Πληροφορίες

Γιατί απαιτείται ισοτοπική σήμανση αζώτου για πρωτεϊνικό NMR;

Γιατί απαιτείται ισοτοπική σήμανση αζώτου για πρωτεϊνικό NMR;


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Γιατί απαιτείται σήμανση για το άζωτο (από 15Ν) για τη μελέτη της δομής μιας πρωτεΐνης χρησιμοποιώντας NMR;


Δεν απαιτείται αυστηρά. Η σήμανση ισοτόπων είναι απαιτείται όταν το συνηθισμένο ισότοπο δεν έχει μαγνητικό σπιν (για παράδειγμα 12ΝΤΟ). 14Το Ν έχει σπιν 1 και εμφανίζει 3 καταστάσεις σπιν: -1, 0 και 1. Το ισότοπο, 15Το N έχει περιστροφή 1/2. Όπως σημειώνεται σε αυτό το βιβλίο, υπάρχουν αναλυτικές μέθοδοι και για τα δύο ισότοπα αζώτου.

Ωστόσο, 15Το Ν προτιμάται για μελέτες NMR επειδή οι χημικές μετατοπίσεις που παράγονται από 14Το Ν μπορεί να είναι πολύ ευρύ για να ανιχνευθεί με φασματόμετρο NMR υψηλής ανάλυσης.

Από wikipedia:

Το άζωτο-15 χρησιμοποιείται συχνά στη φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR), επειδή σε αντίθεση με το πιο άφθονο άζωτο-14, το οποίο έχει ακέραιο πυρηνικό σπιν και επομένως τετραπολική ροπή, 15Το N έχει κλασματικό πυρηνικό σπιν στο μισό, το οποίο προσφέρει πλεονεκτήματα για NMR όπως στενότερο πλάτος γραμμής.

Από http://chem.ch.huji.ac.il/nmr/techniques/1d/row2/n.html:

Το 1Δ 14Το πείραμα NMR αζώτου είναι πολύ λιγότερο ευαίσθητο από το πρωτόνιο (1Η) αλλά έχει πολύ μεγαλύτερο εύρος χημικής μετατόπισης. Τα σήματα του διευρύνονται από τετραπολικές αλληλεπιδράσεις. Όσο μεγαλύτερο είναι το μόριο και όσο πιο ασύμμετρο είναι το περιβάλλον του αζώτου, τόσο ευρύτερο είναι το σήμα. Ως εκ τούτου, το μικρό και εξαιρετικά συμμετρικό υδατικό ιόν αμμωνίου δίνει μια πολύ έντονη γραμμή (εικ. 3), λιγότερο από ένα Hertz πλάτους. Η υγρή αμμωνία, όντας λιγότερο συμμετρική, έχει πλάτος 16 Hz (σε φασματόμετρο 400 MHz σε θερμοκρασία δωματίου). Η ουρία είναι μεγαλύτερη και ασύμμετρη, επομένως το πλάτος γραμμής είναι περίπου 1 KHz. Τα μόρια που είναι σημαντικά μεγαλύτερα από την ουρία αποδίδουν σήματα πολύ ευρέα για να παρατηρηθούν με φασματόμετρο NMR υψηλής ανάλυσης. Ωστόσο, το εύρος χημικής μετατόπισης του αζώτου είναι ευρύ και επομένως μπορεί να χρησιμοποιηθεί εύκολα για τη διάκριση ειδών αζώτου για πολύ μικρά μόρια.


Βακτηριακή ζύμωση και επισήμανση ισοτόπων βελτιστοποιημένη για αμυλοειδογόνες πρωτεΐνες

Για αλληλογραφία. E-mail [email protected] Τηλ. +3613722500/1653 Φαξ +3613722620.

Εργαστήριο Δομικής Χημείας και Βιολογίας, Ινστιτούτο Χημείας, Πανεπιστήμιο Eötvös Loránd, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

Hevesy György PhD School of Chemistry, Eötvös Loránd University, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

Εργαστήριο Δομικής Χημείας και Βιολογίας, Ινστιτούτο Χημείας, Πανεπιστήμιο Eötvös Loránd, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

Hevesy György PhD Σχολή Χημείας, Πανεπιστήμιο Eötvös Loránd, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

Laboratory of Interfaces and Nanostructures, Institute of Chemistry, Eötvös Loránd University, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

Εργαστήριο Δομικής Χημείας και Βιολογίας, Ινστιτούτο Χημείας, Πανεπιστήμιο Eötvös Loránd, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

Hevesy György PhD School of Chemistry, Eötvös Loránd University, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

Εργαστήριο Δομικής Χημείας και Βιολογίας, Ινστιτούτο Χημείας, Πανεπιστήμιο Eötvös Loránd, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

MTA-ELTE Protein Modeling Research Group, Eötvös Loránd Research Network (ELKH), Institute of Chemistry, Eötvös Loránd University, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

MTA-ELTE Protein Modeling Research Group, Eötvös Loránd Research Network (ELKH), Institute of Chemistry, Eötvös Loránd University, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

Laboratory of Interfaces and Nanostructures, Institute of Chemistry, Eötvös Loránd University, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

Εργαστήριο Δομικής Χημείας και Βιολογίας, Ινστιτούτο Χημείας, Πανεπιστήμιο Eötvös Loránd, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

MTA-ELTE Protein Modeling Research Group, Eötvös Loránd Research Network (ELKH), Institute of Chemistry, Eötvös Loránd University, Pázmány P. stny. 1/A, Βουδαπέστη, H-1117 Ουγγαρία

Για αλληλογραφία. E-mail [email protected] Τηλ. +3613722500/1653 Φαξ +3613722620.

Αυτό το ερευνητικό έργο υποστηρίχθηκε από την Ευρωπαϊκή Ένωση και το κράτος της Ουγγαρίας και χρηματοδοτήθηκε από το Ευρωπαϊκό Ταμείο Περιφερειακής Ανάπτυξης (VEKOP-2.3.2-16-2017-00014) επιχορήγηση του NKFIH της Ουγγρικής Ακαδημίας Επιστημών.


Τμηματική ισοτοπική επισήμανση με πρωτεϊνική απολίνωση που προκαλείται από ασπαραγινυλενδοπεπτιδάση

Η τμηματική ισοτοπική σήμανση μπορεί να διευκολύνει τις μελέτες NMR μεγάλων πρωτεϊνών, πρωτεϊνών πολλαπλών τομέων και πρωτεϊνών με επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, ανακουφίζοντας τις επικαλύψεις σημάτων NMR. Η τμηματική ισοτοπική επισήμανση μας επιτρέπει επίσης να διερευνήσουμε μια μεμονωμένη περιοχή στο πλαίσιο μιας πρωτεΐνης πλήρους μήκους με NMR. Διάφορες καθιερωμένες μέθοδοι είναι διαθέσιμες για τμηματική ισοτοπική επισήμανση, όπως η απολίνωση με μεσολάβηση ιντεΐνης, αλλά η καθεμία έχει συγκεκριμένες απαιτήσεις και περιορισμούς. Εδώ, αναφέρουμε μια ενζυματική προσέγγιση χρησιμοποιώντας βακτηριακά παραγόμενη ενδοπεπτιδάση ασπαραγίνης από Oldenlandia affinis για την τμηματική ισοτοπική σήμανση μιας πρωτεΐνης με επαναλαμβανόμενες αλληλουχίες, μια σχεδιασμένη επαναλαμβανόμενη πρωτεΐνη αρμαντίλο, ξεπερνώντας ορισμένες από τις ελλείψεις της ενζυματικής απολίνωσης για τμηματική ισοτοπική σήμανση.

Αυτή είναι μια προεπισκόπηση του περιεχομένου συνδρομής, πρόσβαση μέσω του ιδρύματός σας.


Εισαγωγή

Η λειτουργία και η επιβίωση των κυτταρικών οργανισμών εξαρτάται από την ικανότητα των κυτταρικών κοινωνιών να μεταφέρουν βασικές πληροφορίες μέσω δικτύων επικοινωνίας που συνήθως αναφέρονται ως μονοπάτια σηματοδότησης. Οι προκύπτουσες κυτταρικές αποκρίσεις τέτοιων οδών διαμεσολαβούνται από πολυάριθμες βιομοριακές αλληλεπιδράσεις που είναι κρίσιμες για τη ρύθμιση διαφόρων ζωτικών βιολογικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένης της μεταγωγής σήματος, της ρύθμισης των γονιδίων, της ενζυμικής κατάλυσης, της ανοσοαπόκρισης, της επεξεργασίας σήματος, της κωδικοποίησης και της ολοκλήρωσης (Hunter et al., 2000 Wong και Scott, 2004 Kholodenko, 2006 Anglister et al., 2016). Αρκετές σημαντικές παθολογίες όπως ο καρκίνος, το χρόνιο φλεγμονώδες σύνδρομο και ο διαβήτης εξαρτώνται συνήθως από τη δυσλειτουργία ενός ή περισσότερων βημάτων σε μια οδό σηματοδότησης (Yarden and Sliwkowski, 2001 Fischer et al., 2003 Gray et al., 2003 Solinas et al. , 2007 Wang et al., 2013 Vlahopoulos et al., 2015). Η απόκτηση κατανόησης ατομικής ανάλυσης των δυναμικών αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης στις οποίες βασίζεται η ρύθμιση των μονοπατιών μεταγωγής σήματος είναι επομένως κρίσιμη για το σχεδιασμό αποτελεσματικών στρατηγικών για θεραπευτική παρέμβαση κατά των ανθρώπινων ασθενειών.

Εδώ, θα περιγράψουμε σύγχρονες μεθοδολογίες NMR για τον χαρακτηρισμό της δομής και της θερμοδυναμικής των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Αυτή η συνεισφορά προορίζεται για ειδικούς μη-NMR, επομένως περιορίζεται στις πιο κοινές μεθόδους NMR για τη διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Συγκεκριμένα, θα εισαγάγουμε διάφορες τεχνικές για τον ορισμό διεπαφών σύνδεσης και τον προσδιορισμό σταθερών διάστασης (κρε), εκτός από άλλα σχετικά πειράματα για τον προσδιορισμό της δομής NMR συμπλεγμάτων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης. Το NMR είναι μοναδικά κατάλληλο για να παρέχει πληροφορίες ατομικής ανάλυσης σχετικά με τη δομή, τη δυναμική και τη θερμοδυναμική των συμπλεγμάτων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης κάτω από σχεδόν φυσιολογικές συνθήκες. Οι συνεχείς τεχνολογικές εξελίξεις στο NMR διαλύματος και στερεάς κατάστασης καθιερώνουν μεθόδους NMR ως θεμελιώδη εργαλεία έρευνας για την απόκτηση γνώσεων σχετικά με τη βιοχημεία των μονοπατιών μεταγωγής σήματος.


Αποτελέσματα και συζήτηση

Το Σχήμα 1 ▶ δείχνει την πρωτογενή αλληλουχία αμινοξέων κάθε πεπτιδίου που κλωνοποιήθηκε σε μια πρωτεΐνη σύντηξης GB-1, που κυμαίνεται από 12 έως 26 υπολείμματα σε μήκος. Σε αυτή τη μελέτη, χρησιμοποιήσαμε πεπτίδια διαφόρων μηκών, υδροφοβικότητας και προβλεπόμενης δευτερογενούς δομής για να αξιολογήσουμε την αποτελεσματικότητα της παραγωγής πεπτιδίων. Η θέση κλωνοποίησης για τα εισαγόμενα συνθετικά πεπτιδικά ολιγονουκλεοτίδια είναι Ο τερματικό στην περιοχή GB-1 και Ν τερματικό σε μια ετικέτα poly-6-his. Υπάρχουν τρία υπολείμματα μεθειονίνης σε κάθε κατασκευή σύντηξης, ένα στο Ν άκρο για την έναρξη της μεταγραφής (κωδόνιο έναρξης), το οποίο δεν διασπάται μετα-μεταφραστικά, και δύο υπολείμματα συναντώνται αμέσως Ν και C τερματικά στο πεπτίδιο ενδιαφέροντος, τα οποία κωδικοποιήθηκαν εντός του συνθετικού Ολιγονουκλεοτίδια DNA.


Πειραματικές Μέθοδοι

Υλικά

99,9% 12 C), 15 N απεμπλουτισμένο θειικό αμμώνιο (

99,95% 14 N), οξείδιο του δευτερίου D2Ο (99,9%), μυρμηκικό οξύ και πρωτεάση τύπου XIII από Aspergillus satoi ελήφθησαν από τη Sigma Aldrich (St. Louis, ΜΟ, ΗΠΑ). Tris, MOPS, NaCl, KCl, MgCl2MgSO4 ουρία, και διαλύτες HPLC υπερυψηλής καθαρότητας (νερό και ακετονιτρίλιο) για φασματομετρική ανάλυση μάζας ελήφθησαν από την VWR international (Suwanee, GA, USA).

Έκφραση και Καθαρισμός Πρωτεϊνών

Οι φορείς πλασμιδίου, οι οποίοι φέρουν τα γονίδια των υπομονάδων του συμπλέγματος τροπονίνης, εκφράστηκαν και καθαρίστηκαν ξεχωριστά από Ε. coli βακτήρια (στέλεχος BL21 DE3) όπως περιγράφηκε προηγουμένως. 35 – 37 Πρωτεΐνες με ισότοπα φυσικής αφθονίας εκφράστηκαν σε μέσο Luria Broth (LB). Επιπλέον, η TnC και η TnI εξαντλήθηκαν ισοτοπικά είτε στους 13 C (μονή εξάντληση) είτε στους 13 C και στους 15 N (διπλή εξάντληση). Για τις εξαντλημένες πρωτεΐνες, η έκφραση διεξήχθη σε ελάχιστο μέσο (Μ9) στο οποίο η μόνη πηγή άνθρακα είναι η γλυκόζη χωρίς 13C και η μόνη πηγή αζώτου είναι το θειικό αμμώνιο χωρίς 15Ν. Το μέσο Μ9 παρασκευάστηκε σε ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών 10 mM σε ρΗ 7,5, 10 mM NaCl, 20 mM (ΝΗ4)2ΕΤΣΙ42 mM MgSO40,1 mM CaCl2, 5 µM FeCl3, 4 g/L γλυκόζης και 3 mM βιταμίνη Β1. Τα κύτταρα BL21 αναπτύχθηκαν παρουσία αμπικιλλίνης στους 37 ° C. Σε οπτική πυκνότητα (OD)

0,6 στα 600 nm, η έκφραση προκλήθηκε με ισοπροπυλ β-D-1-θειογαλακτοπυρανοσίδη και αφέθηκε να προχωρήσει για επιπλέον 4 ώρες. Το μέσο φυγοκεντρήθηκε και το ίζημα επαναιωρήθηκε στο κατάλληλο ρυθμιστικό λύσης για καθαρισμό σύμφωνα με πρωτόκολλα που περιγράφηκαν προηγουμένως 35 – 37

Σύνθετη Ανασύσταση

Τέσσερα διαφορετικά σύμπλοκα τροπονίνης ανασυστάθηκαν: α) όλες οι υπομονάδες τροπονίνης C, T και I με ισότοπα φυσικής αφθονίας β) μόνο η TnC εξαντλήθηκε ισοτοπικά σε 13 C γ) μόνο η TnI εξαντλήθηκε ισοτοπικά στους 13 C και δ) τόσο η TnC όσο και η TnI ήταν ισοτοπικά εξαντλήθηκε σε 13 C. Το τελικό ρυθμιστικό διάλυμα ανασύστασης ήταν: 50 mM MOPS παρουσία 0,1 M KCl και 3 mM MgCl2 σε pH 7,2.

Προετοιμασία δείγματος και φασματομετρική ανάλυση μάζας

Καθένα από τα προαναφερθέντα σύμπλοκα (4 µM) υπέστη πέψη για 2 λεπτά με πρωτεάση XIII που παρασκευάστηκε σε 2% μυρμηκικό οξύ σε 4,5 mg/mL. 38 Το τελικό pH του διαλύματος ήταν

2.3. Το προϊόν πέψης εγχύθηκε σε ProZap C18 στήλη και εκλούστηκε στα 300 µL/min με σύντομη, 1,5 min βαθμίδωση (2% έως 95% ακετονιτρίλιο) για να ελαχιστοποιηθεί η αντίστροφη ανταλλαγή. 12 Το υγρό έκλουσης διαιρέθηκε μετά τη στήλη (1:100) και εισήχθη σε ένα υβριδικό φασματόμετρο μάζας 14,5 Τ LTQ-FT-ICR με ιονισμό μικρο-ηλεκτροψεκασμού. 39 Η ίδια διαδικασία ακολουθήθηκε για τα πειράματα HDX, ωστόσο, τα σύμπλοκα επωάστηκαν είτε για 1 λεπτό είτε για 8 ώρες σε δευτεριωμένο ρυθμιστικό διάλυμα πριν από την απόσβεση και την πέψη. Η φασματομετρία μάζας FT-ICR παρέχει ακρίβεια μάζας κάτω από ppm και εξαιρετικά υψηλή ισχύ ανάλυσης μάζας (m/Δm50% = 200.000 σε m/z 400, όπου m είναι η μάζα ιόντων και Δm50% είναι η φασματική κορυφή μάζας πλήρους πλάτους στο μισό μέγιστο ύψος κορυφής). Τα δεδομένα συλλέχθηκαν από το λογισμικό X-calibur (Thermo-Fisher) και αναλύθηκαν με προσαρμοσμένη διαδικασία. 23 Όλα τα βήματα του πειράματος HDX αυτοματοποιήθηκαν από ένα ρομπότ (τεχνολογίες LEAP) για την εξάλειψη του ανθρώπινου λάθους και την τυποποίηση του χρονισμού. 40 Κάθε πείραμα εκτελέστηκε εις τριπλούν για να προσδιοριστεί η αναπαραγωγιμότητα.


Εισαγωγή

Αν και το φθόριο είναι άφθονο στο περιβάλλον, δεν είναι θρεπτικό συστατικό ούτε αποτελεί χαρακτηριστικό της βιοχημείας για τα περισσότερα είδη [1]. Αυτό αντανακλά τη χαμηλή βιοδιαθεσιμότητα του, καθώς βρίσκεται τυπικά σε αδιάλυτα μέταλλα, και τις φυσικοχημικές του ιδιότητες, ιδιαίτερα το υψηλό δυναμικό οξειδοαναγωγής και την κακή αντιδραστικότητα του ιόντος φθορίου σε υδατικό διάλυμα. Παρά την σχεδόν απουσία του στη βιολογία, είναι ένα ιδιαίτερα σημαντικό στοιχείο στον ευρύτερο χώρο της χημικής βιολογίας [2]. Πολλές εμπορικές και βιομηχανικές ενώσεις είναι φθοριούχες, συμπεριλαμβανομένων ψυκτικών, απολιπαντικών, φαρμάκων, φυτοφαρμάκων και αντικολλητικών υλικών, και κατά συνέπεια υπάρχει υψηλός βαθμός αλληλεπίδρασης μεταξύ φθοριούχων ενώσεων και φύσης [3]. Επιπλέον, λόγω της έλλειψης φυσικώς απαντώμενων φθοριωμένων ενώσεων, το φθόριο είναι ένας χρήσιμος ανιχνευτής για τη διερεύνηση της δομής και του μηχανισμού των βιολογικών μορίων. Κεντρική θέση σε αυτές τις μελέτες είναι η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού φθορίου-19 (19 F NMR), η οποία επιτρέπει στον χρήστη να οπτικοποιεί εύκολα τις αλλαγές στη χημική μετατόπιση και το μοτίβο διάσπασης ανάλογα με τις αλλαγές του (βιολογικού) περιβάλλοντος, χωρίς ουσιαστικό καθαρισμό ή επεξεργασία δειγμάτων . Το 2009 δημοσιεύσαμε μια ανασκόπηση που περιγράφει την εφαρμογή του 19 F NMR στη χημική βιολογία [4] και εδώ παρουσιάζουμε τις προόδους που έχουν γίνει σε αυτόν τον τομέα από τότε.


Ο έλεγχος φαρμάκων σε ανθρώπινα κύτταρα με φασματοσκοπία NMR επιτρέπει την έγκαιρη αξιολόγηση της ισχύος του φαρμάκου

Η ανάπτυξη φαρμάκου με βάση τη δομή συχνά παρεμποδίζεται από την έλλειψη in vivo δραστικότητας των υποσχόμενων ενώσεων που ελέγχονται in vitro, λόγω χαμηλής διαπερατότητας μεμβράνης ή κακής επιλεκτικότητας ενδοκυτταρικής δέσμευσης. Εδώ, δείχνουμε ότι η διαλογή προσδέματος μπορεί να πραγματοποιηθεί σε ζωντανά ανθρώπινα κύτταρα με φασματοσκοπία NMR «παρατηρούμενη από ενδοκυτταρική πρωτεΐνη», χωρίς να απαιτούνται μετρήσεις ενζυματικής δραστηριότητας ή άλλες κυτταρικές δοκιμασίες. Οι ποσοτικές πληροφορίες δέσμευσης λαμβάνονται με γρήγορα, φθηνά πειράματα 1Η NMR, παρέχοντας ενδοκυτταρικές καμπύλες δέσμευσης συνδέτη που εξαρτώνται από τη δόση και το χρόνο, από τις οποίες λαμβάνονται κινητικές και θερμοδυναμικές παράμετροι που συνδέονται με τη διαπερατότητα των κυττάρων και τη συγγένεια και την εκλεκτικότητα δέσμευσης. Η προσέγγιση εφαρμόστηκε στην καρβονική ανυδράση και, κατ' αρχήν, μπορεί να επεκταθεί σε οποιονδήποτε ενδοκυτταρικό στόχο που μπορεί να παρατηρηθεί με NMR. Τα αποτελέσματα που λαμβάνονται σχετίζονται άμεσα με την ισχύ των υποψηφίων φαρμάκων, δηλαδή την απαιτούμενη δόση. Η εφαρμογή αυτής της προσέγγισης σε πρώιμο στάδιο του αγωγού σχεδιασμού φαρμάκων θα μπορούσε να αυξήσει σημαντικά το χαμηλό ποσοστό επιτυχίας της σύγχρονης ανάπτυξης φαρμάκων.

Ο ορθολογικός σχεδιασμός του φαρμάκου απαιτεί διαλογές με βάση συνδέτη και δομικές μελέτες βασισμένες σε πρωτεΐνες για να χαρακτηριστεί η δέσμευση στην πρωτεΐνη στόχο, ακολουθούμενη από βελτιστοποίηση μολύβδου για αύξηση της σταθεράς δέσμευσης. Η ικανότητα επίτευξης ενδοκυτταρικών στόχων πρέπει στη συνέχεια να αξιολογηθεί με ad hoc κυτταρικές δοκιμασίες. Τα περισσότερα υποψήφια φάρμακα αποτυγχάνουν εδώ ή σε μεταγενέστερα στάδια, λόγω της έλλειψης δραστηριότητας στα κύτταρα ή της εμφάνισης ανεπιθύμητων ενεργειών in vivo. 1 Τέτοιες αστοχίες συχνά συνδέονται με κακή διαπερατότητα μεμβράνης ή/και με την έλλειψη ειδικότητας δέσμευσης στο κυτταρικό περιβάλλον. Η φασματοσκοπία πυρηνικού μαγνητικού συντονισμού (NMR) που εφαρμόζεται σε ζωντανά κύτταρα 2-6 έχει τη δυνατότητα να ξεπεράσει αυτά τα κρίσιμα σημεία συμφόρησης, καθώς μπορεί να παρατηρήσει άμεσα τις αλληλεπιδράσεις μακρομορίου-προσδέματος σε ατομική ανάλυση εντός του κυτταρικού περιβάλλοντος. 2, 7, 8 Εδώ, αναφέρουμε μια προσέγγιση για την πραγματοποίηση διαλογής προσδέματος που παρατηρείται από πρωτεΐνες με NMR απευθείας στο κυτταρόπλασμα ζώντων ανθρώπινων κυττάρων. Η προσέγγιση επιτρέπει την αξιολόγηση της διαπερατότητας της μεμβράνης και της εξειδίκευσης της ενδοκυτταρικής δέσμευσης των υποψηφίων φαρμάκων, η οποία δεν μπορεί να συναχθεί από ανάλυση in vitro και μπορεί να αποκαλύψει ενδιαφέρουσα και εντυπωσιακά διαφορετική συμπεριφορά για ενώσεις που έχουν παρόμοιες ιδιότητες in vitro.

Εφαρμόσαμε τη μέθοδο στη διαλογή των αναστολέων της δεύτερης ισομορφής της ανθρώπινης ανθρακικής ανυδράσης (CA2). Στον άνθρωπο υπάρχουν 15 ισομορφές CA, 9 πολλές από τις οποίες είναι σχετικοί στόχοι φαρμάκων που εμπλέκονται σε διάφορες παθολογίες. 10-14 Μέχρι σήμερα, αρκετοί αναστολείς CA χορηγούνται τακτικά στη θεραπεία του γλαυκώματος, της επιληψίας ή ως διουρητικά, 15, 16 με μερικούς από αυτούς σε κλινική ανάπτυξη ως αντικαρκινικοί παράγοντες, 17, 18 Προκειμένου να ανιχνευθεί το CA2 με NMR, Η πρωτεΐνη εκφράστηκε απευθείας και επισημάνθηκε στο κυτταρόπλασμα των ανθρώπινων κυττάρων (δείτε την ενότητα Πειραματικές Μέθοδοι στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες). 19, 20 σήματα NMR που προκύπτουν από [15 N]-CA2 ανιχνεύθηκαν ξεκάθαρα στα φάσματα συσχέτισης 1 H-15 N (Υποστηρικτικές πληροφορίες, Εικόνα S1), υποδεικνύοντας ότι η ενδοκυτταρική πρωτεΐνη είναι διαλυτή και απαλλαγμένη από αλληλεπιδράσεις με κυτταρικά συστατικά αργής ανατροπής , που διαφορετικά θα αύξανε την εγκάρσια χαλάρωση και θα προκαλούσε διεύρυνση του σήματος πέρα ​​από την ανίχνευση. 21 Σήματα από αμιδικά πρωτόνια πλευρικής αλυσίδας ιστιδίνης βραδείας ανταλλαγής που βρίσκονται στην ενεργό θέση ανιχνεύθηκαν ξεκάθαρα σε μια περιοχή χωρίς φόντο του φάσματος 1D 1 H NMR μεταξύ 11 και 16 ppm, επιτρέποντας την παρακολούθηση των αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-συνδέτη χωρίς την ανάγκη ισοτοπική επισήμανση (Υποστηρικτικές πληροφορίες, Εικόνα S2).

Η αλληλεπίδραση μεταξύ του ενδοκυτταρικού CA2 και δύο εγκεκριμένων φαρμάκων, της ακεταζολαμίδης (ΑΑΖ) και μεθαζολαμίδη (MZA), παρακολουθήθηκε με 1Η-15Ν NMR. Φάσματα από κύτταρα που εκφράζουν [15N]-CA2 κατεργασμένα με περίσσεια ΑΑΖ ή MZA έδειξε σαφείς διαφορές σε σύγκριση με τα μη επεξεργασμένα κύτταρα, υποδεικνύοντας ότι και τα δύο φάρμακα είχαν δεσμεύσει την ενδοκυτταρική πρωτεΐνη (Εικόνα 1 α, β). Η αναστολή του ενδοκυτταρικού CA2 επιβεβαιώθηκε από το ολικό CO2 δραστικότητα ενυδάτωσης που μετρήθηκε με διακοπή ροής, η οποία μειώθηκε σε μεγάλο βαθμό σε προϊόντα λύσης από κύτταρα που εκφράζουν CA2 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με αναστολέα σε σχέση με κύτταρα που δεν είχαν υποστεί αγωγή (Υποστηρικτικές Πληροφορίες, Εικόνα S3). In vitro, τιτλοδότηση του CA2 με ένα ισοδύναμο του ΑΑΖ ή MZA οδήγησε σε ποσοτική δέσμευση (Υποστηρικτικές πληροφορίες, Εικόνα S4), σύμφωνη με τις σταθερές νανομοριακής διάστασης (κρε AAZ =12,5±1,0 n m κρε MZA =14±0,9 n m, δείτε την ενότητα Πειραματικές Μέθοδοι στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες). Η αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-προσδέματος μπορεί να χαρτογραφηθεί στο επίπεδο ενός υπολείμματος με ανάλυση διαταραχής χημικής μετατόπισης (CSP). Η υψηλή ομοιότητα μεταξύ γραφημάτων CSP εντός κυττάρων και in vitro αποκάλυψε ότι και οι δύο συνδέτες συνδέονται με το ενδοκυτταρικό CA2 με σχεδόν πανομοιότυπο τρόπο με τον in vitro (Υποστηρικτικές πληροφορίες, Εικόνα S5), που είναι επίσης συνεπής με την ατομική δομή των προσαγωγών πρωτεΐνης-φαρμάκου αναφέρθηκε προηγουμένως (Εικόνα 1 δ). 22

Επικάλυψη φασμάτων NMR 1 H- 15 N κυττάρων που εκφράζουν [15 N]-CA2 απουσία προσδεμάτων (μαύρο) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1 ώρα με α) 100 μ m ΑΑΖ (κόκκινο) β) 100 μ m MZA (πορφύρα βαφή). Ορισμένες κορυφές που μετατοπίζονται κατά τη δέσμευση συνδέτη επισημαίνονται. γ) Περιοχή Imino των φασμάτων 1D 1 H NMR του μη επισημασμένου ενδοκυτταρικού CA2 απουσία συνδετών (μαύρων) και δεσμευμένων σε ΑΑΖ (κόκκινο) ή MZA (πορφύρα βαφή). Οι κορυφές που χρησιμοποιούνται για την απόκτηση καμπύλης σύνδεσης σημειώνονται με βέλη. δ) Ενεργή προβολή τοποθεσίας του CA2/ΑΑΖ σύμπλοκο (PDB 3HS4): το καταλυτικό ιόν ψευδαργύρου (πορτοκαλί σφαίρα) βρίσκεται στο άκρο μιας μεγάλης, κωνικής κοιλότητας κοντά στο κέντρο της πρωτεΐνης και εμφανίζει τετραεδρικό συντονισμό με τρία διατηρημένα υπολείμματα ιστιδίνης και, στην ενεργό μορφή, ένα μόριο νερού /ιόν υδροξειδίου ως τέταρτος συνδετήρας. 9 Το τελευταίο αντικαθίσταται από το αποπρωτονιωμένο σουλφοναμιδικό άζωτο στο προϊόν προσθήκης ενζύμου/αναστολέα. Το SO2Το τμήμα NH − δεσμεύεται επιπλέον ως δότης στο τμήμα ΟΗ και ως δέκτης στο αμιδικό NH του υπολείμματος Thr199.

Δέσμευση του ΑΑΖ και MZA στο μη επισημασμένο CA2 στο καθεστώς αργής ανταλλαγής παρατηρήθηκε ξεκάθαρα στην ιμινο περιοχή των φασμάτων 1D 1 H NMR, τόσο σε κύτταρα όσο και in vitro, λόγω της εγγύτητας των παρατηρούμενων πυρήνων στη θέση δέσμευσης του συνδέτη (Εικόνα 1 c,d και Υποστηρικτικές πληροφορίες, Εικόνα S6 a,b). Παρά τη γνωστή τους εξάρτηση από το pH, αυτοί οι πυρήνες αποδείχθηκαν εξαιρετικοί ανταποκριτές των ελεύθερων και δεσμευμένων καταστάσεων του CA2 (Υποστηρικτικές πληροφορίες, Εικόνα S6 c). Ο εκπληκτικά καλός διαχωρισμός σήματος μεταξύ ελεύθερων και δεσμευμένων καταστάσεων, παρά τις ευρύτερες φασματικές γραμμές των φασμάτων NMR εντός κυψέλης, επέτρεψε την ανάκτηση της περιοχής κάτω από κάθε κορυφή με ανάλυση αποσυνέλιξης (Υποστηρικτικές πληροφορίες, Σχήμα S7). Τα απλά φάσματα 1D 1 H NMR θα μπορούσαν επομένως να παρέχουν μια ποσοτική μέτρηση των ελεύθερων και δεσμευμένων σε πρόσδεμα κλασμάτων του ενδοκυτταρικού CA2, παρέχοντας μια στρατηγική λιγότερο έντασης χρόνου και κόστους σε σύγκριση με το 2D 1H-15 N NMR.

Ακολούθως εφαρμόστηκε ανάλυση 1Η εντός κυττάρων NMR και αποσυνέλιξης για τη διαλογή μεγαλύτερου συνόλου αναστολέων CA, επιλεγμένων μεταξύ των παραγώγων σουλφοναμιδίου που αναφέρθηκαν πρόσφατα, για τα οποία η συγγένεια δέσμευσης στο CA2 είχε προηγουμένως χαρακτηριστεί in vitro και κυμαινόταν από χαμηλή σε νανομοριακή έως υψηλή -μικρομοριακό (Εικόνα 2). 23-25 ​​Για να διαπιστωθεί εάν αυτή η προσέγγιση θα μπορούσε να διακρίνει τους συνδέτες με βάση την κυτταρική τους διαπερατότητα, ένας αναστολέας CA (C18) που δεν μπορεί να διαχυθεί μέσω της πλασματικής μεμβράνης συμπεριλήφθηκε επίσης. Εντυπωσιακά, προέκυψαν δύο κατηγορίες προσδεμάτων, που δεν συσχετίστηκαν με τις διαφορές στη συγγένεια δέσμευσης: αυτοί που δεσμεύουν το ενδοκυτταρικό CA2 ποσοτικά, παρόμοια με ΑΑΖ και MZA (1, 3, και 4, Εικόνα 3), και εκείνα για τα οποία η δέσμευση είναι αμελητέα, παρόμοια με C18 (2, 5, 6, 7, και 8, Υποστηρικτικές πληροφορίες, Εικόνα S8). Συγκριτικά, η δέσμευση συνδέτη παρατηρήθηκε καθαρά in vitro, τόσο στα φάσματα 1Η-15Ν όσο και στα φάσματα 1Η NMR (Υποστηρικτικές Πληροφορίες, Εικόνα S9).

Οι αναστολείς CA που προέρχονται από σουλφοναμίδιο αναλύθηκαν σε αυτή τη μελέτη. κΕγώ έχουν αναφερθεί μετρήσεις in vitro για CA2 (δείτε την ενότητα Πειραματικές Μέθοδοι στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες).

Περιοχή Imino των φασμάτων 1D 1 H NMR κυττάρων που εκφράζουν CA2 απουσία υποκαταστατών (μαύρο) και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία με 100 μ m από κάθε συνδέτη για 1 ώρα, δείχνοντας πλήρη δέσμευση στο ενδοκυτταρικό CA2: ΑΑΖ (το κόκκινο), MZA (ματζέντα) και συνδετήρες 1, 3, 4 (μπλε). Οι κορυφές που χρησιμοποιούνται για τη λήψη καμπυλών σύνδεσης σημειώνονται με βέλη.

Ως εκ τούτου, ένας απλός έλεγχος υψηλής δόσης συνδέτη με 1Η εντός κυττάρου NMR θα μπορούσε να κάνει διάκριση μεταξύ «επιτυχών» και «αποτυχημένων» αναστολέων χωρίς επανάληψη σε οποιαδήποτε δοκιμασία κυτταρικής δραστηριότητας, παρατηρώντας απευθείας την ενδοκυτταρική δέσμευση. Ωστόσο, δεν δόθηκαν πληροφορίες σχετικά με τους λόγους για τους οποίους ορισμένοι συνδέτες, ακόμη και αυτοί με υψηλή in vitro συγγένεια, δεν δεσμεύουν καθόλου το ενδοκυτταρικό CA2. Ενώ αρκετά φαινόμενα θα μπορούσαν να εμποδίσουν έναν συνδέτη από τη δέσμευση ενός ενδοκυτταρικού στόχου, οι πιο πιθανοί λόγοι είναι η χαμηλή διαπερατότητα της πλασματικής μεμβράνης και η χαμηλή ειδικότητα δέσμευσης στον στόχο, δηλαδή η παρουσία άλλων ενδοκυτταρικών μορίων με σχετικά υψηλή συγγένεια για το ίδιο συνδέτης. Για να παρασχεθεί μια μηχανιστική υπόθεση σχετικά με τη συμπεριφορά των «αποτυχημένων» προσδεμάτων, οι «επιτυχείς» συνδέτες αναλύθηκαν με ενδοκυτταρικό NMR με τρόπο δοσοεξαρτώμενο και με τρόπο που εξαρτάται από το χρόνο. Πρώτον, κύτταρα που εκφράζουν CA2 και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1 ώρα με αυξανόμενες συγκεντρώσεις κάθε συνδέτη αναλύθηκαν με 1Η εντός κυττάρου NMR και φασματική αποσυνέλιξη. Εκτός ΑΑΖ, όλοι οι συνδέτες ακολούθησαν μια κοινή τάση, παρουσιάζοντας ατελή δέσμευση σε χαμηλές δόσεις και φθάνοντας στην πλήρη δέσμευση περίπου στα 5-15 μ m (Εικόνα 4 α-ε). Στις χαμηλότερες συγκεντρώσεις συνδέτη, η ατελής δέσμευση μπορεί να οφείλεται σε χαμηλότερη από μία μοριακή αναλογία συνδέτη προς CA2. Παραδόξως, ΑΑΖ οδήγησε σε μια πολύ πιο ρηχή δοσοεξαρτώμενη καμπύλη δέσμευσης, που δεν εμφανίζει δέσμευση κάτω από 10 μ m και πλήρη δέσμευση μόνο περίπου περίπου 75 μ m . Ατελής δέσμευση του ΑΑΖ σε υψηλότερες μοριακές αναλογίες υποδηλώνει ότι είτε διαχέεται αργά μέσω της πλασματικής μεμβράνης είτε συνδέεται ισχυρά με άλλα ενδοκυτταρικά μόρια. Ενώ η δέσμευση ανταγωνισμού είναι ένα αποτέλεσμα ισορροπίας, η κινητική αργής διάχυσης θα πρέπει να παρατηρείται σε πειράματα δέσμευσης που εξαρτώνται από το χρόνο σε σταθερή συγκέντρωση συνδέτη. Πράγματι, η επεξεργασία των κυττάρων είτε με 27 μ m ΑΑΖ ή 2 μ m MZA για αυξανόμενες χρονικές περιόδους οδήγησαν σε σαφείς χρονοεξαρτώμενες καμπύλες δέσμευσης (Εικόνα 5). Οι καμπύλες που εξαρτώνται από τη δόση και το χρόνο θα μπορούσαν στη συνέχεια να προσαρμοστούν με ένα κινητικό μοντέλο για να ληφθούν συντελεστές διαπερατότητας μεμβράνης, αποκαλύπτοντας ότι ΑΑΖ διαχέεται περίπου 12 φορές πιο αργά από MZA (Εικόνα 4 στ). Καθώς και τα δύο μόρια διαχέονται παθητικά μέσω της πλασματικής μεμβράνης και δεν βασίζονται στην ενεργό μεταφορά, 26 τέτοια εντυπωσιακά διαφορετική συμπεριφορά θα πρέπει τελικά να επηρεάσει τη διαπερατότητα του φαρμάκου στους ανθρώπινους ιστούς. Πράγματι, η παρατηρούμενη διαφορά αντανακλάται στις φαρμακοκινητικές ιδιότητες των δύο φαρμάκων, καθώς η συνιστώμενη δοσολογία για ΑΑΖ στη θεραπεία του γλαυκώματος είναι περίπου 10 φορές υψηλότερη από αυτή του MZA. 27 Επομένως, η κινητική της διάχυσης της μεμβράνης μπορεί να επηρεάσει σε μεγάλο βαθμό τη συμπεριφορά διαφορετικών προσδεμάτων, ανεξάρτητα από τη συγγένεια δέσμευσής τους για τον ενδοκυτταρικό στόχο. Είναι ενδιαφέρον ότι όλοι οι «αποτυχημένοι» υποκαταστάτες που εξετάστηκαν εδώ μοιράζονται μια αζωτούχα βάση, είτε μια ουρακίλη (2, 6, 7, και 8) ή αδενίνη (5) ως κοινό χαρακτηριστικό και έχουν πολύ χαμηλότερη προβλεπόμενη διαπερατότητα δέρματος από τους «επιτυχείς» συνδέτες (Εικόνα 4 στ), υποδηλώνοντας έτσι ότι η έλλειψη δέσμευσης των πρώτων είναι πιθανώς συνέπεια μιας εξαιρετικά αργής διάχυσης μέσω της πλασματικής μεμβράνης.

α–ε) Καμπύλες δέσμευσης εξαρτώμενες από τη δόση που παρατηρήθηκαν σε κύτταρα που εκφράζουν CA2 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 1 ώρα με διαφορετικούς συνδέτες σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις, προσαρμοσμένες σε μια εξαρτώμενη από το χρόνο ισορροπία δέσμευσης (Δείτε την ενότητα Πειραματικές Μέθοδοι στις Υποστηρικτικές Πληροφορίες). Κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει την περιοχή κάτω από μια μεμονωμένη κορυφή στην ιμινο περιοχή των φασμάτων NMR εντός κυττάρου 1D 1 H, κανονικοποιημένη στη συνολική φασματική περιοχή. στ) Σταθερά διάστασης μετρούμενη in vitro (κρε), συντελεστής διαπερατότητας × εμβαδόν μεμβράνης (κΠ ΕΝΑ) που προκύπτει από την προσαρμογή της καμπύλης και τον προβλεπόμενο συντελεστή διαπερατότητας του δέρματος (log κΠ) για κάθε μόριο. Τα «αποτυχημένα» μόρια συσχετίζονται με χαμηλότερη διαπερατότητα του δέρματος (εμφανίζεται με έντονους χαρακτήρες).

Χρονοεξαρτώμενες καμπύλες δέσμευσης που παρατηρήθηκαν σε κύτταρα που εκφράζουν CA2 που υποβλήθηκαν σε επεξεργασία είτε με 27 μ m ΑΑΖ (α) ή 2 μ m MZA (β) για αυξανόμενες χρονικές περιόδους. Δέσμευση του ΑΑΖ ήταν εφοδιασμένο με δέσμευση ισορροπίας δέσμευσης που εξαρτάται από το χρόνο του MZA εφοδιάστηκε με μια εξαρτώμενη από το χρόνο διάχυση σε ανεπάρκεια εξωτερικού συνδετήρα σε σχέση με την πρωτεΐνη (Δείτε την ενότητα Πειραματικές Μέθοδοι των Υποστηρικτικών πληροφοριών). Κάθε κουκκίδα αντιπροσωπεύει την περιοχή κάτω από μια μεμονωμένη κορυφή στην ιμινο περιοχή των φασμάτων NMR εντός κυττάρου 1D 1 H, κανονικοποιημένη στη συνολική φασματική περιοχή.

Μόλις τα κύτταρα αναλυθούν υπό συνθήκες σταθερής κατάστασης, δηλαδή αφού ο συνδέτης είχε αρκετό χρόνο για να φτάσει στον ενδοκυτταρικό στόχο, η καμπύλη δέσμευσης εντός κυττάρων μπορεί να προσαρμοστεί για να ληφθεί μια προφανής κρε. Σύγκριση με το κρε που προσδιορίζεται in vitro θα αποκάλυπτε την έκταση της ανταγωνιστικής δέσμευσης, παρέχοντας έτσι ένα μέτρο της εξειδίκευσης της ενδοκυτταρικής δέσμευσης. Για να αποκτήσετε ένα ουσιαστικό φαινόμενο κρε, η μοριακή αναλογία συνδέτη προς πρωτεΐνη πρέπει να είναι υψηλότερη από μία. Για το σκοπό αυτό, χρήσιμες καμπύλες δέσμευσης μπορούν να ληφθούν από κύτταρα που εκφράζουν την πρωτεΐνη στόχο σε χαμηλότερα επίπεδα. Πράγματι, κύτταρα που εκφράζουν περίπου 3 φορές χαμηλότερο επίπεδο CA2 και υποβλήθηκαν σε επεξεργασία για 2 ώρες με συγκεντρώσεις MZA που κυμαίνονταν από 0,1 έως 2 μ m οδήγησαν σε μια πιο απότομη καμπύλη δέσμευσης σε σύγκριση με κύτταρα με υψηλά επίπεδα CA2, δίνοντας μια προφανή κρε παρόμοιο, εντός του σφάλματος, με αυτό που μετρήθηκε in vitro (Υποστηρικτικές πληροφορίες, Εικόνα S10 a,b). Είναι ενδιαφέρον ότι η θεραπεία με 4 υπό τις ίδιες συνθήκες είχε ως αποτέλεσμα μια φαινομενική κρε≈20 φορές υψηλότερο από το in vitro, υποδηλώνοντας έτσι ότι άλλα μόρια μπορεί να ανταγωνίζονται για τη δέσμευση 4 εντός του κελιού (Υποστηρικτικές πληροφορίες, Εικόνα S10 c,d). Επομένως, οι καμπύλες ποσοτικής δέσμευσης που λαμβάνονται με NMR μπορούν να παρέχουν σημαντικές πληροφορίες για να περιγράψουν την κινητική και τη θερμοδυναμική της δέσμευσης ενδοκυτταρικού συνδετήρα.

Τέλος, για να εκτιμηθεί σε ποιο βαθμό η προσέγγιση της «παρατηρούμενης από την ενδοκυτταρική πρωτεΐνη» προσέγγιση μπορεί να γενικευτεί σε άλλους ενδοκυτταρικούς στόχους, η δέσμευση συνδέτη δοκιμάστηκε σε ενδοκυτταρικό CA1. Ενώ το CA1 έφτασε σε χαμηλότερα επίπεδα έκφρασης από το CA2, τα πρωτόνια αμιδίου ιστιδίνης εξακολουθούσαν να ανιχνεύονται στα φάσματα 1D 1 H NMR και τα ελεύθερα και τα δεσμευμένα είδη μπορούσαν να διαχωριστούν σαφώς (Υποστηρικτικές πληροφορίες, Εικόνα S11). Ως εκ τούτου, η προσέγγιση θα πρέπει να είναι εφαρμόσιμη σε άλλες ενδοκυτταρικές ισομορφές CA, οι οποίες περιέχουν διατηρημένες ιστιδίνες που δεσμεύουν ψευδάργυρο, και κατ' αρχήν σε οποιαδήποτε άλλη πρωτεΐνη που προκαλεί σήματα 1Η κάτω από το πεδίο περίπου 11 ppm 19 ή σε οποιαδήποτε φασματική περιοχή χωρίς υπόβαθρο. Γενικότερα, με την επανάληψη των στρατηγικών επιλεκτικής ισοτοπικής σήμανσης, όπως η επισήμανση τύπου αμινοξέος [13C]-μεθυλ ή [15N]-επισήμανση, αυτή η προσέγγιση μπορεί να εφαρμοστεί σε οποιαδήποτε διαλυτή ενδοκυτταρική πρωτεΐνη, με την προϋπόθεση ότι τουλάχιστον ένα σήμα είναι παρατηρήσιμο με NMR εντός των κυττάρων και είναι ευαίσθητο στη δέσμευση συνδέτη.

Εδώ, δείχνουμε ότι η διαλογή συνδέτη μπορεί να πραγματοποιηθεί σε ανθρώπινα κύτταρα προς μια συγκεκριμένη πρωτεΐνη με NMR "παρατηρούμενη από την ενδοκυτταρική πρωτεΐνη". Από την πρώτη απόδειξη της αρχής στα ανθρώπινα κύτταρα, η εφαρμογή NMR 2 εντός κυττάρου σε διαλογή προσδέματος που παρατηρείται από πρωτεΐνες έχει περιοριστεί στα βακτήρια. 28 Η προσέγγιση που παρουσιάζεται εδώ επιτρέπει αποτελεσματικό σε βάθος έλεγχο φαρμάκων σε ανθρώπινα κύτταρα για την αξιολόγηση των δυνατοτήτων ενδοκυτταρικής δέσμευσης στόχου, και παρέχει επίσης έναν τρόπο χαρακτηρισμού τους με πιο ποσοτικούς όρους, χωρίς να επαναλαμβάνεται η χημική επισήμανση της πρωτεΐνης. 29 Η τρέχουσα χαμηλή απόδοση της προσέγγισης μπορεί να βελτιωθεί σημαντικά με την αύξηση της αυτοματοποίησης (για παράδειγμα, μέσω της χρήσης ενός ελεγχόμενου με θερμοκρασία εναλλάκτη δειγμάτων NMR) και με την ταυτόχρονη εξέταση πολλαπλών υποκαταστατών (για παράδειγμα, μέσω μεθόδων μήτρας 28 ). Είναι σημαντικό ότι αυτή η μέθοδος δεν βασίζεται σε μετρήσεις ενζυματικής δραστηριότητας. Ως εκ τούτου, παρέχει έναν μοναδικό καινοτόμο τρόπο αξιολόγησης της αποτελεσματικότητας των φαρμάκων και έναντι μη ενζυματικών στόχων, καθένας από τους οποίους απαιτεί κατά τα άλλα να καθιερωθούν έμμεσες κυτταρικές αναλύσεις, όπως προσδιορισμοί πολλαπλασιασμού, εισβολής και βιωσιμότητας/απόπτωσης κυττάρων. Τελικά, αφού ενταχθεί στο πλαίσιο του σύγχρονου αγωγού ανάπτυξης φαρμάκων, αυτή η μέθοδος θα μπορούσε να επιτρέψει την αξιολόγηση της ισχύος ενός υποψήφιου φαρμάκου, δηλαδή της ποσότητας του φαρμάκου που απαιτείται για να ασκήσει ένα αποτέλεσμα δεδομένης έντασης, σε ένα κλινικά σχετικό εύρος συγκέντρωσης (0,1– 100 μ m). Αυτή η ικανότητα πρόβλεψης θα επέτρεπε τη βελτιστοποίηση της ισχύος σε προγενέστερο στάδιο του αγωγού σε σύγκριση με τις αναλύσεις που βασίζονται σε κύτταρα και ζώα.

Ευχαριστίες

Αυτή η εργασία έχει υποστηριχθεί από το iNEXT, με αριθμό επιχορήγησης 653706, που χρηματοδοτείται από το πρόγραμμα Horizon 2020 της Ευρωπαϊκής Επιτροπής, και από το Instruct-ULTRA, με αριθμό επιχορήγησης 731005, ένα έργο EU H2020 για περαιτέρω ανάπτυξη των υπηρεσιών της Instruct-ERIC. Οι συγγραφείς αναγνωρίζουν την υποστήριξη και τη χρήση των πόρων του Instruct-ERIC, ενός έργου Landmark ESFRI, και συγκεκριμένα του CERM/CIRMMP Italy Centre.

Σύγκρουση συμφερόντων

Οι συγγραφείς δηλώνουν ότι δεν υπάρχει σύγκρουση συμφερόντων.

Ως υπηρεσία προς τους συγγραφείς και τους αναγνώστες μας, αυτό το περιοδικό παρέχει υποστηρικτικές πληροφορίες που παρέχονται από τους συγγραφείς. Τέτοιο υλικό ελέγχεται από ομοτίμους και μπορεί να αναδιοργανωθεί για ηλεκτρονική παράδοση, αλλά δεν υποβάλλεται σε επεξεργασία αντιγραφής ή στοιχειοθέτηση. Θέματα τεχνικής υποστήριξης που προκύπτουν από υποστηρικτικές πληροφορίες (εκτός από αρχεία που λείπουν) θα πρέπει να απευθύνονται στους συγγραφείς.

Ονομα αρχείου Περιγραφή
anie201913436-sup-0001-misc_information.pdf33,7 MB Συμπληρωματικός

Σημείωση: Ο εκδότης δεν είναι υπεύθυνος για το περιεχόμενο ή τη λειτουργικότητα οποιωνδήποτε υποστηρικτικών πληροφοριών που παρέχονται από τους συγγραφείς. Οποιεσδήποτε ερωτήσεις (εκτός από το περιεχόμενο που λείπει) θα πρέπει να απευθύνονται στον αντίστοιχο συγγραφέα για το άρθρο.


Γιατί απαιτείται ισοτοπική σήμανση αζώτου για πρωτεϊνικό NMR; - Βιολογία

Το διαδικτυακό υλικό για αυτή τη διάλεξη βρίσκεται στη διεύθυνση http://www.cryst.bbk.ac.uk/

NMR για Κρυσταλλογράφους

Ph.D. Τάξη Τεχνικών 28 Οκτωβρίου 2003.

  1. Να περιγράψει τη βάση της Φασματοσκοπίας NMR
  2. Να συγκρίνουν το NMR και την κρυσταλλογραφία ακτίνων Χ ως μέσο προσδιορισμού της δομής
  3. Εισαγωγή άλλων χρήσεων για το NMR στη βιοχημεία και τη δομική βιολογία

Στο τέλος της συνεδρίας οι μαθητές θα πρέπει να γνωρίζουν σε τι μπορεί να χρησιμοποιηθεί το NMR και πώς να προετοιμάσουν ένα δείγμα για ένα αρχικό φάσμα NMR

Ένα καλό εγχειρίδιο για μακρομοριακό NMR με ένα μείγμα θεωρίας και αποτελεσμάτων

Jeremy N.S. Evans Biomolecular NMR Spectroscopy Oxford University Press 1995 ISBN 0 19 854766 8

Μια απλούστερη πρακτική εισαγωγή στο μακρομοριακό NMR βρίσκεται στο

NMR of macromolecules: A πρακτική προσέγγιση ed GCK Roberts Oxford 1993

Δίνεται μια πολύ πιο μαθηματική επεξεργασία της θεωρίας

Protein NMR Spectroscopy J. Cavanagh, WJ Fairbrother, AG Palmer III, NJ Shelton. Academic Press 1996

Introduction to NMR Spectroscopy

Nuclear magnetic resonance depends on the quantum mechanical property of nuclear spin. This is quantised spin angular momentum, which confers a magnetic moment on a nucleus in a magnetic field. The nuclear spin (I) can have a value of 0, 1/2, 1, 3/2, 2 etc. Each nuclear spin I has 2I+1 states given by the quantum number m -I, -I+1 . I-1, I. So for I=1/2 nuclei like 1 H the states are m=-1/2 and m=+1/2. This kind of nucleus can be thought of as a bar magnet, which can be aligned with or against the magnetic field. At this point the text books resort to classical mechanics to derive the following equation

γ is an intrinsic property of the nucleus (the quadropole moment), ω is the Larmor frequency and is the absorption frequency of an isolated atom. NMR spectrometers are normally described in terms of the Larmor frequency of 1 H in their magnetic field. These are say 200 or 300 MHz for organic chemists routine spectra, 500, 600 Hz and increasingly 750 and 800 MHz are the work horses of macromolecular work and 900 MHz are the virility symbols of the big macromolecular research groups at present and 1GHz machines are being planned. 800 MHz corresponds to 18.8 Tesla, which is an extremely expensive magnet (several hundred thousand pounds), but the NMR people would argue is peanuts compared to a synchrotron beam lines used by the X-ray crystallographers. There is a Boltzmann energy distribution between the parallel and anti-parallel states given by

Energy is put into the system by radio waves from the spectrometer, which displaces the distribution of the system away from equilibrium and then the decay back to equilibrium is monitored by the emitted radio waves.

Figure 1 (above) shows a schematic of a NMR spectrometer. The main components are the magnet, which is normally a liquid nitrogen cooled electromagnet, the probes (three or even four probes which are coils surrounding the sample are common), the electronics to transmit and receive the radio waves and finally a computer via an analogue to digital convertor.
 
 

Simple FT NMR Spectra

A single short pulse is applied containing frequencies over the spectral width required. This is of the order of 10 -5 s. The nuclear spin then decays back to equilibrium and the decay is followed. Once it has decayed the process can be repeated and summed to improve the signal to noise. The decay is digitised and a Fourier transform applied to convert the so called Free Induction Decay (FID) to a frequency spectrum. The conventional representation of this is by a vector representation (see Figure 3 below).

Having summed several pulses and carried out a Fourier Transform you obtain a 1D spectrum. Each proton has a chemical shift (Measured in parts per million ppm) which is given by

Where ω ο is the operating frequency of the spectrometer and ω TMS is the proton frequency from tetramethylsilane. The value of the chemical shift depends on the local magnetic field experienced by that proton, which is related to its chemical environment. Obviously if there are protons in the solvent the biggest peak comes from the solvent. Amide NH protons exchange with the solvent and so if a protein is left in D2O there will be no signal from the amide protons. Some spectra to look at the side chain atoms are best done in D2O but the NH proton is very important in determining the backbone of the protein and so most experiments are carried out in 90% H2O/10% D2O. The 10% D2O is required as a lock signal is obtained from the D2O which is monitored to keep the magnetic field homogeneous. Extra pulses are included to reduce the size of the water peak. (NMR spectroscopy is full of acronyms for pulse sequences. Solvent suppression sequences include WATERGATE and DANTE.) The water peak divides the spectrum into two regions above the water peak (4.7 ppm) are the aromatic and NH protons below the peak are the aliphatic protons. OH protons are usually too broad to be seen. A typical protein spectra is seen in Figure 4.

 Figure 4 600MHz spectrum of N terminal domain of p47phox

The major natural isotopes of carbon and oxygen 12 C and 16 O have I=0 and so are NMR inactive, 14 N has I=1, but this relaxes much faster than spin 1/2 nuclei and so does not have an observed effect in macromolecular NMR. However 13 C and 15 N have I=1/2. These can be incorporated at nearly 100% abundance by growing cells on isotope enriched media. For 15 N this is not too bad (㿞 a litre for E.coli minimal media), for 13 C it is � a litre (although prices are edging down as use increases). This means you need very good expression (the yield normally drops on going from a rich media like 2TY or TB to minimal media). There are isotopically enriched media available for Pichia and methyltrophic yeasts. In theory you should be able to record 13 C and 15 N spectra directly. In fact better spectra are obtained by detecting the signals indirectly via the much more sensitive 1 H spins. This is done by the so called INEPT pulse sequence. 2 H which is a quadropolar (I=1) nuclei can also be incorporated. Partial deuteration has advantages (which I will not attempt to explain) in pushing the size limits of NMR. As the isotope effect of deuterium has a significant effect on the metabolism of the bacteria, slow conditioning in increasing D2O concentrations are required. Incorporation of specifically labelled individual amino acids eg 15 N His or 13 C Ala can be done. There is not a need to use auxotrophs if it is done in the presence of the other amino acids in the anabolic pathway. These can produce simpler spectra for helping interpret fully labelled spectra or for probing particular amino acids (eg the protonation state of a His in an enzyme).

If all you could obtain were the chemical shifts of every C, H and N atom in the protein, there is a formal possibility that you could determine the structure by calculating the chemical shift of each nuclei from a model and altering the model to improve the fit. This is not yet possible, although some people are trying to use chemical shift calculations as part of a structure determination. However there is interaction between spins, which can be used and detected. There are basically two types of spin coupling through space (dipolar) and through bond. (scalar, correlation or J coupling). Through space coupling which is also known as the Nuclear Overhauser Effect (NOE) is dependent on r -6 , which means that signals can be got between protons that are less than 5Å apart. The simplest experiment produces a cross peak at the chemical shifts of pairs of protons that lie less than 5 Å apart. This is the basis of NMR structure determination, which consists of calculating a model compatible with most (if not all) the observed NOE's in the spectrum. However before this can be done each NOE has to be assigned to a pair of protons in the protein, so the chemical shift of each proton needs to be known. This is done by assembling 'spin systems' which are protons which are linked through bonds. These correspond to amino acids. Connections then need to be made to adjacent amino acids.

Figure 5 2D NOESY spectra.  Click here for close up of a region

NMR Structure determination

For proteins of less than 15kD the structure can be determined by proton experiments alone. One strategy is first to determine the spin systems in D2O using 2D through bond experiments (DQF-COSY and TOCSY). Then from experiments in H2O, the exchangeable protons are added to the spin systems. Sequential spin systems are identified by looking for NOE's between the NH proton and the previous residue (so called dNN, dαN,d βN ) links see Figure 6. The pattern of these links are indicative of certain types of secondary structure and the secondary structure is obtained sometime before the structure is fully solved. Secondary structure assignments are publishable and are the NMR equivalent of crystallisation notes, indicating that the structure is solvable.

Figure 6.  HH distances in an amino acid.  Taken from Evans Fig 4.1

For proteins of 15-30kD the 2D spectra are too crowded to interpret and the proton chemical shifts alone are ambiguous as to which proton in the protein they are. For proteins in this range isotopically labelled samples are required and 3 or 4D experiments are carried out which attach a 13 C or 15 N shift to each proton as well. A 3D experiment is a stack of 2D experiments but each peak only occurs once in the stack so there are many less peaks per 2D layer. Assignments are carried out by a series of experiments such as HNCO, HNCA, HN(CO)CA, HCACO, HBHA(CO)NH. There are 3 and 4D versions of the NOE and TOCSY experiments as well. There are complications to many of these experiments, which mean that not all the expected appears appear or extra peaks appear. For example in the HNCA experiment the CA of the previous amino acid is often also visible. 4D experiments in theory would resolve all the protons in large proteins. However there are constraints on the relationship of line width and tumbling time that means that even with a number of recent improvements such as partial deuteration the limit is likely to be reached under 40kD. Solid state methods and a new method for determining bond dipoles in a protein partially orientated in the magnetic field offer possibilities for pushing the size limit.

What is obtained from in an NMR structure determination is a list of distance constraints (ie that certain protons are less than a certain distance apart). There is some correlation of distance with intensity but normally the uncertainty is several Å. These are combined with the stereochemical constraints (bond distances, bond angles etc) of proteins similar to those used in X-ray crystallography. The best solution to these restraints are found using distance geometry or molecular dynamics software (CNS, X-PLOR, DISMAN, DIANA). It is normal to carry out these calculations tens of times, collect together those that pass some quality test on satisfying the constraints and display them together (Figure 6). This gives a much clearer idea of which parts of the structure are well defined than normally given by X-ray. Sometimes an average structure is calculated, but this will normally have poor geometry and in that sense is less right than the individual solutions. The database OLDERADO at the University of Leicester analyses these clusters and among other information tells you which of the models is the most typical. This is perhaps the best model to then look at in display programmes.

There are also NMR experiments that allow constraints on certain bond angles to be added and hydrogen bonds can be detected and used as restraints. A method has been described (Tjandra, N. and Bax, A (1997). Science 278:1111-1114) that obtains the angles between a bond (or more precisely the interatom vector) and the principal axes of the molecule. This requires that a molecule is not perfectly spherical (they rarely are) and that there is some ordering of the molecules in the magnetic field. This is achieved with a low concentration of a liquid crystalline lipid phase.

Significant increase in the range of proteins that can be studied has recently been achieved by using deuteration of the protein. Deuterium is not NMR active. Normally the other hydrogens in a large protein are a major source of the rapid decay. E.coli cells can be got to grow in D2O and perdeuterated glucose or acetate. The exchangeable (NH) hydrogens are changed to protons on transferring the sample to H2O and a structure can be determined based just on the backbone hydrogens. More detail can be obtained by adding amino acids such as valine with hydrogens on the methyl groups to the culture in D2Ο.
(For an example of a 280 amino acid protein done by Steve Matthews at Imperial see Nature Structural Biology, 1999, Vol.6, No.4, Pp.313-318)
 

In 2002 the pulse sequences proposed in the last couple of years have started to produce biological results. These include transverse relaxation-optimised spectroscopy (TROSY), which reduces the speed of decay of the spin caused by adjacent atoms and cross correlation relaxed-enhanced polarisation transfer (CRINEPT) (Riek, Pervushin and Wuthrich (2000) TIBS 25:462-467). Using these spectra of GroES a 10kD protein has been collected from within the 72kD homoheptamer or even the 900kD GroES/EL complex. (Fiaux et al., Nature 418:207-211) The p53 core domain has been shown to be unfolded when bound to the 200kD Hsp90 complex (Rüdiger et al., (2002) PNAS 99:11085-11090. Thus these techniques allow spectra to be collected from large protein complexes, particularly if only small parts can be labelled to reduce peak overlap.

Figure 7 Backbone of well-defined set of NMR structures. The SH3 domain of fyn (PDB 1NYG). (CJ Morton , DJ Pugh , EL Brown , JD Kahmann , DA Renzoni , ID Campbell "Solution structure and peptide binding of the SH3 domain from human Fyn." Structure, 4 (6), 1996, 705-714)
 
 
 
 

Figure 8. Backbone of a less well superimposed set of structures PDB 1CYP(Kilby PM, Van Eldik LJ, Roberts GC, Structure 1996 4(9):1041-52. The solution structure of the bovine S100B protein dimer in the calcium-free state.) It is worth noting that in this case there are more restraints (1773) than for the SH3 above (669). The greater spread of structures is due partly to the structure being of an apo (calcium free) form of a calcium binding protein, which is inherently more flexible. This structure is a dimer so there is a problem resolving those NOE's within and those between chains.
 
 


6 thoughts on &ldquo Peng-Jui (Ruby) Chen–Lipophilic Tunings of Small-Molecule Mediated Metal Mobilization &rdquo

Congratulations on such fantastic research! This was a great talk and so much impressive work done. I am curious about the binding of the iron to hinokitiol… you show in your slides that the iron is bound by the carbonyl and the alcohol. Do you plan to make any derivatives at those two positions to prove that the iron is binding there and to see if derivatives have increased/decreased activity?

Hi Shelby, thank you for your question!
We have proven that iron binds to the carbonyl and alcohol oxygens by obtaining a crystal structure of the hinokitiol-iron complex. In addition, we have previously synthesized a derivative of hinokitiol with the alcohol group replaced by a proton, and this derivative showed no iron mobilization activity.

Nice talk Ruby! I have a few questions about your liposome assay.
1. How did you quantify the concentration of iron outside of the liposome?
2. Did you verify that the liposome was intact? (ie, how do we know that the iron you’re detecting outside of the liposome isn’t just from liposomes that ruptured?)
3. Why do you think higher concentrations of the small molecule ultimately lead to a dropoff in iron transport? I would expect the iron transport to simply level off at higher concentrations rather than dropping. Do you think the small molecules are potentially aggregating in solution at higher concentrations?
4. Assuming I’m reading your data properly, there doesn’t appear to be very much iron transported out of the liposomes (15 mM inside to 0.3 mM outside). Is your assay performed under dilute conditions, or is only a small amount of iron being transported? And do you think that’s enough to be relevant in a biological system?
Again, really nice talk!

Hi Philip, thank you so much for these questions!
1. The concentration of iron was quantified using a dye ferrozine that binds to iron.
2. Liposomes are typically very stable. Also as you mentioned in your 4th question, the transported amount of iron is rather small compared to the total amount we put into the liposome. If the liposomes are ruptured, I would expect the amount of iron outside of the liposome to be more significant. Moreover, we know that liposomes can be broken by detergent. If the iron we see outside of the liposome results from the lipid being ruptured, I would expect the longer chain derivatives (more detergent-like) to have higher activity, which contradicts our observation. For these reasons I believe we are seeing actual iron mobilization and not liposome rupturing.
3. Yes, just like you mentioned, we currently think that aggregation of the small molecules lead to lower activity, and even the toxicity. We have obtained some preliminary results visualizing the Hino-iron aggregates using TEM that shows larger aggregates form at higher concentrations of the small molecules.
4. I believe this result indicates a rather small amount of iron is being transported, but I think it is relevant in a biological system. The iron transported will be uptaken by other parts of the cell that need the iron, which will drive more iron transport to reach equilibrium of the iron concentration on both sides of the membrane.

You have synthesized many compounds using a variety of synthetic reactions. What were the yields of your reactions (a range is fine or the yields of the most relevant reaction steps)
Also, what methods did you use to determine the identity of your synthetic products. Any special methods used for the isotopically labeled compounds (Deuterated and 13C labeled)

Hi Anton, thank you very much for the questions!
The yield to get from cyclohexadienes to the promo-tropolone building blocks, over 4 steps, is around 10%, and the yields for the coupling reactions followed by methyl group deprotections are around the range of 10%-30%, depending on the alkyl substituent we are attaching.
All the synthetic products have been characterized with 1H and 13C NMR, in addition to high and low resolution mass spectrometry.
For the 13C labeled compounds, we simply run 13C NMR on the sample, and the isotopic label can be identified as an enhanced peak in the spectrum as compared to other signals (natural abundance of 13C is only 1.1%). The identities of the intermediates in which a proton is directly attached to the 13C carbon were also confirmed through 1H NMR, where 13C-1H coupling can be observed. All the intermediates and products have also been characterized with mass spectrometry.
On the other hand, deuterated derivatives required more special characterization. To identify the deuterium peaks, we took deuterium NMR spectra for these compounds. In their 13C NMR spectra, the 13C peaks are split by the couplings with deuteriums, and the structure assignments can also be corresponded with these splitting patterns. In addition, to better resolve these 13C peaks, we were able to characterize all deuterated compounds with simultaneously proton and deuteron decoupled 13C NMR with the help of Dr. Zhu in the NMR lab.
Ελπίζω αυτό να απαντήσει στις ερωτήσεις σας!


Δες το βίντεο: ΌΛΗ Η ΑΛΉΘΕΙΑ για την Σκόνη Πρωτεΐνης (Νοέμβριος 2022).