Πληροφορίες

Μέθοδος Edman για την ταυτοποίηση πεπτιδίων με φαινυλισοθειοκυανικό (PTH)

Μέθοδος Edman για την ταυτοποίηση πεπτιδίων με φαινυλισοθειοκυανικό (PTH)


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Όλοι γνωρίζουμε ότι σε αυτή τη μέθοδο το PTH αντιδρά με το πρώτο αμινοξύ (aa) από το Ν-τερματικό στο πεπτίδιο και διαχωρίζεται από αυτό δίνοντας PTH-aa έτσι ώστε να μπορούμε να γνωρίζουμε την αλληλουχία αμινοξέων στο πεπτίδιο.

Το ερώτημα είναι τι εμποδίζει το PTH να αντιδράσει με το δεύτερο αμινοξύ αφού διαχωριστεί με το πρώτο αμινοξύ στον ίδιο χρόνο και φάση; Διότι αν συμβεί αυτό δεν μπορούμε να κάνουμε διάκριση μεταξύ του πρώτου και του δεύτερου υπολείμματος αμινοξέων στην ακολουθία.


Η σύντομη απάντηση είναι ότι η υποβάθμιση του Edman είναι μια διαδικασία πολλαπλών βημάτων. Η σελίδα της Wikipedia έχει μια αξιοπρεπή εικόνα του μηχανισμού. Στην πράξη, το πεπτίδιο αντιδρά με φαινυλισοθειοκυανικό (PTH) υπό ήπιες βασικές συνθήκες για να δώσει μια θειουρία, η οποία είναι σταθερή. Η περίσσεια PTH διαχωρίζεται από το ενδιάμεσο θειουρία. Η θειουρία στη συνέχεια υποβάλλεται σε επεξεργασία με οξύ για να διασπαστεί Ν-τελικό υπόλειμμα από το πεπτίδιο. Το PTH δεν είναι πλέον παρόν, επομένως δεν υπάρχει καμία ανησυχία για την αντίδραση με το δεύτερο υπόλειμμα.


Edman Διαγράμματα υποβάθμισης

Alain Doucet, Christopher M. Συνολικά, στο Methods in Enzymology, 2011

Αφηρημένη

Η αποικοδόμηση Edman είναι μια μακρά καθιερωμένη τεχνική για Ν-τερματικό προσδιορισμό αλληλουχίας πρωτεϊνών και θραυσμάτων διάσπασης. Ωστόσο, για ακριβή ανάλυση δεδομένων και εκχωρήσεις αμινοξέων, ο προσδιορισμός αλληλουχίας Edman προχωρά μόνο σε δείγματα μεμονωμένων πρωτεϊνών και έτσι δεν διαθέτει δυνατότητες υψηλής απόδοσης. Περιγράφουμε μια νέα μέθοδο για τον προσδιορισμό υψηλής απόδοσης των Ν-τερματικών αλληλουχιών πολλαπλών θραυσμάτων πρωτεΐνης σε διάλυμα. Η πρωτεολυτική επεξεργασία μπορεί να αλλάξει τη δραστηριότητα των βιοδραστικών πρωτεϊνών και επίσης να αποκαλύψει κρυπτικές θέσεις σύνδεσης και να δημιουργήσει πρωτεΐνες με νέες λειτουργίες (νεοπρωτεΐνες) που δεν βρίσκονται στο μητρικό μόριο. Για παράδειγμα, η επεξεργασία πρωτεΐνης εξωκυττάριας μήτρας (ECM) παράγει συχνά πολλαπλά πρωτεολυτικά θραύσματα με την παραγωγή κρυπτικών θέσεων σύνδεσης και νεοπρωτεϊνών με επεξεργασία πρωτεΐνης ECM να είναι καλά τεκμηριωμένη. Οι ακριβείς θέσεις πρωτεολυτικής διάσπασης πρέπει να προσδιοριστούν για να κατανοηθούν πλήρως οι λειτουργίες των θραυσμάτων διάσπασης και οι βιολογικοί ρόλοι των πρωτεασών in vivoΤο Ωστόσο, η ταυτοποίηση των θέσεων διάσπασης σε πολύπλοκες υψηλές μοριακές πρωτεΐνες, όπως αυτές που συνθέτουν την ECM, δεν είναι ασήμαντη. Η N-τερματική μικρο-ανάλυση των πρωτεολυτικών θραυσμάτων είναι η συνήθης μέθοδος που χρησιμοποιείται, αλλά πάσχει από κακή ανάλυση πηκτών ηλεκτροφόρησης πηκτής δωδεκυλσουλφικού νατρίου-πολυακρυλαμιδίου και είναι αναποτελεσματική στον εντοπισμό πολλαπλών σχισμών, απαιτώντας προετοιμασία πολυάριθμων πηκτωμάτων ή τεμαχίων μεμβράνης για ανάλυση. Πρόσφατα αναπτύξαμε αμινο-τερματική φασματομετρία μάζας υποστρωμάτων (ATOMS) για να ξεπεράσουμε αυτούς τους περιορισμούς ως συμπλήρωμα για τον Ν-τερματικό προσδιορισμό αλληλουχίας. Το ATOMS χρησιμοποιεί ισοτοπική σήμανση και ποσοτική φασματομετρία μάζας σε συνδυασμό για τον εντοπισμό θέσεων διάσπασης με γρήγορο και ακριβή τρόπο. Χρησιμοποιήσαμε με επιτυχία το ATOMS για τον εντοπισμό σχεδόν 100 θέσεων διάσπασης στις πρωτεΐνες ECM λαμινίνης και ινονηκτίνης. Εδώ παρουσιάζεται το αναλυτικό βήμα προς βήμα πρωτόκολλο για το ATOMS.


Αρχή

Η αποικοδόμηση Edman επιτρέπει να προσδιοριστεί η σειρά των αμινοξέων (η αλληλουχία αμινοξέων) σε ένα πεπτίδιο με επαναλαμβανόμενη ομαδοποίηση άκρων. Η πεπτιδική αλυσίδα διασπάται σταδιακά. Αυτή η αντίδραση χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό του Ν -τερματικό αμινοξύ ενός πεπτιδίου και αποτελείται από την αντίδραση ενός πεπτιδίου με ισοθειοκυανικό φαινύλιο, το οποίο είναι επίσης γνωστό ως αντιδραστήριο Edman.

Αφού κάθε αμινοξύ έχει διαφορετικό υπόλειμμα R , το καθένα σχηματίζει ένα διαφορετικό παράγωγο φαινυλοθειοϋδαντοΐνης (παράγωγο PTH). ο Ν- Το τελικό αμινοξύ διαχωρίζεται ως παράγωγο PTH ταυτοποιείται με χρωματογραφία σε σύγκριση με ένα πρότυπο. Μπορείτε διαδοχικά να πραγματοποιήσετε περαιτέρω αποικοδομήσεις σε μία και την αυτή πρωτεΐνη (προηγουμένως συντομευμένη από ένα αμινοξύ στο Ν -τελικό άκρο) και έτσι σταδιακά προσδιορίζεται η αλληλουχία αμινοξέων. ΕΝΑ συνεχιστής είναι μια αυτοματοποιημένη συσκευή που επιτρέπει την χωρίς επιτήρηση έως και 50 κύκλους υποβάθμισης. Δεδομένου ότι η αντίδραση προχωρά με σχετική απόδοση> 98%, αφενός τα παραγόμενα παράγωγα από προηγούμενους κύκλους και αφετέρου τα ανεπιθύμητα προϊόντα διάσπασης πρωτεϊνών που έχουν υποστεί έναν ή περισσότερους κύκλους διάσπασης αυξάνονται με κάθε κύκλο, έτσι ώστε μετά από κατ 'ανώτατο όριο 50 κύκλων, ο λόγος σήματος -Θορύβου γίνεται δυσανάγνωστος. Ένας κύκλος διαρκεί μία έως τρεις ώρες, ανάλογα με την παραλλαγή.


Μηχανισμός

Το φαινυλισοθειοκυανικό αντιδρά με μια μη φορτισμένη τερματική αμινομάδα, κάτω από ήπιες αλκαλικές συνθήκες, για να σχηματίσει μια κυκλική φαινυλοθειοκαρβαμοϋλ παράγωγο. Στη συνέχεια, υπό όξινες συνθήκες, αυτό το παράγωγο του τελικού αμινοξέος διασπάται ως παράγωγο θειαζολινόνης. Το αμινοξύ θειαζολινόνης στη συνέχεια εκχυλίζεται επιλεκτικά σε έναν οργανικό διαλύτη και υποβάλλεται σε επεξεργασία με οξύ για να σχηματιστεί το πιο σταθερό παράγωγο αμινοξέος φαινυλοθειοϋδαντοΐνης (PTH) που μπορεί να αναγνωριστεί με χρήση χρωματογραφίας ή ηλεκτροφόρησης. Αυτή η διαδικασία μπορεί στη συνέχεια να επαναληφθεί ξανά για να προσδιοριστεί το επόμενο αμινοξύ. Ένα σημαντικό μειονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι ότι τα πεπτίδια που αλληλουχούνται με αυτόν τον τρόπο δεν μπορούν να έχουν περισσότερα από 50 έως 60 υπολείμματα (και στην πράξη, κάτω από 30). Το μήκος του πεπτιδίου είναι περιορισμένο λόγω της κυκλικής παραγωγοποίησης που δεν ολοκληρώνεται πάντα. Το πρόβλημα της παραγωγοποίησης μπορεί να επιλυθεί με διάσπαση μεγάλων πεπτιδίων σε μικρότερα πεπτίδια πριν προχωρήσουμε στην αντίδραση. Είναι σε θέση να ταξινομήσει με ακρίβεια έως και 30 αμινοξέα με σύγχρονα μηχανήματα ικανά για απόδοση άνω του 99% ανά αμινοξύ. Ένα πλεονέκτημα της αποικοδόμησης Edman είναι ότι χρησιμοποιεί μόνο 10 - 100 pico-moles πεπτιδίου για τη διαδικασία προσδιορισμού αλληλουχίας. Η αντίδραση αποικοδόμησης Edman είναι αυτοματοποιημένη για να επιταχύνει τη διαδικασία. [2]


Υποβάθμιση του Edman

Υποβάθμιση Έντμαν, που αναπτύχθηκε από τον Pehr Edman, είναι μια μέθοδος προσδιορισμού αλληλουχίας αμινοξέων σε ένα πεπτίδιο. Σε αυτή τη μέθοδο, το αμινοτελικό υπόλειμμα επισημαίνεται και αποκόπτεται από το πεπτίδιο χωρίς να διακόπτονται οι πεπτιδικοί δεσμοί μεταξύ άλλων υπολειμμάτων αμινοξέων.

Μηχανισμός για την υποβάθμιση του Edman

Το φαινυλισοθειοκυανικό αντιδρά με μια αφόρτιστη τερματική αμινομάδα, υπό ήπιες αλκαλικές συνθήκες, για να σχηματίσει φαινυλοθειοκαρβαμοϋλ παράγωγο. Στη συνέχεια, υπό όξινες συνθήκες, αυτό το παράγωγο του τερματικού αμινοξέος διασπάται ως παράγωγο θειαζολινόνης. Το αμινοξύ θειαζολινόνης στη συνέχεια εκχυλίζεται επιλεκτικά σε έναν οργανικό διαλύτη και υποβάλλεται σε επεξεργασία με οξύ για να σχηματιστεί το πιο σταθερό παράγωγο αμινοξέος φαινυλοθειοϋδαντοΐνης (PTH) που μπορεί να αναγνωριστεί με χρήση χρωματογραφίας ή ηλεκτροφόρησης. Αυτή η διαδικασία μπορεί στη συνέχεια να επαναληφθεί ξανά για να προσδιοριστεί το επόμενο αμινοξύ. Ένα σημαντικό μειονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι ότι τα πεπτίδια που αλληλουχούνται με αυτόν τον τρόπο δεν μπορούν να έχουν περισσότερα από 50 έως 60 υπολείμματα. Αυτό συμβαίνει επειδή η αντίδραση αποδόμησης Edman δεν είναι 100% αποτελεσματική, πράγμα που σημαίνει ότι το βήμα διάσπασης δεν συμβαίνει κάθε φορά. Ωστόσο, αυτό το πρόβλημα μπορεί να επιλυθεί με διάσπαση μεγάλων πεπτιδίων σε μικρότερα πεπτίδια πριν προχωρήσουμε στην αντίδραση. Είναι σε θέση να προσδιορίσει με ακρίβεια έως και 30 αμινοξέα με απόδοση 98% ανά αμινοξύ. Ένα πλεονέκτημα της αποδόμησης Edman είναι ότι χρησιμοποιεί μόνο 10 - 100 πικομόλες πεπτιδίου για τη διαδικασία προσδιορισμού της αλληλουχίας. Η αντίδραση υποβάθμισης Edman αυτοματοποιείται για να επιταχύνει τη διαδικασία. Ώ ]


Τι είναι η υποβάθμιση του Edman;

Υποβάθμιση του Edman, που συχνά αναφέρεται ως Ν-τερματικός προσδιορισμός αλληλουχίας ή Edman, είναι μια πολύ γνωστή διαδικασία για τον εντοπισμό του Ν-τελικού αμινοξέος μιας πρωτεΐνης και παραμένει μια μοναδική προσέγγιση που μπορεί να δώσει νέα δεδομένα αλληλουχίας πρωτεΐνης. Είναι επίσης η προτιμώμενη τεχνική για γρήγορη επιβεβαίωση έκφρασης πρωτεΐνης.

Η χημεία αυτής της προσέγγισης εισήχθη για πρώτη φορά το 1950 από τον P. Edman από το Πανεπιστήμιο Lund στη Σουηδία και αναπτύχθηκε περαιτέρω κατά τη διάρκεια της εργασίας του στη Μελβούρνη της Αυστραλίας σε αυτό που πιστεύεται ότι είναι η πρώτη αυτοματοποιημένη συσκευή προσδιορισμού αλληλουχίας πεπτιδίων. Οι πρωτεΐνες που παράγονται μέσα σε μεμονωμένα κύτταρα λειτουργούν ως ορμόνες, ένζυμα και άλλοι σημαντικοί ρυθμιστές. Η γενετική μετάλλαξη που οδηγεί σε μια μη φυσιολογική πρωτεΐνη θα μπορούσε να έχει σοβαρές συνέπειες για την υγεία.

Το Ν-τελικό αμινοξύ διασπάται με κατεργασία με ένα από τα πολλά αντιδραστήρια, στη συνέχεια υδρολύεται για να σχηματίσει ένα ξεχωριστό αμινοξύ. Η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας, η HPLC ή η ηλεκτροφόρηση προσδιορίζει το μέγεθος του αμινοξέος και το συγκρίνει με ένα γνωστό πρότυπο μεγέθους. Το νέο Ν-τερματικό άκρο της εναπομείνασας πρωτεΐνης μπορεί παρομοίως να διασπαστεί για ταυτοποίηση.

Η Applied Biosystems οδήγησε στην ανάπτυξη της αυτοματοποίησης της αποδόμησης του Edman, η οποία δεσμεύει μια καθαρισμένη πρωτεΐνη σε μια μεμβράνη και την επεξεργάζεται με φαινυλισοθειοκυανικό. Το δωρεάν αμινοξύ εγχέεται αυτόματα σε σύστημα HPLC για αναγνώριση.

Ο φαινυλισοθειοκυανικός αντιδρά με μια μη φορτισμένη τελική αμινομάδα, υπό ήπιες αλκαλικές συνθήκες, για να σχηματίσει ένα κυκλικό παράγωγο φαινυλοθειοκαρβαμοϋλίου. Στη συνέχεια, υπό όξινες συνθήκες, αυτό το παράγωγο του τελικού αμινοξέος διασπάται ως παράγωγο θειαζολινόνης. Το αμινοξύ θειαζολινόνης στη συνέχεια εκχυλίζεται επιλεκτικά σε έναν οργανικό διαλύτη και υποβάλλεται σε επεξεργασία με οξύ για να σχηματίσει την πιο σταθερή φαινυλοθειοϋδαντοΐνη (PTH)- παράγωγο αμινοξέος που μπορεί να αναγνωριστεί χρησιμοποιώντας χρωματογραφία ή ηλεκτροφόρηση. Αυτή η διαδικασία μπορεί στη συνέχεια να επαναληφθεί ξανά για να προσδιοριστεί το επόμενο αμινοξύ. Ένα σημαντικό μειονέκτημα αυτής της τεχνικής είναι ότι τα πεπτίδια που αναλύονται με αυτόν τον τρόπο δεν μπορούν να έχουν περισσότερα από 50 έως 60 υπολείμματα.

Η Applied Biosystems οδήγησε στην ανάπτυξη της αυτοματοποιημένης αποικοδόμησης Edman, η οποία δεσμεύει μια καθαρισμένη πρωτεΐνη σε μια μεμβράνη και την επεξεργάζεται με φαινυλισοθειοκυανικό. Το δωρεάν αμινοξύ εγχέεται αυτόματα σε σύστημα HPLC για αναγνώριση. Ν-(9-φθορενυλμεθοξυκαρβονυλοξυ)ηλεκτριμίδιο (CAS Νο. 82911-69-1) χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με ισοθειοκυανικό για τη διεξαγωγή μερικής αποικοδόμησης Edman σε βιολογικά ενεργά πεπτίδια. Επειδή η αποικοδόμηση Edman προέρχεται από το Ν-άκρο της πρωτεΐνης, δεν θα λειτουργήσει εάν το Ν-τελικό αμινοξύ έχει τροποποιηθεί χημικά ή αν είναι κρυμμένο μέσα στο σώμα της πρωτεΐνης.

Οι πρωτεΐνες πρέπει να είναι καθαρές και απαλλαγμένες από μολυσματικούς παράγοντες για τον ακριβή προσδιορισμό του Ν-τελικού αμινοξέος. Τα όρια αποδόμησης του Edman απαιτούν μεγάλα μόρια πρωτεΐνης κατακερματισμένα σε μικρές πεπτιδικές αλυσίδες και όχι πλέον 50 αμινοξέα.


Αφηρημένη

Τα πρωτεώματα των κυττάρων, των ιστών και των οργανισμών αντανακλούν τις ενεργές κυτταρικές διεργασίες και μεταβάλλονται συνεχώς σε απόκριση των ενδοκυτταρικών και εξωκυτταρικών ενδείξεων. Το βαθύ, ποσοτικό προφίλ του πρωτεώματος, ειδικά εάν συνδυάζεται με μετρήσεις mRNA και μεταβολιτών, θα πρέπει να παρέχει μια άνευ προηγουμένου εικόνα της κυτταρικής κατάστασης, αποκαλύπτοντας καλύτερα τις λειτουργίες και τις αλληλεπιδράσεις των κυτταρικών συστατικών. Η μοριακή διάγνωση και η ανακάλυψη βιοδεικτών θα πρέπει να ωφελούνται ιδιαίτερα από την ακριβή ποσοτικοποίηση των πρωτεωμάτων, καθώς σύνθετες ασθένειες όπως ο καρκίνος αλλάζουν τις αφθονίες και τις τροποποιήσεις πρωτεϊνών. Επί του παρόντος, η φασματομετρία μάζας κυνηγετικών όπλων είναι η κύρια τεχνολογία για τον προσδιορισμό και τον ποσοτικό προσδιορισμό πρωτεϊνών υψηλής απόδοσης ενώ είναι ισχυρή, δεν διαθέτει υψηλή ευαισθησία και κάλυψη. Πραγματοποιούμε παραλληλισμούς με τον προσδιορισμό αλληλουχίας DNA επόμενης γενιάς και προτείνουμε μια στρατηγική, που ονομάζεται αλληλουχία φθορίου, για τον προσδιορισμό αλληλουχίας πεπτιδίων σε ένα σύνθετο δείγμα πρωτεΐνης σε επίπεδο μεμονωμένων μορίων. Στην προτεινόμενη προσέγγιση, οραματίζονται παράλληλα εκατομμύρια επιμέρους φθορίζοντα σημασμένα πεπτίδια, παρακολουθώντας τα μεταβαλλόμενα πρότυπα έντασης φθορισμού καθώς τα Ν-τερματικά αμινοξέα απομακρύνονται διαδοχικά και χρησιμοποιώντας τις προκύπτουσες υπογραφές φθορισμού (φθοριοσειρές) για τον μοναδικό προσδιορισμό μεμονωμένων πεπτιδίων. Εισάγουμε ένα θεωρητικό θεμέλιο για τον προσδιορισμό φθορισμού και, χρησιμοποιώντας προσομοιώσεις υπολογιστή Monte Carlo, διερευνούμε τη σκοπιμότητά του, προβλέπουμε τα πιο πιθανά πειραματικά λάθη, ποσοτικοποιούμε τις πιθανές επιπτώσεις τους και συζητάμε την ευρεία δυνητική χρησιμότητα που προσφέρει μια τεχνολογία αλληλουχίας πεπτιδίων υψηλής απόδοσης.


Συμπέρασμα

Μία νέα λιποπεπτιδική ένωση απομονώθηκε από το 5812-A/C Στρεπτομυκητες sp INA-5812 και διαπιστώθηκε ότι έχουν δομικά και λειτουργικά χαρακτηριστικά παρόμοια με άλλα αντιβιοτικά του λιποπεπτιδίου του εμπορίου, συμπεριλαμβανομένης της υποτιθέμενης δομικής αναλογικής δαπτομυκίνης. Βρέθηκαν ορισμένες βασικές λειτουργικές διαφορές σε σύγκριση με τη δαπτομυκίνη, συμπεριλαμβανομένης της άμεσης επίδρασης στην κυτταρική μεμβράνη, ακολουθούμενη από ταχεία διαπερατότητα και ισχυρή βακτηριοκτόνο δράση στους πληθυσμούς στόχους. Επιπλέον, το 5812-A/C ήταν μοναδικά ικανό να αναστείλει το μεταβολισμό των βακτηριακών κυττάρων που σχετίζονται με τα ώριμα βιοφίλμ, κάτι που είναι ενδιαφέρον σε σχέση με τα ανθεκτικά σε πολλά φάρμακα στελέχη και τις κλινικές απομονώσεις.


Υλικά και μέθοδοι

Παρασκευή επισημασμένης πρωτεΐνης.

Ομοιόμορφα επισημασμένη [14C]γλουταθειόνη μικρό-τρανσφεράση (GST) παρασκευάστηκε ως εξής. Το πλασμίδιο DNA που περιέχει GST Yc ποντικού (19), που παρέχεται από τον T. Bammler (University of Washington, Seattle), χρησιμοποιήθηκε για τον μετασχηματισμό των κυττάρων BL21 (DE3) από Escherichia coliΤο Τα βακτήρια που φιλοξενούν τον φορέα GST αναπτύχθηκαν για 26 ώρες στους 37°C με ανακίνηση, σε μέσο Μ9 ελάχιστο που περιέχει αμπικιλλίνη (50 μg/ml). Ένα μικρολίτρο αυτής της κυτταρικής καλλιέργειας μεταφέρθηκε σε 200 μl μέσου Μ9 που περιείχε 85 μCi (1 Ci = 37 GBq) d -[U-14 C] γλυκόζη (323 mCi/mmol Amersham Pharmacia) με 350 μg μη επισημασμένης d-γλυκόζης. Η καλλιέργεια επωάστηκε στους 37°C με ανακίνηση μέχρι την OD600 έφτασε το 0,5-1,0. Η παραγωγή ανασυνδυασμένου GST στη συνέχεια προκλήθηκε με την προσθήκη ισοπροπυλ β -d -θειογαλακτοπυρανοσιδίου (IPTG) σε τελική συγκέντρωση 1 mM. Τα βακτήρια αναπτύχθηκαν για επιπλέον 12 ώρες στους 37°C με ανακίνηση και συλλέχθηκαν με φυγοκέντρηση στα 2.000 g για 5 λεπτά στους 4°C. Τα κύτταρα επαναιωρήθηκαν σε 100 μl κυτταρικού τοιχώματος που διασπά το αντιδραστήριο BugBuster (Novagen) με τη νουκλεάση Benzonase (Novagen) για μείωση του ιξώδους. Τα κύτταρα ανακινήθηκαν απαλά σε θερμοκρασία δωματίου για 20 λεπτά και το εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στα 16.000 σολ για 20 λεπτά στους 4 ° C. Το υπερκείμενο εφαρμόστηκε σε σφαιρίδια γλουταθειόνης Sepharose 4B (75 μl όγκος κρεβατιού Sigma) σε σωλήνες Eppendorf, τα οποία εξισορροπήθηκαν σε ρυθμιστικό Α (50 mM Tris⋅HCl, pH 7,4/200 mM NaCl/0,5 mM DTT) και επωάστηκαν για 35 λεπτά στους 4°C. Το εναιώρημα φυγοκεντρήθηκε στα 500 g για 5 λεπτά στους 4°C και το υπερκείμενο απορρίφθηκε. Το ίζημα πλύθηκε τέσσερις φορές με 1 ml ρυθμιστικού διαλύματος Α. Το [14 C]GST εκλούστηκε τρεις φορές με 50 μl ρυθμιστικού διαλύματος Β (200 mM Tris⋅HCl, ρΗ 9,0/50 mM ανηγμένη γλουταθειόνη) στους 4°C και διαλύματα έκλουσης συγκεντρώθηκαν. Το ρυθμιστικό αντικαταστάθηκε με PBS που περιείχε 0,5 mM DTT χρησιμοποιώντας Microcon 10 (Millipore). Η συγκέντρωση του ομοιόμορφα επισημασμένου [14 C] GST προσδιορίστηκε με ανάλυση SDS/PAGE με χρώση αργύρου χρησιμοποιώντας μη επισημασμένο GST ως πρότυπο. Η συγκέντρωση του τυπικού GST προσδιορίστηκε με ανάλυση αμινοξέων. Για αυτήν την ποσοτική ανάλυση χρησιμοποιήθηκε η Scion Image (Scion, Frederick, MD). Χρησιμοποιήθηκε Wallac 1409 LSC (Wallac, Gaithersburg, MD) για τον προσδιορισμό της συγκεκριμένης δραστηριότητας.

Τυχαία σύνθεση πεπτιδίου-σφαιριδίων.

Τα πεπτιδικά σφαιρίδια σχεδιάστηκαν για να απελευθερώνουν ισομοριακές ποσότητες καθενός από τα φυσικά αμινοξέα με κάθε κύκλο Edman. Μείγματα φθορενυλμεθοξυκαρβονυλ-αμινοξέων (Fmoc, 5 ισοδ.) συζεύχθηκαν με TentaGel NH2 ρητίνη (0,26 mmol/g Rapp Polymere, Tübingen, Γερμανία) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο 1,3-διισοπροπυλοκαρβοδιϊμίδιο/1-υδροξυβενζοτριαζόλη (5 ισοδύναμα) (20). Οι ομάδες Fmoc απομακρύνθηκαν με διάλυμα πιπεριδίνης/διμεθυλοφορμαμιδίου (DMF) 25% και διεξήχθη σταδιακή αντίδραση σύζευξης μέχρις ότου ελήφθησαν σφαιρίδια πεπτιδίου 10-μερών. Μετά την απομάκρυνση Fmoc, τα τυχαία σφαιρίδια πεπτιδίου πλύθηκαν με DMF, μεθανόλη και διχλωρομεθάνιο και ξηράνθηκαν υπό κενό.

Αλληλουχία πρωτεϊνών.

Ο αυτοματοποιημένος προσδιορισμός αλληλουχίας πρωτεϊνών πραγματοποιήθηκε σε συσκευή προσδιορισμού αλληλουχίας 477Α εξοπλισμένη με σύστημα HPLC 120Α (PE Applied Biosystems). Όλα τα αντιδραστήρια και οι διαλύτες που χρησιμοποιήθηκαν για τον προσδιοριστή αλληλουχίας ελήφθησαν από την PE Applied Biosystems και ελέγχθηκαν για περιεκτικότητα 14 C σε AMS πριν από τη χρήση. Το διάλυμα [14 C]GST αραιώθηκε σε συγκεντρώσεις 10-1.000 amol/μl με 0,1% TFA σε νερό που περιείχε β-λακτοσφαιρίνη (2,5 pmol/μl). Η συγκέντρωση κάθε αραιωμένου διαλύματος [14 C]GST προσδιορίστηκε με μέτρηση 14 C με AMS. Πολυβρένιο (3,0 mg) εφαρμόστηκε σε ένα γυάλινο φίλτρο στον θάλαμο αντίδρασης και υποβλήθηκε σε τρεις προκύκλους. Πριν από την προσθήκη [14 C]GST, β-λακτοσφαιρίνη (25 pmol) και σφαιρίδια πεπτιδίου (4-7 σφαιρίδια) φορτώθηκαν στο γυάλινο φίλτρο και ξηράνθηκαν υπό αέριο αργό. Το πρόγραμμα αλληλουχίας τροποποιήθηκε έτσι ώστε μια γνωστή ποσότητα τυποποιημένων ΡΤΗ-αμινοξέων παραδόθηκαν στη φιάλη μετατροπής κάθε κύκλος πριν από τη μεταφορά αμινοξέων ανιλινοθειαζολινόνης στη φιάλη επιπλέον των αμινοξέων από τα πεπτιδικά σφαιρίδια και τη λακτοσφαιρίνη. Τα κλάσματα HPLC συλλέχθηκαν κάθε 30 ή 60 δευτερόλεπτα σε σωλήνες καλλιέργειας βοριοπυριτικού γυαλιού (6 × 50 mm), οι οποίοι πυρολύθηκαν πριν από τη χρήση για την απομάκρυνση τυχόν υπολειπόμενου άνθρακα.

Προετοιμασία και μέτρηση δείγματος AMS.

Κάθε δείγμα συλλέχθηκε σε ένα μικρό γυάλινο σωλήνα και 50 μl διαλύματος φορέα άνθρακα (40,0 mg/ml τριβουτυρίνης σε μεθανόλη) προστέθηκαν πριν από την ξήρανση σε φυγόκεντρο κενού για να δώσει 1,19 mg φορέα C. Τρία τεμάχια φορέα τριβουτυρίνης παρασκευάστηκαν με κάθε σετ των κλασμάτων. Τα δείγματα γραφικοποιήθηκαν για AMS όπως περιγράφεται από τον Vogel (21). Οι τυπικοί χρόνοι μέτρησης AMS ήταν 3 λεπτά/δείγμα, με ακρίβεια καταμέτρησης 1,4-2,0% και SD μεταξύ 3-7 μετρήσεων 1-3%. Οι αναλογίες 14 C/ 13 C των αγνώστων κανονικοποιήθηκαν σε μετρήσεις τεσσάρων πανομοιότυπων προτύπων γνωστής συγκέντρωσης ισοτόπων (Australian National University Sucrose ref. 22).


Pehr Victor Edman 1916-1977

Ο Pehr Victor Edman γεννήθηκε στη Στοκχόλμη της Σουηδίας τον Απρίλιο του 1916 και πέθανε στο Μόναχο της ΟΔΓ τον Μάρτιο του 1977. Γεννήθηκε σε οικογένεια δικηγόρου και έλαβε το σχολείο του στη Στοκχόλμη. Το 1935 άρχισε ιατρικές σπουδές στο Ινστιτούτο Karolinska και αποφοίτησε με τα κύρια ιατρικά του προσόντα το 1938. Ενδιαφέρθηκε για την έρευνα και, μετά την αποφοίτησή του, συνέχισε να εργάζεται στο Ινστιτούτο Karolinska, σε μεγάλο βαθμό στο εργαστήριο του καθηγητή Eric Jorpes. Φαίνεται να έχει διδάξει συστηματικά οργανική χημεία αυτή τη στιγμή με εκτενή ανάγνωση. Στα χρόνια του πολέμου η έρευνά του διακόπηκε από μια μακρά περίοδο υπηρεσίας στο ιατρικό σώμα του Σουηδικού Στρατού. Του απονεμήθηκε το πτυχίο του γιατρού Ιατρικής το 1946. Αντικείμενο της διατριβής του ήταν ο καθαρισμός και η ανάλυση αγγειοτενσίνης από αίμα βοοειδών. Οι παλαιότερες δημοσιευμένες μελέτες του αφορούσαν την ηπαρίνη και τη σεκρετίνη, τα οποία ήταν ενδιαφέροντα του μέντορά του Jorpes.

Σε αυτή τη συγκυρία ο Έντμαν άρχισε να παίρνει την ανεξάρτητη ερευνητική κατεύθυνση την οποία ακολούθησε σχεδόν αδιάκοπα για το υπόλοιπο της καριέρας του. Δέχτηκε επιχορήγηση για να εργαστεί για ένα χρόνο στο εργαστήριο Northrop-Kunitz στο παράρτημα του Πρίνστον του Ινστιτούτου Ιατρικής Έρευνας Ροκφέλερ. Η σουηδική ιατρική έρευνα είχε απομονωθεί κατά τη διάρκεια του πολέμου και ανυπομονούσε να μάθει για την πρόοδο που σημειώθηκε στις Ηνωμένες Πολιτείες. Επιπλέον, η εργασία του για την αγγειοτενσίνη τον είχε κάνει να συνειδητοποιήσει ότι η απλή σύνθεση ανάλυσης δεν θα ήταν χρήσιμη για την παροχή μιας βάσης για την κατανόηση της βιολογικής λειτουργίας των πεπτιδίων ή των πρωτεϊνών. Η συνειδητοποίηση ότι οι πρωτεΐνες δεν ήταν κολλοειδή αλλά ότι η καθεμία είχε ένα συγκεκριμένο μοριακό βάρος και μια συγκεκριμένη δομή είχε αρχίσει να αναδύεται, ειδικά ως αποτέλεσμα της εργασίας της ομάδας της Ουψάλα. Ο Έντμαν γνώριζε ότι η σειρά των αμινοξέων που συνδέονται με πεπτιδικούς δεσμούς ήταν ένα ουσιαστικό μέρος της μοναδικής σύνθεσης κάθε δεδομένης πρωτεΐνης. Στο Πρίνστον άρχισε πειράματα για να βρει έναν τρόπο χημικής αποκωδικοποίησης της αλληλουχίας αμινοξέων των πρωτεϊνών.

Στα πρώτα χρόνια των προσπαθειών του Έντμαν σε αυτόν τον τομέα χρησιμοποιήθηκαν δύο γενικές διαδικασίες για την επίθεση στο πρόβλημα της ακολουθίας. Διάφορα αντιδραστήρια είχαν βρεθεί χρήσιμα στην επισήμανση του αμινοτελικού (ή του πρώτου) αμινοξέος μέσω της αντιδραστικής αμινομάδας του και επιτρέποντας την ταυτοποίηση ως παράγωγο. Ένα από αυτά τα αντιδραστήρια, το φθοριοδινιτροβενζόλιο (FDNB), το οποίο έδωσε το παράγωγο δινιτροφαινόλης (DNP) του αμινοτελικού άκρου, χρησιμοποιήθηκε από τον Sanger στην εποχική εργασία του σχετικά με τη δομή της ινσουλίνης. Χρησιμοποιώντας την αντίδραση FDNB με σετ αλληλεπικαλυπτόμενων πεπτιδίων που προέρχονται από μερική διάσπαση της ινσουλίνης, ο Sanger, μέχρι το 1956, ήταν σε θέση να συναγάγει μια μοναδική δομή για το μόριο της ινσουλίνης. Αυτή ήταν η πρώτη κύρια δομή μιας πρωτεΐνης που αποκωδικοποιήθηκε, αλλά παρά την αναμφισβήτητη σημασία του κατορθώματος ήταν σαφές ότι η μέθοδος ήταν πολύ δυσκίνητη για να έχει ευρεία εφαρμογή.

Ένα άλλο αντιδραστήριο που χρησιμοποιήθηκε για τον αμινοτελικό προσδιορισμό ήταν το φαινυλοϊσοκυανικό (PIC), που εισήχθη για το σκοπό αυτό από τους Abderhalden και Brockmann το 1930. Όπως και με το FDNB, η υδρόλυση για την απελευθέρωση του αμινοτελικού παραγώγου αμινοξέος κατέστρεψε πολλούς από τους άλλους πεπτιδικούς δεσμούς, αφήνοντας την υπόλοιπη πρωτεΐνη άχρηστη για ανάλυση. Στο Πρίνστον, ο Έντμαν συνειδητοποίησε ότι εάν χρησιμοποιούνταν φαινυλισοθειοκυανικό (PITC) το πυρηνόφιλο θείο θα αποδυνάμωνε τον παρακείμενο πεπτιδικό δεσμό, αυξάνοντας την πιθανότητα εύρεσης συνθηκών για την υδρόλυση του που δεν διέσπασαν το υπόλοιπο του μορίου. Αυτό το εναπομείναν πεπτίδιο θα μπορούσε στη συνέχεια να υποβληθεί σε δεύτερη αντίδραση με PITC και να προσδιοριστεί το δεύτερο αμινοξύ, και ούτω καθεξής θεωρητικά στο καρβοξυτελικό άκρο του μορίου. Αν ο Έντμαν σκέφτηκε αυτή τη λύση εντελώς ανεξάρτητα, αν κάποιο άσχετο χαρτί που αποκαλύφθηκε στην ευρεία ανάγνωσή του τράβηξε την προσοχή του PITC ή αν κάποιος συνάδελφος στο Πρίνστον ή στη Στοκχόλμη πρότεινε τη χρήση της δεν είναι γνωστή. Λαμβάνοντας υπόψη την επιτυχία που πέτυχε τελικά η αντίδραση, η τελευταία φαίνεται απίθανη ελλείψει αξιώσεων ή αναμνήσεων για το σκοπό αυτό. Στην ανασκόπηση των μεθόδων προσδιορισμού αλληλουχίας αμινοξέων που γράφτηκε το 1969, ο Edman πονάει ότι η αντίδραση PITC δεν προήλθε καθόλου από την προηγούμενη αντίδραση PIC, καθώς είχαν διαφορετικούς μηχανισμούς δράσης. Ωστόσο, ενόψει των επιφανειακών ομοιοτήτων μεταξύ των αντιδραστηρίων και των παρόμοιων χρήσεων με τις οποίες χρησιμοποιήθηκαν στην χημεία των πρωτεϊνών, αυτό φαίνεται λίγο τεταμένο. Όταν ο Έντμαν επέστρεψε στη Σουηδία το 1947 είχε κάνει αρκετά πειράματα για να γνωρίζει ότι η ιδέα ήταν εφικτή και θα μπορούσε να αποτελέσει τη βάση μιας τεχνικής προσδιορισμού αλληλουχίας πρωτεϊνών.

Ο Έντμαν ανέλαβε αναπληρωτής καθηγητής στο Λουντ και συνέχισε να εργάζεται σχεδόν αποκλειστικά στην υποβάθμιση των πρωτεϊνών. Το παράγωγο που προκύπτει από τη σύζευξη του PITC με ένα αμινοξύ, το αμινοξύ 3-φαινυλ-2-θειοϋδαντοΐνη (PTH), αποδείχθηκε ότι είναι μια σταθερή ένωση σχεδόν σε όλες τις περιπτώσεις. Ο Edman συνέθεσε τα παράγωγα PTH όλων των αμινοξέων που βρέθηκαν στις πρωτεΐνες και ανέπτυξε χρωματογραφικά συστήματα για να προσδιορίσει και να ποσοτικοποιήσει τις συνθήκες για τη σύζευξη του PITC με το αμινοτελικό και την διάσπαση του παραγώγου PTH που λειτούργησε ομαλά για όλους τους πεπτιδικούς δεσμούς. Μετά από δύο χρόνια εργασίας ο Edman μπόρεσε να δημοσιεύσει τις χημικές λεπτομέρειες μιας μεθόδου ικανής, θεωρητικά, να λύσει το πρόβλημα της πρωτογενούς δομής των πρωτεϊνών και να παράσχει τις βασικές πληροφορίες για αναρίθμητες πρωτεΐνες που είναι απαραίτητες για περαιτέρω πρόοδο στη βιοχημεία των πρωτεϊνών. Το χαρακτηριστικό φάσμα υπεριώδους απορρόφησης των PTH-αμινοξέων τα έκανε ιδιαίτερα κατάλληλα για ποσοτικές μελέτες. Επιτρέπει χρήσιμες μετρήσεις της δομής της υπομονάδας και του μοριακού βάρους των πρωτεϊνών και, σε συνδυασμό με τη χρωματογραφία στήλης, ήταν μια εναλλακτική λύση στην αντίδραση νινυδρίνης για ανάλυση αμινοξέων. Ωστόσο, αυτές οι δυνατότητες δεν θα μπορούσαν να αξιοποιηθούν πλήρως μέχρι τις πρόσφατες εξελίξεις στην υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης. Η μέθοδος έγινε ευρέως γνωστή και πήρε το επώνυμο «Edman degradation» από τον Kai Linderstrom-Lang των Εργαστηρίων Carlsberg.

Στις αρχές της δεκαετίας του 1950, ο κύριος «Jack» Holt, ένας γνωστός βικτοριανός προπονητής ιπποδρομιών, πέθανε και η διαθήκη του προέβλεπε ότι τα έσοδα από την περιουσία του, που θα κρατούνταν στο καταπίστευμα, θα χρησιμοποιούνταν για ιατρική έρευνα στο νοσοκομείο St. Vincent's στη Μελβούρνη. . Μέχρι το 1956 οι αρχές του νοσοκομείου είχαν αποφασίσει να δημιουργήσουν ένα ξεχωριστό ερευνητικό ίδρυμα στο νοσοκομείο αντί να εκταμιεύσουν τα κεφάλαια ως ερευνητικές επιχορηγήσεις σε υπάρχουσες νοσοκομειακές μονάδες. Η απόφαση είχε επίσης ληφθεί για την ανάπτυξη μιας μη κλινικής βασικής επιστημονικής περιοχής, κατά προτίμηση βιοχημείας. Η Σχολή Ιατρικών Ερευνών, όπως ήταν αρχικά γνωστή, είχε δικό της διοικητικό συμβούλιο και για πρακτικούς σκοπούς λειτουργούσε ανεξάρτητα από τη διοίκηση του νοσοκομείου.

Ο Έντμαν υπέβαλε αίτηση για τη θέση του Διευθυντή Ερευνών. Ήταν σαφώς ο εξαιρετικός υποψήφιος και επιπλέον τα ενδιαφέροντά του συνέπεσαν με την προτίμηση στη βιοχημεία ως επίκεντρο της Σχολής. Το 1957 ο Έντμαν δέχτηκε την προσφορά της θέσης του πρώτου Διευθυντή Έρευνας στη Σχολή Ιατρικής Έρευνας του St Vincent στη Μελβούρνη. Οι λόγοι του για αυτήν την κίνηση, που λέγεται ότι ήταν ένα μείγμα γενικής δυσαρέσκειας για τους επιστημονικούς πόρους στο Lund και την επικείμενη κατάρρευση του γάμου του, πρέπει να ήταν ισχυροί και να μην κατευθύνονταν κυρίως στη βελτίωση της σταδιοδρομίας. Είχε μόλις ολοκληρώσει ένα εξαιρετικό κομμάτι ατομικής βιοχημικής έρευνας που θα τον έκανε ευπρόσδεκτο σε πολλά κορυφαία κέντρα στο βόρειο ημισφαίριο. Στην Αυστραλία, στη Μελβούρνη, θα απομονωθεί σε μεγάλο βαθμό από αυτά τα κέντρα. Το Σχολείο ήταν ένα νέο ίδρυμα, χωρίς παραδόσεις, χωρίς καταξιωμένους εργαζόμενους, ούτε προσωπικό υποστήριξης και παρόλο που βρισκόταν σε εκπαιδευτικό νοσοκομείο του Πανεπιστημίου της Μελβούρνης, δεν είχε καθόλου ακαδημαϊκή ή πανεπιστημιακή υπαγωγή. Επιπλέον, η Αυστραλία εκείνη τη στιγμή δεν ήταν γνωστή για γενναιόδωρη κρατική χρηματοδότηση έρευνας. Παρά αυτήν την τρομερή σειρά αντικίνητρων, ο Έντμαν αποφάσισε να μετακομίσει μόνος του στη Μελβούρνη για να συνεχίσει το έργο του, αρχικά χωρίς εκπαιδευμένη βοήθεια και χωρίς στενούς συναδέλφους.

Στην Αυστραλία, ο Edman ολοκλήρωσε μερικά μικρά έργα σχετικά με άλλες πτυχές της δομής των πρωτεϊνών που είχε ξεκινήσει στη Σουηδία, αλλά κατά τα άλλα εργάστηκε σχεδόν εξ ολοκλήρου στην αποικοδόμηση του φαινυλισοθειοκυανικού (PITC). Αυτή η εργασία περιελάμβανε τρεις φάσεις: βελτιώσεις στις συνθήκες για την αποικοδόμηση, επικεντρώθηκε σε μεγάλο βαθμό στην εξάλειψη των πλευρικών αντιδράσεων «αυτοματοποίηση» της αλληλουχίας αντιδράσεων και εφαρμογή της αποδόμησης σε διάφορα προβλήματα αλληλουχίας. Η τελευταία φάση επικαλύπτει τις άλλες δύο και συνήθως αφορούσε τα ενδιαφέροντα των επισκεπτών επιστημόνων που είχαν έρθει στο εργαστήριο του Έντμαν για να μάθουν ή να χρησιμοποιήσουν την τεχνική του.

Μέχρι το 1960-61 η αντίδραση υποβάθμισης τριών σταδίων είχε ουσιαστικά τελειοποιηθεί. Η καθολική εφαρμογή του και η επαναλαμβανόμενη φύση του υπέδειξε στον G.S. Begg, τον Αυστραλό τεχνικό βοηθό του Edman, ότι θα ήταν κατάλληλο για αυτοματισμό. Ο Έντμαν συνειδητοποίησε ότι ο αριθμός των υπαρχουσών πρωτεϊνών (περίπου δέκα εκατομμύρια) έκανε τη χειροκίνητη αλληλουχία αδύνατη εργασία και γρήγορα μετατράπηκε στην ιδέα του αυτοματισμού. Ο στενός έλεγχος των συνθηκών αντίδρασης που ήταν δυνατός με την αυτοματοποίηση έδωσε επίσης υπόσχεση υψηλότερης και σταθερότερης επαναλαμβανόμενης απόδοσης από ό, τι ήταν δυνατό με το χέρι. Οι υψηλές επαναλαμβανόμενες αποδόσεις είναι ζωτικής σημασίας για επαναλαμβανόμενες διαδικασίες, είτε συνθετικές είτε αποικοδομητικές. Ο Τζέφρι Μπεγκ ήταν ένα από τα πρώτα τεχνικά στελέχη που είχε απασχολήσει ο Έντμαν μετά την άφιξή του στη Μελβούρνη. Δεν είχε επίσημα προσόντα, αλλά από έναν συνδυασμό μαθημάτων στο τεχνικό κολέγιο και αυτοδιδασκαλία είχε επιτύχει μια αξιοσημείωτη τεχνογνωσία στην πρακτική χημεία και φυσώντας γυαλί, τη μηχανολογία και την ηλεκτρονική. Το έργο sequenator παρείχε μια τέλεια ευκαιρία να χρησιμοποιηθούν αυτά τα πολλαπλά ταλέντα που συμπλήρωσαν την ακαδημαϊκή και θεωρητική γνώση του Edman. Ο Έντμαν και ο Μπεγκ εργάστηκαν ως ομάδα στο έργο αυτοματισμού ακολουθιών, χωρίς συνεχή συμβολή από άλλους εργαζόμενους. Typicalταν τυπικό για την εμπεριστατωμένη προσέγγιση του Έντμαν σε όλα τα καθήκοντα που έγινε αρκετά ικανός κατασκευαστής εργαλείων σε αυτή την περίοδο για να κάνει πολλά από τα κατάλληλα και να γυρίσει μόνος του.

Η βάση αυτού που επρόκειτο να γίνει ο καθοριστής πρωτεϊνών αναπτύχθηκε σε ένα πρωτότυπο στάδιο σε μια περίοδο λίγων εβδομάδων το φθινόπωρο του 1961 - το γυάλινο κύπελλο που περιστρέφεται στον κυλινδρικό του άξονα, προσθήκη αντιδραστηρίων μέσω ενός καθετήρα, αντιδράσεις σε ένα λεπτό υγρό φιλμ στον τοίχο του περιστρεφόμενου κυπέλλου και οι εκχυλίσεις με διαλύτη κινούνται προς τα πάνω πάνω από το φιλμ σε μια αυλάκωση. Μέσα σε δύο χρόνια ο Έντμαν και ο Μπεγκ είχαν κατασκευάσει, στο δικό τους εργαστήριο, μια μηχανή ικανή να πραγματοποιήσει αξιόπιστα τις αντιδράσεις της υποβάθμισης. Είχαν βρει νέες συνθήκες και αντιδραστήρια κατάλληλα για τις φυσικές συνθήκες του περιστρεφόμενου κυπέλλου, για παράδειγμα, το ανοιχτό κύπελλο γενικά απαιτούσε λιγότερες πτητικές χημικές ουσίες και οι στενοί σωλήνες παροχής και εκροής απαιτούσαν ιδιαίτερη προσοχή στην επιφανειακή τάση και τις ρεολογικές ιδιότητες των διαλυτών. Η ευρεία γνώση του Edman για την κλασική οργανική χημεία επέτρεψε τη γρήγορη πρόοδο στη μετατροπή της χειροκίνητης αντίδρασης στην αυτοματοποιημένη μορφή της. Το 1964 ο Έντμαν ανέφερε τα προκαταρκτικά ευρήματά του σε μια συνάντηση στη Σκωτία. Το 1967 στο πρώτο τεύχος του European Journal of Biochemistry με τον Begg ως συν-συγγραφέα, δημοσίευσε την οριστική του εργασία που καταδεικνύει έναν αδιάσπαστο αυτοματοποιημένο προσδιορισμό των αμινοτελικών εξήντα αμινοξέων της μυοσφαιρίνης της φυσητήρας φάλαινας με ρυθμό ενός υπολείμματος ανά ώρα. Η έκταση αυτής της προόδου μπορεί να μετρηθεί από τη γνώση ότι εκείνη την εποχή η πιο εκτεταμένη χειροκίνητη αποικοδόμηση περιελάμβανε περίπου δεκαπέντε υπολείμματα με ρυθμό ένα ανά ημέρα. Πολλά εργαστήρια δεν μπόρεσαν να καθορίσουν τη χειροκίνητη αποδόμηση καθόλου, λόγω της αποτυχίας να εκτιμηθεί η σημασία των καθαρών αντιδραστηρίων στην εξάλειψη των παρενεργειών. Κατά τα επόμενα χρόνια ο στόχος του Edman ήταν να βελτιώσει την επαναλαμβανόμενη απόδοση που λαμβάνεται από το μηχάνημα, μια αύξηση από το 98% του χαρτιού του 1967 στο 99% υπολογίστηκε για να διπλασιάσει το μήκος της προσδιορίσιμης ακολουθίας. Ο διαχωριστής πρωτεϊνών στη Μελβούρνη παρέμεινε μοναδικός μέχρι τα τέλη του 1969 όταν η Beckman Instrument Company στις Ηνωμένες Πολιτείες έθεσε στην αγορά μια εμπορική έκδοση βασισμένη στο σχέδιο του Edman. Ο Έντμαν δεν έπαιξε κανένα ρόλο στην εμπορευματοποίηση της μηχανής του. Το Διοικητικό Συμβούλιο της Σχολής συζήτησε τις δυνατότητες κατοχύρωσης διπλώματος ευρεσιτεχνίας για το sequenator, αλλά σύντομα δέχτηκε την ισχυρή άποψη του Edman ότι θα έπρεπε να δημοσιεύσει πλήρως χωρίς προστασία διπλώματος ευρεσιτεχνίας. Ο Έντμαν εξελέγη Συνεργάτης της Αυστραλιανής Ακαδημίας Επιστημών το 1968 και Συνεργάτης της Βασιλικής Εταιρείας του Λονδίνου το 1974. Ο Έντμαν έγινε Αυστραλός υπήκοος στα μέσα της δεκαετίας του εξήντα.

Το 1972 ο Edman παραιτήθηκε από τη Σχολή Ιατρικής Έρευνας του St Vincent και έγινε Διευθυντής Πρωτεϊνικής Χημείας Ι στο Ινστιτούτο Βιοχημείας Max Planck στο Martinsreid κοντά στο Μόναχο. Το 1968 είχε ξαναπαντρευτεί τη δεύτερη σύζυγό του Agnes Henschen που είχε έρθει από τη Στοκχόλμη και αυτό του είχε δώσει έναν λόγο να σκεφτεί μια επιστροφή στην Ευρώπη. Στα δέκα χρόνια από την άφιξή του το 1957 το Σχολείο είχε παραμείνει μικρό και οι προσπάθειες να αυξηθεί η υποστήριξη για επέκταση με βάση την επιτυχία του έργου του sequenator δεν αποδείχτηκαν ιδιαίτερα επιτυχημένες. Τώρα, όπως πολλά χρόνια πριν στο Λουντ, πίστευε ότι η σημασία της δουλειάς του δεν αναγνωρίστηκε σωστά και ότι θα συνέχιζε να έχει ανεπαρκείς πόρους στη Μελβούρνη. Η μετάβαση στα νέα εργαστήρια του Ινστιτούτου Max Planck φάνηκε να δίνει μια απάντηση στις ανάγκες του. Ο Έντμαν δημιούργησε το εργαστήριό του στο Μόναχο, όπως αυτό στη Μελβούρνη και με τον ίδιο στόχο να αυξήσει την αποτελεσματικότητα της υποβάθμισης. In addition, with his aid, Agnes Henschen began to make substantial progress in her studies of fibrinogen structure. Sadly, Edman developed a cerebral tumour and died after a short period of coma in 1977.

Edman played little if any role in broader scientific administration or politics in Australia. Although his School had no formal academic affiliation, there is no evidence that he would not have been accepted in these arenas. Some efforts to arrange a personal appointment at the University of Melbourne came to nothing. Thus he remained something of an enigma in the scientific community. He was slow to publish, with approximately one and a half papers per year during his Australian period, which made difficulties for those wishing to implement the method. If his impact on the Australian scene was limited, it was paradoxically the result of his single-minded pursuit of the sequence degradation. Such work, despite Edman's reputation, was not very attractive to students and he never built up a tradition of a flow of graduate students. Once the initial work on the manual or especially the automated reaction was complete, the details would easily have been completed by others in his or other laboratories. One cannot help thinking that his impact would have been so much greater had he seen himself able to move strongly into new areas of protein structure and function. Biological research often requires the appreciation of the importance of an approximate result for advancement.

Nevertheless the Fellowships of the Australian Academy of Science and the Royal Society of London indicate in how much esteem his work was held internationally, and this judgement has been supported by later events. Technical advances in related fields, especially in liquid chromatography and sensitive ultra violet detectors, have led to the development of low-level or microsequencing techniques which still employ the reactions described by Edman forty years ago and which play an indispensible role in gene isolation and molecular cloning.

Edman's reputation as a reclusive person, often difficult to deal with, did not arise from those who worked with him in the laboratory. He was reserved by Australian standards, but courteous and always helpful, often humorous, and took pleasure in organising social occasions both at his home and outdoors in the country. To those who came to know him in the laboratory two aspects probably had a lasting influence. In those days he was a rare example in the hospitals and the world of Australian medical research of someone who devoted himself full-time to nonclinical research. This served as an example, to those who came across him, of the possibility of such a career. At a time when biochemistry in Australia was largely concerned with the intricacies of metabolic pathways, an area where the great discoveries had already been made, Edman understood and stressed the importance of the information-containing macromolecules. The double helical structure of DNA had been proposed by Watson and Crick only a few years before Edman's arrival in Australia. The possibility of obtaining a corresponding understanding of the more complex structures of proteins which Edman's work opened up inspired his colleagues with the belief that they were in a position to participate directly in a new era of biological investigation. fic basis for consciousness. Cognitive Studies 5, 95-109.