαρή μορφή.

Το DNA (συμπεριλαμβανομένου του πλασμιδικού DNA) δεν εκκρίνεται γενικά από τα κύτταρα. Για να το ανακτήσουμε, πρέπει να διαταράξουμε τα κύτταρα και στη συνέχεια να καθαρίσουμε το DNA που χρειαζόμαστε από τα άλλα κυτταρικά περιεχόμενα. Αυτός είναι ο σκοπός του παρασκευάσματος μίνι-πλασμιδίου αλκαλικής λύσης (ή μίνι-προετοιμασίας).

Το πρώτο στάδιο της μίνι προετοιμασίας περιλαμβάνει την έκρηξη των κυττάρων χρησιμοποιώντας ένα αλκαλικό διάλυμα. Αυτό απελευθερώνει το περιεχόμενό τους στο περιβάλλον υγρό. Στη συνέχεια προστίθεται ένα όξινο διάλυμα, το οποίο εξουδετερώνει το αλκαλικό διάλυμα και μετουσιώνει τις πρωτεΐνες, με αποτέλεσμα να γίνονται αδιάλυτες. Μπορούν να αφαιρεθούν από το κυτταρόλυμα μέσω φυγοκέντρησης (βλ. σχήμα παρακάτω).

Το δεύτερο στάδιο της μίνι προετοιμασίας περιλαμβάνει τη διέλευση του κυτταρικού λύματος μέσω μιας στήλης. Αυτές οι στήλες συνδέονται με το πλασμιδικό DNA και επιτρέπουν στο χρωμοσωμικό DNA και σε άλλα προϊόντα κυττάρων να περάσουν. Αφού πλύνουμε πολλές φορές τη στήλη, μπορούμε να κάνουμε τη στήλη να απελευθερώσει το πλασμιδικό DNA περνώντας μέσα από ένα διάλυμα έκλουσης (βλέπε σχήμα παρακάτω).

Ο περιορισμός χωνεύει

Μέχρι το τέλος της διαδικασίας μίνι προετοιμασίας, θα πρέπει να έχετε περίπου μία σταγόνα άχρωμου υγρού. Για να αποδείξετε ότι έχετε ανακτήσει το πλασμιδικό DNA, θα χρειαστεί να εκτελέσετε το δείγμα σε πηκτή ηλεκτροφόρησης. Ωστόσο, προτού το δείγμα σας είναι έτοιμο για εκτέλεση, πρέπει πρώτα να το προετοιμάσετε χρησιμοποιώντας ένα συμπέρασμα περιορισμού.

Το DNA του πλασμιδίου είναι κυκλικό. Για να αποδειχθεί το DNA σε μια γέλη, πρέπει να γραμμικοποιηθεί. Αυτό γίνεται με τη χρήση ενζύμων για την κοπή του DNA (σκεφτείτε να κόψετε μια λαστιχένια ταινία για να αποκτήσετε μια ευθεία λωρίδα καουτσούκ). Οι ενδονουκλεάσες περιορισμού είναι ένζυμα που κόβουν τον κλώνο του DNA σε πολύ συγκεκριμένες θέσεις, που κανονικά δίδονται από αλληλουχίες μισής ντουζίνας περίπου ζευγών βάσεων που ονομάζονται θέσεις περιορισμού. Εάν γνωρίζουμε την αλληλουχία ενός μήκους DNA, μπορούμε να επιλέξουμε ένζυμα που κόβουν το DNA μία φορά (δηλαδή η αλληλουχία της θέσης περιορισμού εμφανίζεται μία φορά σε ολόκληρη την αλληλουχία DNA) ή ακόμη και δύο φορές. Εάν ένα πλασμίδιο κοπεί δύο φορές, θα πρέπει να καταλήξετε με θραύσματα DNA δύο διαφορετικών μεγεθών. Οι μοριακοί βιολόγοι χρησιμοποιούν συχνά αυτό το διπλό κόψιμο για να «αφήσουν» ένα ένθετο που έχουν κλωνοποιηθεί σε ένα διάνυσμα.

Το διάνυσμα pGEM-T Easy έχει δημιουργηθεί με έναν αριθμό θέσεων περιορισμού και στις δύο πλευρές του σημείου εισαγωγής. Μερικές από αυτές τις θέσεις περιορισμού βρίσκονται μόνο στη μία πλευρά του σημείου εισαγωγής και έτσι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να γραμμικοποιήσουν το διάνυσμα για να είναι έτοιμο για ηλεκτροφόρηση. Άλλα βρίσκονται και στις δύο πλευρές, και έτσι μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να αφήσουν το ένθετο για να ελέγξουν το μέγεθός του. Σε αυτή την άσκηση, θα χρησιμοποιήσουμε το ένζυμο EcoRI το οποίο έχει περιοριστικές θέσεις ακριβώς ανάντη (πριν) και κατάντη (μετά) της θέσης εισαγωγής. Αυτό θα μας επιτρέψει να εγκαταλείψουμε το ένθετο polobox, με αποτέλεσμα το DNA δύο διαφορετικών μεγεθών: περίπου 3015 ζεύγη βάσεων μήκους για το φορέα και 800 ζεύγη βάσεων για το ένθετο. Τα δύο γραμμικοποιημένα θραύσματα είναι τώρα έτοιμα για επίδειξη με ηλεκτροφόρηση.

Περισσότερες πληροφορίες σχετικά με την πέψη περιορισμών μπορείτε να βρείτε εδώ.

Ηλεκτροφόρηση πηκτής αγαρόζης

Αν θέλαμε να ξεχωρίσουμε άμμο από χαλίκι από μεγαλύτερα βράχια, θα χρησιμοποιούσαμε μια σειρά από κόσκινα διαφορετικών μεγεθών. Κάθε κόσκινο μεγέθους αφήνει μικρότερα σωματίδια να περάσουν αλλά διατηρεί τα μεγαλύτερα θραύσματα. Η ηλεκτροφόρηση μπορεί να θεωρηθεί ως κόσκινο για μεγάλα μόρια όπως το DNA ή η πρωτεΐνη.

Στην ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης, ένα δείγμα DNA φορτώνεται προς το ένα άκρο ενός μπλοκ μιας ουσίας που μοιάζει με ζελέ που ονομάζεται αγαρόζη. Όταν ένα ηλεκτρικό ρεύμα διέρχεται μέσω της γέλης, τα μόρια DNA ωθούνται μέσω της γέλης μακριά από το αρνητικό ηλεκτρόδιο (το DNA έχει συνολικό αρνητικό φορτίο και τα παρόμοια φορτία απωθούνται). Μικρότερα θραύσματα DNA μπορούν να μετακινηθούν πιο εύκολα μέσα από το τζελ παρά μεγαλύτερα θραύσματα, έτσι σε μια δεδομένη χρονική περίοδο, DNA διαφορετικών μεγεθών συσσωρεύεται στις περιοχές της γέλης. Αν συμπεριλάβουμε μια βαφή που συνδέεται με το DNA, αυτές οι περιοχές είναι ορατές ως ζώνες - όσο πιο μακριά προς το θετικό ηλεκτρόδιο βρίσκεται μια ζώνη, τόσο μικρότερα είναι τα θραύσματα του DNA που βρίσκονται σε αυτήν τη ζώνη.

Για να έχουμε μια ιδέα για το μέγεθος μιας ταινίας που φαίνεται σε μια γέλη, τρέχουμε πάντα ένα δείγμα που αποτελείται από ένα μείγμα θραυσμάτων DNA γνωστών μεγεθών μαζί με τα δείγματα δοκιμής μας. Αυτό ονομάζεται δείκτης ή «σκάλα», καθώς οι πολλαπλές ζώνες DNA που φαίνονται στο τζελ μοιάζουν με τα σκαλοπάτια σε μια σκάλα. Αντιστοιχίζοντας τη θέση μιας ζώνης στο δείγμα δοκιμής μας με αυτά που αντιπροσωπεύουν DNA γνωστού μεγέθους στη σκάλα, μπορούμε να εκτιμήσουμε το μέγεθος των θραυσμάτων DNA στη δοκιμή μας. Το τμήμα του γονιδίου PLK1 που κωδικοποιεί τον τομέα polobox έχει μήκος 800 ζεύγη βάσεων (bp). Επομένως, εάν η πέψη μας ήταν επιτυχής, θα πρέπει να δούμε μια ζώνη που αντιστοιχεί στους δείκτες DNA μας, μήκους 800 ζευγών βάσεων που αντιπροσωπεύουν το ένθετο πόλο-κιβωτίου και μια άλλη που αντιπροσωπεύει τον φορέα pGEM-T μήκους 3000 ζευγών βάσεων.


Συμβουλές για κλωνοποίηση περιορισμών

Για πολλές εφαρμογές, η συμβατική κλωνοποίηση περιορισμού εξακολουθεί να είναι η καλύτερη μέθοδος. Μερικά απλά κόλπα θα σας βοηθήσουν να διασφαλίσετε ότι η κλωνοποίηση σας θα εξελιχθεί ομαλά.

  1. Πρώτα και κύρια, να είστε προσεκτικοί σε κάθε βήμα μιας διαδικασίας. Αυτή η προσέγγιση εξοικονομεί χρόνο μακροπρόθεσμα.
  2. Βεβαιωθείτε ότι το DNA είναι πολύ καθαρό. Ξεκινήστε με περίπου 2 μg DNA όταν προετοιμάζετε έναν φορέα ή αφαιρείτε ένα θραύσμα προς εισαγωγή.
  3. Μετά από κάθε ενζυματική αντίδραση, καθαρίστε το DNA με μια στήλη περιστροφής. Εκλούστε το DNA σε 40 - 45 μl 10 mM Tris (ρΗ 8,5) και στη συνέχεια πραγματοποιήστε την επόμενη αντίδραση. (Δεν χρειάζεται να χρησιμοποιήσετε μια στήλη περιστροφής πριν από τον καθαρισμό ενός θραύσματος DNA με ένα τζελ.)
  4. Για να μεγιστοποιήσετε την αποτελεσματικότητα, ελαχιστοποιήστε τον αριθμό των βημάτων σε μια διαδικασία. Για παράδειγμα, λειτουργεί καλύτερα η κλωνοποίηση ενός θραύσματος με αμβλύ άκρο σε μια αμβλεία θέση φορέα, όπως μια θέση SmaI, παρά σε μια περιοχή που έχει αμβλυθεί με πολυμεράση DNA Klenow ή Τ4.
  5. Σε περίπτωση αμφιβολίας, καθαρίστε ένα θραύσμα DNA με ένα τζελ. Το καθαρότερο αρχικό υλικό θα έχει καλύτερο αποτέλεσμα.

Το πιο κοινό πρόβλημα με την κλωνοποίηση περιορισμού είναι ότι το αρχικό διάνυσμα ανακτάται μετά τη διαδικασία. Αυτό το πρόβλημα έχει δύο αιτίες: ατελής πέψη του φορέα και επανασύνδεση του κομμένου φορέα με τον εαυτό του. Τα κόλπα που περιγράφονται παρακάτω θα ελαχιστοποιήσουν αυτά τα αποτελέσματα.

    Βεβαιωθείτε ότι η πέψη του φορέα έχει ολοκληρωθεί. Χρησιμοποιήστε περίσσεια ενζύμου περιορισμού (

20 U για 2 μg DNA), και πέψη για

Με το φορέα, βεβαιωθείτε ότι οι αντιδράσεις πέψης και φωσφατάσης ολοκληρώνονται. Αναδεύστε τα μείγματα καλά και επανειλημμένα και μην αφήσετε σταγονίδια υγρού να διαφύγουν από την ενζυμική επεξεργασία. Είναι καλή ιδέα να περιστρέψετε για λίγο μετά το στροβιλισμό για να βεβαιωθείτε ότι δεν έχουν μείνει σταγονίδια στο πλάι του σωλήνα.

Προετοιμασία του παρεμβαλλόμενου τεμαχίου

  1. Για την παρασκευή ενός εισαγόμενου θραύσματος, η ατελής πέψη δεν αποτελεί σοβαρή ανησυχία επειδή η μερική ανάκτηση του θραύσματος είναι αποδεκτή. Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε σχετικά σύντομους χρόνους πέψης και για διπλή πέψη, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε ένα ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης που δεν είναι βέλτιστο για ένα ή και τα δύο ένζυμα.
  2. Καθαρίστε το εισαγόμενο θραύσμα με ένα τζελ. Εκτός από την αφαίρεση του ανεπιθύμητου ή ατελώς χωνεμένου DNA, αυτή η διαδικασία αφαιρεί ένζυμα και μικρά μόρια. Κατά την απεικόνιση των ζωνών DNA με έναν διαυγαστήρα, μην χρησιμοποιείτε υπεριώδες φως μικρού μήκους κύματος 312 nm ή χαμηλότερο γιατί το DNA θα υποστεί σοβαρή βλάβη. Αντ' αυτού χρησιμοποιήστε υπεριώδη ακτινοβολία 360-365 nm.
  3. Εάν το εισαχθέν θραύσμα δημιουργήθηκε με PCR, καθαρίστε το με πηκτή ή στήλη περιστροφής πριν κάνετε οποιεσδήποτε περιοριστικές πέψεις. Εάν σκοπεύετε να κλωνοποιήσετε ένα τεμάχιο PCR με αμβλύ άκρο (που δημιουργήθηκε με πολυμεράση όπως το Pfu) σε φορέα που έχει υποστεί επεξεργασία με φωσφατάση, βεβαιωθείτε ότι οι εκκινητές σας PCR έχουν 5′-φωσφορικά άλατα.

Απολίνωση και Μεταμόρφωση

  1. Με έναν φορέα που έχει υποστεί επεξεργασία με φωσφατάση, πραγματοποιήστε μια απολίνωση ελέγχου στην οποία παραλείπεται το εισαγόμενο θραύσμα. Αυτή η απολίνωση ελέγχου θα πρέπει να αποφέρει πολύ λίγα μετασχηματισμένα κύτταρα επειδή μετασχηματίζονται μόνο κυκλικά μόρια DNA Ε. Coli αποτελεσματικά, και η εκ νέου κυκλοποίηση του φορέα δεν μπορεί να συμβεί χωρίς σύνδεση σε ένα φωσφορυλιωμένο θραύσμα.
  2. Εάν το DNA έχει μόνο κολλώδη άκρα, απολινώστε σε θερμοκρασία δωματίου για


Μοριακή κλωνοποίηση προϊόντων PCR: Περιορισμός οδηγός πέψης

Η κλωνοποίηση είναι μια πανταχού παρούσα τεχνική πολλαπλών σταδίων σε εργαστήρια μοριακής βιολογίας και περιλαμβάνει την εισαγωγή ενός γονιδίου στόχου (ένθεμα) σε έναν κυκλικό, δίκλωνο, αυτοαναπαραγόμενο σκελετό πλασμιδικού φορέα που φέρει ένα γονίδιο ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά (συνήθως αμπικιλλίνη ή καναμυκίνη). Το Αυτό καθίσταται δυνατή με περιοριστική πέψη, μια διαδικασία που διασφαλίζει ότι το γονίδιο στόχος και ο φορέας λήψης έχουν συμβατά άκρα. Μετά τη σύνδεση του γονιδίου στον φορέα, το προκύπτον ανασυνδυασμένο μόριο DNA εισάγεται μέσα Escherichia coli κύτταρα (μετασχηματισμός) και εφαρμόζεται πίεση αντιβιοτικών για την επιλογή των βακτηρίων που φέρουν το πλασμίδιο. Αυτά τα μετασχηματισμένα βακτήρια μπορούν στη συνέχεια να χρησιμοποιηθούν για να αναπαράγουν το ανασυνδυασμένο πλασμιδικό DNA (παρασκεύασμα πλασμιδίου). Σε άλλες περιπτώσεις, ο βακτηριακός κυτταρικός μηχανισμός μπορεί να κατευθυνθεί για να εκφράσει το γονίδιο στόχο και να συνθέσει την αντίστοιχη πρωτεΐνη του (πρωτεϊνική έκφραση).

Η κλωνοποίηση είναι μια πανταχού παρούσα τεχνική πολλαπλών σταδίων σε εργαστήρια μοριακής βιολογίας και περιλαμβάνει την εισαγωγή ενός γονιδίου στόχου (ένθεμα) σε έναν κυκλικό, δίκλωνο, αυτοαναπαραγόμενο σκελετό πλασμιδικού φορέα που φέρει ένα γονίδιο ανθεκτικότητας στα αντιβιοτικά (συνήθως αμπικιλλίνη ή καναμυκίνη). Το Αυτό καθίσταται δυνατή με περιοριστική πέψη, μια διαδικασία που διασφαλίζει ότι το γονίδιο στόχος και ο φορέας λήψης έχουν συμβατά άκρα. Μετά τη σύνδεση του γονιδίου στον φορέα, το προκύπτον ανασυνδυασμένο μόριο DNA εισάγεται μέσα Escherichia coli κύτταρα (μετασχηματισμός) και εφαρμόζεται πίεση αντιβιοτικών για την επιλογή των βακτηρίων που φέρουν το πλασμίδιο. Αυτά τα μετασχηματισμένα βακτήρια μπορούν στη συνέχεια να χρησιμοποιηθούν για να αναπαράγουν το ανασυνδυασμένο πλασμιδικό DNA (παρασκεύασμα πλασμιδίου). Σε άλλες περιπτώσεις, ο βακτηριακός κυτταρικός μηχανισμός μπορεί να κατευθυνθεί για να εκφράσει το γονίδιο στόχο και να συνθέσει την αντίστοιχη πρωτεΐνη του (πρωτεϊνική έκφραση).

Στην ακόλουθη σειρά αναρτήσεων, θα εξερευνήσω κάθε βήμα (ξεκινώντας από την πέψη περιορισμού) και θα συζητήσω συμβουλές για να εξασφαλίσω την επιτυχία και την ελάχιστη αντιμετώπιση προβλημάτων.

Περιορισμός της πέψης

1. Περιοριστικές ενδονουκλεάσες: Τα RE είναι βακτηριακά ένζυμα που αναγνωρίζουν σύντομες αλληλουχίες DNA (6-8 ζεύγη βάσεων) που ονομάζονται περιοριστικές θέσεις και διασπούν (αφομοιώνουν) δίκλωνο DNA σε αυτές τις θέσεις. Τα περισσότερα RE είναι παλινδρομικά: σαν τα γλωσσικά παλίνδρομα (Madam I'm Adam), αυτά τα ένζυμα διαβάζουν τις ίδιες αλληλουχίες και στους δύο κλώνους DNA στην κατεύθυνση 5' προς 3'. Ορισμένα ένζυμα δημιουργούν μονόκλωνες προεξοχές, που ονομάζονται επίσης κολλώδη ή συνεκτικά άκρα. Άλλα ένζυμα κόβουν κατευθείαν στη μέση μιας αλληλουχίας στόχου και δεν αφήνουν προεξοχές, αλλά αμβλεία ή ομοιόμορφα άκρα. Για σκοπούς κλωνοποίησης, οι ΑΠΕ που δημιουργούν κολλώδη άκρα χρησιμοποιούνται συχνότερα επειδή έχουν ως αποτέλεσμα πολύ υψηλότερη απόδοση κλωνοποίησης.

2. Μεθοδολογία: Για να προετοιμάσετε το ένθετο (π.χ. ένα προϊόν PCR) για κλωνοποίηση, κόβεται συχνότερα με δύο διαφορετικά RE και αυτά τα ίδια RE χρησιμοποιούνται για την πέψη του φορέα. Αυτό εγγυάται την παραγωγή μη συμβατών άκρων μέσα στο ίδιο μόριο, αναγκάζει το ένθετο να κλωνοποιηθεί προς μία κατεύθυνση (κατευθυντική κλωνοποίηση) και αποτρέπει την αυτο-πρόσδεση του φορέα. Από την άλλη πλευρά, επειδή το ένθετο και ο φορέας αφομοιώνονται με τα ίδια ένζυμα, δημιουργούνται συμβατές ουρές με ένθετο-φορέα. Αυτά τα άκρα μπορούν να ζευγαρώσουν βάσεων και αργότερα μπορούν να ενωθούν με λιγάση DNA, σχηματίζοντας έτσι ένα χιμαιρικό μόριο. Εάν το ένθετο αφομοιωθεί με ένα μόνο ένζυμο, τα ίδια άκρα θα δημιουργηθούν και στα δύο άκρα και ο στόχος μπορεί να εισαχθεί προς οποιαδήποτε κατεύθυνση. Τυχόν ληφθέντες κλώνοι θα πρέπει να ελεγχθούν για να διαπιστωθεί ότι ο προσανατολισμός του γονιδίου είναι σωστός. Ένας φορέας που έχει υποστεί πέψη μόνο με ένα ένζυμο θα πρέπει να αποφωσφορυλιωθεί για να αποτραπεί η αυτο-σύνδεση. Ένα διάνυσμα που συνδέεται από μόνο του θα μετατραπεί πιο αποτελεσματικά σε Ε. Coli και έτσι θα μειώσει την αποτελεσματικότητα της αντίδρασης κλωνοποίησης.

3. Συμβουλές για μια επιτυχημένη σύνοψη περιορισμών:

ένα. Εάν το ένθετό σας είναι προϊόν PCR, πιθανότατα θα προσθέσετε τις θέσεις περιορισμού στο άκρο 5 ’και των δύο εκκινητών PCR. Για να εξασφαλίσετε αποτελεσματική δέσμευση και πέψη, φροντίστε να συμπεριλάβετε έξι βάσεις μεταξύ της θέσης αναγνώρισης και του άκρου 5' του ασταριού. Θυμηθείτε να επιβεβαιώσετε ότι οι ιστότοποι περιορισμού που επιλέγετε δεν εμφανίζονται στο ένθετό σας!

σι. Βεβαιωθείτε ότι το DNA είναι απαλλαγμένο από ρύπους, όπως φαινόλη, χλωροφόρμιο, αιθανόλη και αλάτι. Εάν χρησιμοποιείτε προϊόν PCR, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε ένα κιτ καθαρισμού PCR. Εάν η αντίδρασή σας PCR δημιουργεί μια μη ειδική ζώνη, θα πρέπει να κόψετε τη ζώνη στόχου από το τζελ και να καθαρίσετε το προϊόν χρησιμοποιώντας ένα κιτ εξαγωγής πηκτής DNA.

ντο. Η ποσότητα ενζύμου που χρησιμοποιείται δεν πρέπει να υπερβαίνει το 10% του όγκου της αντίδρασης, επειδή η γλυκερόλη που μεταφέρεται από το ρυθμιστικό αποθήκευσης ενζύμου μπορεί να αναστείλει την αντίδραση.

ρε. Προσθέστε τα συστατικά της αντίδρασης με αυτή τη σειρά: ρυθμιστικό ενζύμου περιορισμού, νερό (το ένζυμο μπορεί να μετουσιωθεί εάν προστεθεί αμέσως μετά το συμπυκνωμένο ρυθμιστικό διάλυμα), DNA, ένζυμο.

μι. Κρατήστε το ένζυμο στον πάγο ή σε ένα μπλοκ ψύξης ενώ ρυθμίζετε την αντίδραση.

φά. Αναμίξτε τα συστατικά της αντίδρασης πιπερώνοντας απαλά το μίγμα της αντίδρασης πάνω και κάτω. Αποφύγετε τη δημιουργία φυσαλίδων αέρα επειδή το ένζυμο μπορεί να παγιδευτεί στη διεπαφή υγρού-αέρα και να μετουσιωθεί. Ακολουθήστε με μια γρήγορη περιστροφή σε μια μικροφυγόκεντρο. Μην στροβιλίζετε την αντίδραση.

σολ. Ελέγξτε την επιτυχία της αντίδρασης πέψης σας τρέχοντας το χωνεμένο έναντι του μη χωνεμένου προϊόντος δίπλα-δίπλα σε ένα τζελ αγαρόζης. Το NEBcutter είναι ένα χρήσιμο εργαλείο από το New England BioLabs που μπορεί να σας βοηθήσει να προβλέψετε το αποτέλεσμα μιας αντίδρασης πέψης.

η Τέλος, και πριν προχωρήσουμε σε απολίνωση, το RE που υπάρχει στην αντίδραση πρέπει να απενεργοποιηθεί. Διαφορετικά, οποιοδήποτε εναπομείναν ενεργό RE θα αφομοιώσει τυχόν συνδεδεμένα προϊόντα. Πολλά RE μπορούν να απενεργοποιηθούν με θερμότητα. Για όσους δεν μπορούν, συνιστάται ένα βήμα καθαρισμού με τζελ.

Το Quartzy είναι η Νο. 1 πλατφόρμα διαχείρισης εργαστηρίων στον κόσμο. Βοηθάμε τους επιστήμονες να οργανώνουν εύκολα παραγγελίες, να διαχειρίζονται αποθέματα και να εξοικονομούν χρήματα. Είμαστε ελεύθεροι και πάντα θα είμαστε. Επισκεφτείτε το Quartzy.com ή επικοινωνήστε στο [email protected]

Σας ενδιαφέρει να γράψετε για το The Q; Στείλτε μας ένα email!


Πείραμα 1:   Περιορισμός πέψης

Οι Restriction Digests ξεκινούν με την ανάμειξη του DNA και του RE, αλλά δυστυχώς δεν είναι τόσο απλό. Τα ένζυμα περιορισμού είναι ευαίσθητα και πρέπει να αντιμετωπίζονται προσεκτικά. Επειδή τα ένζυμα είναι πρωτεΐνες και οι πρωτεΐνες μετουσιώνονται καθώς αυξάνεται η θερμοκρασία, τα RE αποθηκεύονται πάντα σε καταψύκτη μέχρι να χρησιμοποιηθούν. Στην πραγματικότητα, όλα τα συστατικά σε ένα Restriction Digest διατηρούνται στον πάγο μέχρι να έρθει η ώρα να ξεκινήσει η αντίδραση. Οι πραγματικές συνθήκες αντίδρασης ποικίλλουν από το ένα ένζυμο στο επόμενο και περιλαμβάνουν θερμοκρασία, συγκέντρωση NaCl και/ή MgCl2, pH, κλπ. Όλες αυτές οι μεταβλητές εκτός από τη θερμοκρασία βελτιστοποιούνται με ανάμιξη του ενζύμου και του DNA με ένα ρυθμιστικό διάλυμα ειδικό για το ένζυμο του επιλογή. Μόλις αναμειχθούν όλα τα συστατικά στον σωλήνα αντίδρασης, ο σωλήνας επωάζεται στη βέλτιστη θερμοκρασία του ενζύμου περιορισμού για 1 ώρα ή περισσότερο. Στη συνέχεια, όταν η πέψη έχει λειτουργήσει για το κατάλληλο χρονικό διάστημα, ο σωλήνας αντίδρασης τοποθετείται ξανά στον πάγο για να αποφευχθεί η μη ειδική υποβάθμιση του DNA σας. Μόλις ολοκληρωθεί η Πέψη περιορισμού, εκτελείται ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης για να διαχωριστούν τα θραύσματα πέψης κατά μέγεθος και να οπτικοποιηθούν τα θραύσματα και ίσως να καθαριστούν για περαιτέρω πειράματα.


Απομόνωση πλασμιδίου DNA και χαρτογράφηση περιορισμού - Παρουσίαση PPT PowerPoint

Απομόνωση πλασμιδίου DNA και χαρτογράφηση περιορισμού Απομόνωση πλασμιδικού DNA Ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης Προσδιορισμός περιορισμού μεγέθους θραύσματος DNA. & ndash PowerPoint παρουσίαση PPT

Το PowerShow.com είναι ένας κορυφαίος ιστότοπος κοινής χρήσης παρουσιάσεων/διαφανειών. Είτε η εφαρμογή σας είναι επαγγελματική, πώς-για, εκπαίδευση, ιατρική, σχολείο, εκκλησία, πωλήσεις, μάρκετινγκ, διαδικτυακή εκπαίδευση ή απλώς για διασκέδαση, το PowerShow.com είναι ένας μεγάλος πόρος. Και, το καλύτερο από όλα, τα περισσότερα από τα υπέροχα χαρακτηριστικά του είναι δωρεάν και εύχρηστα.

Μπορείτε να χρησιμοποιήσετε το PowerShow.com για να βρείτε και να κατεβάσετε παραδείγματα διαδικτυακών παρουσιάσεων PowerPoint ppt για σχεδόν οποιοδήποτε θέμα μπορείτε να φανταστείτε, ώστε να μάθετε πώς να βελτιώνετε τις δικές σας διαφάνειες και παρουσιάσεις δωρεάν. Εναλλακτικά, χρησιμοποιήστε το για να βρείτε και να κατεβάσετε παρουσιάσεις ppt για το PowerPoint υψηλής ποιότητας με εικονογραφημένες ή κινούμενες διαφάνειες που θα σας διδάξουν πώς να κάνετε κάτι νέο, επίσης δωρεάν. Or χρησιμοποιήστε το για να ανεβάσετε τις δικές σας διαφάνειες στο PowerPoint, ώστε να τις μοιραστείτε με τους δασκάλους, την τάξη, τους μαθητές, τα αφεντικά, τους υπαλλήλους, τους πελάτες, τους πιθανούς επενδυτές ή τον κόσμο. Εναλλακτικά, χρησιμοποιήστε το για να δημιουργήσετε πραγματικά εντυπωσιακές παρουσιάσεις φωτογραφιών - με μεταβάσεις 2D και 3D, κινούμενα σχέδια και μουσική της επιλογής σας - που μπορείτε να μοιραστείτε με τους φίλους σας στο Facebook ή τους κύκλους σας στο Google+. Όλα αυτά είναι επίσης δωρεάν!

Με μια μικρή αμοιβή, μπορείτε να αποκτήσετε το καλύτερο διαδικτυακό απόρρητο της βιομηχανίας ή να προωθήσετε δημόσια τις παρουσιάσεις και τις παρουσιάσεις σας με κορυφαίες βαθμολογίες. Αλλά εκτός από αυτό είναι δωρεάν. Θα μετατρέψουμε ακόμη και τις παρουσιάσεις και τις προβολές διαφανειών σας στην καθολική μορφή Flash με όλο το αρχικό τους μεγαλείο πολυμέσων, συμπεριλαμβανομένων κινούμενων εικόνων, εφέ μετάβασης 2D και 3D, ενσωματωμένης μουσικής ή άλλου ήχου ή ακόμα και βίντεο ενσωματωμένα σε διαφάνειες. Όλα δωρεάν. Οι περισσότερες παρουσιάσεις και προβολές διαφανειών στο PowerShow.com είναι δωρεάν για προβολή, πολλές είναι ακόμη δωρεάν για λήψη. (Μπορείτε να επιλέξετε εάν θα επιτρέψετε στους χρήστες να κάνουν λήψη των αρχικών παρουσιάσεων του PowerPoint και των slideshow φωτογραφιών με χρέωση ή δωρεάν ή καθόλου.) Επισκεφθείτε σήμερα το PowerShow.com - ΔΩΡΕΑΝ. Υπάρχει πραγματικά κάτι για όλους!

παρουσιάσεις δωρεάν. Εναλλακτικά, χρησιμοποιήστε το για να βρείτε και να κατεβάσετε παρουσιάσεις ppt για το PowerPoint υψηλής ποιότητας με εικονογραφημένες ή κινούμενες διαφάνειες που θα σας διδάξουν πώς να κάνετε κάτι νέο, επίσης δωρεάν. Or χρησιμοποιήστε το για να ανεβάσετε τις δικές σας διαφάνειες στο PowerPoint, ώστε να τις μοιραστείτε με τους δασκάλους, την τάξη, τους μαθητές, τα αφεντικά, τους υπαλλήλους, τους πελάτες, τους πιθανούς επενδυτές ή τον κόσμο. Εναλλακτικά, χρησιμοποιήστε το για να δημιουργήσετε πραγματικά εντυπωσιακές παρουσιάσεις φωτογραφιών - με μεταβάσεις 2D και 3D, κινούμενα σχέδια και μουσική της επιλογής σας - που μπορείτε να μοιραστείτε με τους φίλους σας στο Facebook ή τους κύκλους σας στο Google+. Όλα αυτά είναι επίσης δωρεάν!


Ενσωμάτωση πλασμιδίων μετά την εκτομή CEN (ICE): Συνδυάζει την ευκολία της κλωνοποίησης ανασυνδυασμού ζυμομύκητα με τη σταθερότητα της γονιδιωματικής ολοκλήρωσης

Randolph Y. Hampton, Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California San Diego, 9500 Gilman Dr., La Jolla, CA 92093-0347.

Τμήμα Βιολογικών Επιστημών, Τμήμα Κυττάρων και Αναπτυξιακής Βιολογίας, University of California San Diego, La Jolla, California

Τμήμα Βιολογικών Επιστημών, Τμήμα Κυττάρων και Αναπτυξιακής Βιολογίας, University of California San Diego, La Jolla, California

Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California San Diego, La Jolla, California

Randolph Y. Hampton, Division of Biological Sciences, Section of Cell and Developmental Biology, University of California San Diego, 9500 Gilman Dr., La Jolla, CA 92093-0347.

Αφηρημένη

Η κλωνοποίηση ανασυνδυασμού ζύμης είναι μια απλή και ισχυρή μέθοδος για τον ανασυνδυασμό μιας ραχοκοκαλιάς πλασμιδίου με ένα συγκεκριμένο θραύσμα DNA. Ωστόσο, η χρησιμότητα της κλωνοποίησης ανασυνδυασμού ζύμης περιορίζεται από την απαίτηση για τη σπονδυλική στήλη να περιέχει ένα CEN/ΑΡΣ στοιχείο, το οποίο επιτρέπει την αναπαραγωγή των ανασυνδυασμένων πλασμιδίων. Αν και μαγιά CEN/ΑΡΣ Τα πλασμίδια είναι συχνά κατάλληλα για περαιτέρω μελέτες, αποδεικνύουμε εδώ ότι μπορούν να διαφέρουν σημαντικά στον αριθμό αντιγράφων από κύτταρο σε κύτταρο και από αποικία σε αποικία. Η παραλλαγή στον αριθμό αντιγράφου πλασμιδίου μπορεί να αποτελέσει μια απαράδεκτη και συχνά μη αναγνωρισμένη πηγή φαινοτυπικής διακύμανσης. Εάν τα επίπεδα έκφρασης είναι κρίσιμα για τον πειραματισμό, τότε τα κατασκευάσματα που δημιουργούνται με κλωνοποίηση ανασυνδυασμού ζύμης πρέπει να υποκλωνοποιηθούν σε ενσωματωμένα πλασμίδια, ένα βήμα που συχνά καταργεί τη χρησιμότητα της κλωνοποίησης ανασυνδυασμού. Κατά συνέπεια, έχουμε σχεδιάσει ένα διάνυσμα που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για κλωνοποίηση ανασυνδυασμού ζύμης αλλά μπορεί να μετατραπεί στην ενσωματωμένη έκδοση του προκύπτοντος φορέα χωρίς επιπλέον υποκλωνοποίηση. Αυτά ονομάζουμε διανύσματα "ICE", για "Ενσωμάτωση μετά CEN Εκτομή." Η σειρά ICE δημιουργήθηκε με την εισαγωγή ενός "σπάνιου κόφτη" Δενπλάγιασα CEN/ΑΡΣ στοιχείο στις πολλαπλές θέσεις κλωνοποίησης των πλασμιδίων ολοκλήρωσης ζύμης της σειράς pRS. Μετά την ανάκτηση από τη μαγιά, το CEN/ΑΡΣ αποκόπτεται από ΔενΧωνεύω και στη συνέχεια θρησκευοποιώ χωρίς να χρειάζεται καθαρισμός ή μεταφορά σε νέες συνθήκες. Η διενέργεια αυτής της προσέγγισης απαιτεί

3 ώρες, επιτρέποντας αυτή τη βελτίωση στο ίδιο χρονικό πλαίσιο με την κλασσική κλωνοποίηση ανασυνδυασμού.

Ένα πλασμίδιο που υποστηρίζει την πρωτοτροφία της λυσίνης δεν υπόκειται σε θετική επιλογή σε μέσο που στερείται λυσίνης. (Α) Κύτταρα που φέρουν α pTDH3 :: LYS1-GFP Το YCp υποβλήθηκε σε κυτταρομετρία ροής μετά την ανάπτυξη σε μέσο που δεν είχε λευκίνη (κόκκινο ιστόγραμμα) ή λυσίνη (μπλε ιστόγραμμα). (Β) Ο μέσος φθορισμός μετά την ανάπτυξη σε μέσο -LEU ή -LYS καταγράφηκε χρησιμοποιώντας κυτταρομετρία ροής. Ν = 3. Οι ράβδοι δείχνουν τον μέσο όρο τριών πειραμάτων. Οι γραμμές σφάλματος αντιπροσωπεύουν τυπική απόκλιση.

Απλοποιημένη σχηματική απεικόνιση ενός πλασμιδίου LEU2 ICE. (Α) Τα βασικά χαρακτηριστικά ενός πλασμιδίου ICE περιλαμβάνουν α CEN/ARS πλαισιώνεται από ΔενΤοποθεσίες I, καθορισμένες ακολουθίες (διακεκομμένη γραμμή) ανάντη και κατάντη προς το MCS (που υποδηλώνεται με τον μοναδικό κόφτη Speεγώ και XhoI) που μπορεί να προστεθεί σε μια κασέτα έκφρασης με εκκινητές προεξοχής και μια κασέτα επιλογής ζύμης (LEU2) με έναν μοναδικό ιστότοπο κοπής (ΗλικίαΙ) που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για γραμμικοποίηση πλασμιδίου και γονιδιωματική ενσωμάτωση.

Γραφικό πρωτόκολλο ροής εργασίας πλασμιδίου ICE. (Α) Κατά την προετοιμασία για το YRC, ένα πλασμίδιο ICE γραμμικοποιείται με πέψη. Οποιοδήποτε ένζυμο περιορισμού με μοναδική θέση κοπής στο MCS είναι κατάλληλο. Συνιστούμε τη χρήση δύο περιοριστικών ενζύμων, καθώς αυτό μπορεί να μειώσει τη συχνότητα κλεισίματος του πλασμιδίου με μη ομόλογη ακραία σύνδεση. (Β) Για να προετοιμάσετε ένα ένθετο για ανασυνδυασμό, ενισχύστε Το αγαπημένο σας γονίδιο (YFG) χρησιμοποιώντας PCR. Οι εκκινητές πρέπει να περιλαμβάνουν προεξοχές με ομολογία προς τη ραχοκοκαλιά πλασμιδίου ICE. (Γ) Το προϊόν PCR και η κομμένη ραχοκοκαλιά συν-μετασχηματίζονται σε ζυμομύκητα για να επιτευχθεί ανασυνδυασμός (διακεκομμένες γραμμές). Συνιστούμε μεταξύ 1:9 και 1:18 αναλογία διανύσματος προς εισαγωγή. Θα πρέπει επίσης να σημειωθεί ότι ο ανασυνδυασμός συχνά αναδεικνύει τη μη ομόλογη ένωση στο τέλος και ότι η έλλειψη εμπλουτισμού μεταξύ ενός ελέγχου μόνο με διανύσματα και ενός μετασχηματισμού διανύσματος συν ένθετο δεν πρέπει πάντα να ερμηνεύεται ως μια ανεπιτυχής προσπάθεια κλωνοποίησης. (Δ) Οι απομονωμένες αποικίες υποβάλλονται σε μίνι παρασκευή ζύμης και το νέο πλασμίδιο ανακτάται. Σε αυτό το στάδιο, συνιστούμε τη διενέργεια διαγνωστικής PCR με miniprep ζυμομύκητα για να διαπιστωθεί εάν η κλωνοποίηση ήταν επιτυχής. Τα επιθυμητά πλασμίδια υποβάλλονται στη συνέχεια σε πέψη από ΔενΙ, θρησκεία από λιγάση DNA Τ4 και μετατροπή σε μιscherichia coliΤο Προτείνουμε τη χρήση ενός ελέγχου χωρίς λιγάση ως δείκτη επιτυχούς CEN εκτομή και πλασμιδική θρησκεία. Ένα επιτυχημένο προϊόν του πρωτοκόλλου πλασμιδίου ICE έχει ένα μόνο, ανασυσταμένο ΔενΙ τοποθεσία, η οποία μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε διαγνωστική πέψη για να αποδείξει την παρουσία ή την απουσία της

500 bp CEN/ΑΡΣ θραύσμα. (Ε) Το YIp που παράγεται από CEN η εκτομή προετοιμάζεται για ενσωμάτωση με γραμμικοποίηση πλασμιδίου. Οποιοδήποτε ένζυμο περιορισμού με μοναδικό σημείο κοπής στον επιλεγόμενο δείκτη ζύμης είναι κατάλληλο (Π.χ. ΗλικίαΕΓΩ). Κατά τον μετασχηματισμό, το πλασμίδιο ενσωματώνεται στον ομόλογο γονιδιωματικό τόπο με ανασυνδυασμό και υποστηρίζει την πρωτοτροφία ή την αντίσταση στο φάρμακο. Αξιοσημείωτο, αυτή η μέθοδος ενσωμάτωσης πλασμιδίου μπορεί να οδηγήσει σε παράλληλη ενσωμάτωση πλασμιδίου. Οι χρήστες θα πρέπει να αναγνωρίζουν τα στελέχη με μια ενσωμάτωση πλασμιδίου με PCR, Western blot ή κυτταρομετρία ροής. Η προτιμώμενη στρατηγική PCR ανιχνεύει μια νέα σύνδεση μεταξύ πολλαπλών ενσωματώσεων πλασμιδίου. Αυτός ο νέος σύνδεσμος παράγεται όπου το πλασμίδιο αντιπαρατίθεται σε ένα επιπλέον πλασμίδιο και όχι στο γονιδίωμα.

Στελέχη ζύμης που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

Πλασμίδια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

Ολιγονουκλεοτίδια που χρησιμοποιήθηκαν σε αυτή τη μελέτη.

Σημείωση: Ο εκδότης δεν είναι υπεύθυνος για το περιεχόμενο ή τη λειτουργικότητα οποιωνδήποτε υποστηρικτικών πληροφοριών που παρέχονται από τους συγγραφείς. Οποιεσδήποτε ερωτήσεις (εκτός από το περιεχόμενο που λείπει) θα πρέπει να απευθύνονται στον αντίστοιχο συγγραφέα για το άρθρο.


Midiprep

Maxipep

Κιτ καθαρισμού πλασμιδίου ZymoPURE Περιγραφή προϊόντος

Τα κιτ καθαρισμού πλασμιδίου ZymoPURE είναι η καλύτερη μέθοδος για την ταχεία απομόνωση του πλασμιδικού DNA που είναι έτοιμο για επιμόλυνση. Ο καθαρισμός πλασμιδίου για προετοιμασίες Mini, προετοιμασίες Midi και προετοιμασίες Maxi πραγματοποιείται σε λιγότερο από 20 λεπτά και ο Giga προετοιμάζεται σε 50 λεπτά. Αυτή η οικογένεια κιτ καθαρισμού πλασμιδίου διαθέτει μια κατοχυρωμένη με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας χημεία σύνδεσης που επιτρέπει τον απλό καθαρισμό υψηλά συμπυκνωμένου (έως 3 mg/ml) πλασμιδικού DNA χωρίς ενδοτοξίνες σε μια στήλη spin. Η βελτιωμένη ροή εργασίας εξαλείφει τις στήλες ανταλλαγής ανιόντων αργής ροής βαρύτητας και τα βήματα καθίζησης ισοπροπανόλης που βρίσκονται σε άλλα κιτ. Τα κιτ καθαρισμού πλασμιδίου ZymoPURE μειώνουν τον χρόνο επεξεργασίας έως και 7x χρησιμοποιώντας πολλαπλή κενού ή φυγοκέντρηση. Απλώς δεσμεύστε, πλύνετε και εκλούστε το πλασμίδιο έτοιμο, ενδο-ελεύθερο σε λίγα λεπτά.

Τα κιτ καθαρισμού πλασμιδίου ZymoPURE είναι βελτιστοποιημένα για να διασφαλίζουν ότι το εκλουόμενο DNA δεν περιέχει ενδοτοξίνες, άλατα, πρωτεΐνες και RNA, με αποτέλεσμα πλασμίδια που είναι κατάλληλα για χρήση σε ευαίσθητες εφαρμογές. Τα κιτ καθαρισμού πλασμιδίου ZymoPURE II περιλαμβάνουν τις στήλες EndoZero που επιτρέπουν την ταχεία απομόνωση του πλασμιδίου DNA χωρίς ενδοτοξίνη. Το ενδο-ελεύθερο πλασμιδιακό DNA που προκύπτει είναι ιδανικό για επιμόλυνση 1 (συμπεριλαμβανομένων ευαίσθητων και πρωτογενών κυττάρων), CRISPR-Cas9 και γονιδιακής επεξεργασίας 2, φορείς φακοειδών ιών 3, φορείς αδενοϊού 3 και φορείς AAV 3, γονιδιακή θεραπεία, δημιουργία χιμαιρικού υποδοχέα αντιγόνου (CAR) 4, ανασυνδυασμένη γενιά αντισώματος 5, in vitro μεταγραφή 6, συνθετική βιολογία 7, PCR 8, διαγονιδιακός οργανισμός γενιάς 9 και μικροενέσεις 10, μοριακή κλωνοποίηση 11, περιοριστικές χωνεύσεις ενδονουκλεάσης, κατευθυνόμενη μεταλλαξογένεση 12, πλασμιδικός μετασχηματισμός αρμόδιων κυττάρων, ανάλυση αλληλουχίας Sanger 13 και άλλες ευαίσθητες μεταγενέστερες εφαρμογές.

Εφαρμογές Χρήσης

  1. Τα πειράματα επιμόλυνσης (σταθερή επιμόλυνση και παροδική επιμόλυνση) απαιτούν υψηλής συγκέντρωσης πλασμιδιακό DNA που είναι απαλλαγμένο από μολυσματικούς παράγοντες άλατος και ενδοτοξίνες διαφορετικά η αποτελεσματικότητα επιμόλυνσης μειώνεται. Ένα παράδειγμα ZymoPURE που χρησιμοποιείται σε επιμολύνσεις:

Koblan, LW, et αϊ., Βελτίωση εκδοτών βάσης κυτιδίνης και αδενίνης με βελτιστοποίηση έκφρασης και αναδόμηση των προγόνων. Nature Biotechnology, 843-846 (2018).

Findlay, GM, et al. Ακριβής ταξινόμηση των παραλλαγών BRCA1 με επεξεργασία γονιδιώματος κορεσμού. Nature 562, 217-222 (2018).

Hu, JH, et αϊ. Εξελιγμένες παραλλαγές Cas9 με ευρεία συμβατότητα PAM και υψηλή ειδικότητα DNA. Nature, 57-63 (2018).

Salasova, Α, et al. Μια πρωτεϊμική ανάλυση των συνεργατών δέσμευσης LRRK2 αποκαλύπτει αλληλεπιδράσεις με πολλαπλά συστατικά σηματοδότησης της οδού WNT/PCP. Μοριακή Νευροεκφυλισμός, 12 (54) (2017).

Jaitin, D.A, et al. Ανατομή των ανοσολογικών κυκλωμάτων συνδέοντας οθόνες CRISPR-Pooled με Single-Cell RNA-Seq. Cell, 1883-1896 (2016).

Salasova, Α, et al. Μια πρωτεομική ανάλυση των συνεργατών σύνδεσης LRRK2 αποκαλύπτει αλληλεπιδράσεις με πολλαπλά στοιχεία σηματοδότησης της οδού WNT/PCP. Μοριακή Νευροεκφυλισμός, 12 (54) (2017).

Chamberlain, K, et al. Ένα μοτίβο ρύθμισης Calisestrin Cis σε συνδυασμό με έναν προαγωγέα καρδιακής τροπονίνης Τ βελτιώνει την ειδικότητα μετατροπής του οροτύπου 9 του καρδιακού αδενοσυσχετισμένου ιού. Human Gene Therapy, 29(8) (2018).

Takemasa, Τ, et αϊ. Ταχεία κατασκευή φορέων υποδοχέα αντικαρκινικών Τ-κυττάρων από κατεψυγμένους όγκους για μηχανική θεραπεία Τ-κυττάρων. Cancer Immunology Research 6(5) (2018).

Vazquez-Lombardi, R, et αϊ. Παροδική έκφραση ανθρώπινων αντισωμάτων σε κύτταρα θηλαστικών. Nature Protocols, 13 (1), 99–117 (2017).

Marshall, R, et al. Γρήγορος και κλιμακούμενος χαρακτηρισμός τεχνολογιών CRISPR Χρησιμοποιώντας ένα Ε. Coli Σύστημα μεταγραφής-μετάφρασης χωρίς κελιά. Molecular Cell, 146-157 (2017).

Peñalber-Johnstone, C, et. al. Βελτιστοποίηση έκφρασης πρωτεΐνης χωρίς κύτταρα σε CHO: Αξιολόγηση επιδράσεων μεταφοράς μάζας μικρών μορίων σε διάφορες διαμορφώσεις αντιδραστήρων. Βιοτεχνολογία και Βιομηχανική, 114 (7), 1478–1486 (2017).

Hunter, DJB, et al. Απροσδόκητες αστάθειες εξηγούν τη μεταβλητότητα παρτίδας σε παρτίδα στα συστήματα έκφρασης πρωτεϊνών χωρίς κύτταρα. Βιοτεχνολογία και Βιομηχανική, 115 (8), 1904-1914 (2018).

Lillacci, G, et al. Συνθετικά συστήματα ελέγχου για έκφραση γονιδίων υψηλής απόδοσης σε κύτταρα θηλαστικών. Nucleic Acids Research 46 (18), 9855-9863 (2018).

Champer J, et αϊ. Οι νέες δομές κίνησης γονιδίου CRISPR/Cas9 αποκαλύπτουν γνώσεις σχετικά με τους μηχανισμούς σχηματισμού αλληλόμορφων αντίστασης και την αποτελεσματικότητα καθοδήγησης σε γενετικά διαφορετικούς πληθυσμούς. PLoS Genet 13(7), (2017).

Aram, R, et αϊ. Εργαλεία για τη μεσολάβηση Mos1 μεμονωμένου αντιγράφου (mosSCI) με κασέτες επιλογής uncis-119 (+) ή NeoR (G418). microPublication Biology (2019).

Ένα παράδειγμα καθαρισμένου πλασμιδίου ZymoPURE μετά τη συναρμολόγηση Gibson:

Lillacci, G, et αϊ. Συνθετικά συστήματα ελέγχου για γονιδιακή έκφραση υψηλής απόδοσης σε κύτταρα θηλαστικών. Nucleic Acids Research, 46 (18), 9855-9863 (2018).

Ένα παράδειγμα καθαρισμένου πλασμιδίου ZymoPURE μετά την κλωνοποίηση Gateway:

Xiong, J, et αϊ. Ανάπτυξη μιας δοκιμασίας διαλογής μεταφοράς ενέργειας συντονισμού φθορισμού με χρονική ανάλυση συντονισμού φθορισμού για τη στόχευση της αλληλεπίδρασης NSD3 και MYC. Assay and Drug Development Technologies 16 (2), 96-106 (2018).

Conway, JM, et al. Νέες πολυτομικές, πολυλειτουργικές γλυκοσιδικές υδρολάσες από εξαιρετικά λιγνοκυτταρολυτικές Καλδιοκυτταρικοπροστατευτικό είδος. AIChE Journal, 64 (12) (2018).

McCullock, TW, et al. Συγκρίνοντας την απόδοση των mScarlet-I, mRuby3 και mCherry ως αποδέκτες FRET για το mNeonGreen. PLoS ONE, 15 (2) (2020).


Καθαρισμός γραμμικού πλασμιδίου μετά από πέψη περιορισμού; - Βιολογία

Νεοσχιζομερή: BfuCI, Bsp143I, BstENII, BstKTI, BstMBI, DpnII, Kzo9I, NdeII

JBSpeed ​​Restriction Enzyme

Για in vitro χρησιμοποιείτε μόνο!

Ορισμός μονάδας: Μία μονάδα είναι η ποσότητα ενζύμου που απαιτείται για την πλήρη πέψη 1 & κούπα pBR322 (22 θέσεις) σε 1 ώρα σε συνολικό όγκο αντίδρασης 50 &mul. Η ενζυμική δραστηριότητα προσδιορίστηκε στο συνιστώμενο ρυθμιστικό διάλυμα αντίδρασης.

Αποστολή: αποστέλλεται σε μπλε πάγο

Συνθήκες αποθήκευσης: αποθηκεύεται στους -20 °C
αποφύγετε τους κύκλους κατάψυξης/απόψυξης

Διάρκεια ζωής: 12 μήνες

Μορφή: υγρό (Παραδίδεται σε 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 400 mM KCl, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 & κούπα/ml BSA και 50 % [v/v] γλυκερόλη)

Συγκέντρωση: 10 μονάδες/&mul

Πηγή: Diplococcus pneumoniae G41, ανασυνδυασμένο, Ε. Coli

Παρέχεται με: 10x Universal Buffer (UB)

Συνιστώμενη ανάλυση 50 &mul

5 & ​​mul10x Universal Buffer (UB)
1 & κούπακαθαρό DNA 1 ή προϊόν PCR 2
10 μονάδεςένζυμο
γεμίζουν έως 50 & mulΝερό βαθμού PCR
  • Το ένζυμο δεν πρέπει να υπερβαίνει το 10 % του συνολικού όγκου της αντίδρασης.
  • Προσθέστε ένζυμο ως τελευταίο συστατικό. Ανακατέψτε καλά τα συστατικά πριν προσθέσετε το ένζυμο. Μετά την προσθήκη ενζύμου, αναμίξτε απαλά με πιπέτα. Μην κάνετε δίνη.
  • Επώαση 5 έως 10 λεπτά. στους 37 ° C
  • Σταματήστε την αντίδραση εναλλακτικά:
    - Προσθήκη 2,1 &mul EDTA pH 8,0 [0,5 M], τελικό 20 mM
    - Θερμική απενεργοποίηση (20 λεπτά στους 80 ° C)
    -Καθαρισμός DNA στήλης περιστροφής (π.χ. κιτ καθαρισμού PCR, Cat.-No. PP-201S/L)
    -Ηλεκτροφόρηση πηκτώματος και αποκοπή μονής ζώνης (π.χ. κιτ εξαγωγής πηκτής αγαρόζης, Cat.- No. PP-202S/L)
    - Εκχύλιση φαινόλης-χλωροφορμίου ή καθίζηση με αιθανόλη.

Double Digestion - Buffer Compatibility:
Β1 - 75-100 % Σχετική Δραστηριότητα
Β2 - 75-100 % Σχετική Δραστηριότητα
Β3 - 50-75 % Σχετική Δραστηριότητα
Β4 - 10 % σχετική δραστηριότητα
Β5 - 75-100 % Σχετική Δραστηριότητα
1x UB - 100 % σχετική δραστηριότητα (συνιστάται)

Λάβετε υπόψη ότι η βέλτιστη συνθήκη πέψης για αυτό το ένζυμο είναι 1x UB. Στο σύστημα Universal Buffer (UB), η πλειονότητα των ενζύμων μας εμφανίζει 100% Σχετική Δραστηριότητα σε 1x UB και μόνο λίγα σε 0,5x ή 2x UB. Εάν η βέλτιστη συνθήκη για το δεύτερο ένζυμο είναι διαφορετική από τη συνιστώμενη για το πρώτο ένζυμο, προτείνουμε να πραγματοποιήσετε πρώτα τον περιορισμό στην υψηλότερη συνιστώμενη συγκέντρωση UB και να αραιώσετε τον όγκο της αντίδρασης στην επαρκή συγκέντρωση UB για να προχωρήσετε περαιτέρω με τον δεύτερο περιορισμό.


Οδηγός ρυθμιστικού διαλύματος ενζύμων αντίδρασης:

Συμβατότητα Reaction Buffer:
Τα περιοριστικά ένζυμα μας είναι πλήρως συμβατά με περιοριστικά και ρυθμιστικά συστήματα άλλων κατασκευαστών και μπορούν να χρησιμοποιηθούν σε διπλές πέψεις. Για καλύτερα αποτελέσματα, συμβουλευτείτε τα αντίστοιχα εγχειρίδια όλων των εμπλεκόμενων προϊόντων.

Υποχρεώσεις και ανακρίσεις:
Μετά από 50πλάσια υπερπέψη με DpnI, >70% των θραυσμάτων DNA μπορούν να απολινωθούν και >95% από αυτά μπορούν να επανακοπούν.

Εξάρτηση από μεθυλίωση:
Το DpnI είναι ειδικό για μεθυλιωμένο και ημιμεθυλιωμένο DNA. Δεδομένου ότι το DNA απομονώθηκε από τα περισσότερα Ε. Coli στελέχη είναι μεθυλιωμένο φράγμα, είναι ευαίσθητο σε DpnI πέψη. Ως εκ τούτου, το DpnI χρησιμοποιείται συχνά μετά από αντίδραση PCR για την πέψη του προτύπου μεθυλιωμένου γονικού DNA και επιλογή για μεταλλάξεις που περιέχουν το πρόσφατα συντεθέν DNA.

Ελεγχος ποιότητας:
Όλα τα παρασκευάσματα αναλύονται για μόλυνση ενδονουκλεάσης, 3'-εξωνουκλεάσης, 5 'εξωνουκλεάσης/ 5' φωσφατάσης, καθώς και μη ειδικών δραστηριοτήτων DNase μονής και δίκλωνης.


Δες το βίντεο: ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΠΟΤΑΜΩΝ ΣΤΗΝ ΑΡΓΟΛΙΔΑ 2522020 (Φεβρουάριος 2023).