Πληροφορίες

Τοπολογία DNA. Ερώτηση σχετικά με τις ανατροπές και τις στροφές

Τοπολογία DNA. Ερώτηση σχετικά με τις ανατροπές και τις στροφές


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Γεια σας παιδιά, υπάρχει μια ερώτηση που με τρελαίνει από τότε που είδα αυτό το βίντεο (https://youtu.be/az2c6UbEdug). Στις 4:50 ο τύπος λέει ότι όταν ένα δεξιόχειρο κυκλικό DNA αρχίζει να σχηματίζει ένα δεξιόστροφο συνδιέλιξη, το DNA πρέπει να προσαρμοστεί στρίβοντας περισσότερο (Μπορείτε να δείτε ο αριθμός ανεβαίνει στο 8 από το 5 στην εξίσωση) και ότι όταν μια περιέλιξη Το στρίψιμο γίνεται προς την αντίθετη κατεύθυνση πρέπει να στρίβει λιγότερο. Για μένα αυτό δεν έχει καθόλου νόημα. Σκέφτηκα ότι καθώς περιτυλίγετε προς τα δεξιά η συστροφή θα πρέπει να μειώνεται και όταν περιτυλίγετε προς τα αριστερά η συστροφή θα πρέπει να αυξάνεται. Μπορεί κάποιος να εξηγήσει (ή να δείξει ένα πολύ σαφές διάγραμμα/εικόνα που το εξηγεί) παρακαλώ;;


Όλα εξηγούνται εδώ στη Wikipedia. Εάν θέλετε να φτιάξετε ένα δικό σας τρισδιάστατο μοντέλο, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε δύο κομμάτια σωλήνων tygon (όπως ο ελαστικός εύκαμπτος σωλήνας για έναν καυστήρα Bunsen), που είναι και κυκλικοί και συνδέονται με συνδέσμους που μπορούν να ανοίγουν και να κλείνουν -- που σας επιτρέπουν προσομοίωση κοπής και επανασφράγισης των κλώνων.


Τα μαθηματικά δείχνουν πώς το DNA περιστρέφεται, γυρίζει και αποσυνδέεται

Η Mariel Vazquez λαμβάνει χρηματοδότηση από το Εθνικό Ίδρυμα Επιστημών (CAREER DMS 1519375, DMS 1716987 και DMS 1817156).

Συνεργάτες

Το Πανεπιστήμιο της Καλιφόρνια παρέχει χρηματοδότηση ως ιδρυτικός εταίρος του The Conversation US.

Το Conversation UK λαμβάνει χρηματοδότηση από αυτούς τους οργανισμούς

Εάν έχετε δει ποτέ μια εικόνα ενός μορίου DNA, πιθανότατα το είδατε στη διάσημη μορφή Β: δύο κλώνοι κουλουριάζονται ο ένας γύρω από τον άλλο με δεξιόστροφο τρόπο για να σχηματίσουν μια διπλή έλικα. Γνωρίζατε όμως ότι το DNA μπορεί να αλλάξει το σχήμα του;

Τα μόρια DNA, τα οποία φέρουν τον γενετικό κώδικα ενός οργανισμού, πρέπει να συσκευάζονται σφιχτά για να χωρέσουν μέσα σε ένα κύτταρο. Ωστόσο, κάθε λίγες ώρες, το κύτταρο παράγει ένα πιστό αντίγραφο του γονιδιώματός του προετοιμάζοντας την κυτταρική διαίρεση. Αυτή η διαδικασία αντιγραφής ασκεί τεράστια πίεση στο DNA και μπορεί να αλλάξει το σχήμα του με θανατηφόρους τρόπους.

Ως μαθηματικός και βιολόγος, με ενδιαφέρει πώς τα μαθηματικά μπορούν να περιγράψουν τα πολλά σχήματα του DNA, καθώς και τις κυτταρικές διεργασίες όπως η αντιγραφή του DNA. Οι απαντήσεις σε αυτά τα ερωτήματα εμπνέουν νέα μαθηματικά και πιθανώς καλύτερη κατανόηση του μορίου της ζωής.


Το έργο του Starostin του 2002 έχει δημοσιευτεί το 2005 (Starostin 2005), αλλά η προτυπωμένη έκδοση περιέχει περισσότερο υλικό από τη δημοσιευμένη έκδοσή του, και συγκεκριμένα μια ολόκληρη ενότητα αφιερωμένη στη συστροφή της προσθετικότητας, στην οποία αναφερόμαστε στην εργασία μας.

Συγκρίνετε με την Εξ. 16 στο Starostin (2005). Παρεμπιπτόντως, επισημαίνουμε ένα σφάλμα στον στρογγυλό όρο αυτού του τύπου, το οποίο θα πρέπει να ξαναγραφεί ως (+round(aL/2pi )) .

Σημειώνουμε ότι η ίδια άποψη (F) εισήχθη από τον Crick (1976).

Το γεγονός ότι στη δομή του σκελετού το εφαπτομενικό διάνυσμα παρουσιάζει ασυνεχή σημεία μπορεί να φαίνεται ως περιορισμός στην εφαρμογή του θεωρήματος, αλλά αυτό το πρόβλημα μπορεί να λυθεί εύκολα με τον καθορισμό μιας σωστής περιοριστικής διαδικασίας (Starostin 2005).


Τα μαθηματικά δείχνουν πώς το DNA περιστρέφεται, γυρίζει και αποσυνδέεται

Κόμβος DNA όπως φαίνεται στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Javier Arsuaga, CC BY-ND

Αν έχετε δει ποτέ μια εικόνα ενός μορίου DNA, πιθανότατα το είδατε στη διάσημη μορφή Β: δύο κλώνοι κουλουριάζονται ο ένας γύρω από τον άλλο με δεξιόστροφο τρόπο για να σχηματίσουν μια διπλή έλικα. Γνωρίζατε όμως ότι το DNA μπορεί να αλλάξει το σχήμα του;

Τα μόρια του DNA, που φέρουν τον γενετικό κώδικα ενός οργανισμού, πρέπει να είναι σφιχτά συσκευασμένα για να χωρέσουν μέσα σε ένα κύτταρο. Ωστόσο, κάθε λίγες ώρες, το κύτταρο παράγει ένα πιστό αντίγραφο του γονιδιώματός του προετοιμάζοντας την κυτταρική διαίρεση. Αυτή η διαδικασία αντιγραφής ασκεί τεράστια πίεση στο DNA και μπορεί να αλλάξει το σχήμα του με θανατηφόρους τρόπους.

Ως μαθηματικός και βιολόγος, με ενδιαφέρει πώς τα μαθηματικά μπορούν να περιγράψουν τα πολλά σχήματα του DNA, καθώς και τις κυτταρικές διεργασίες όπως η αντιγραφή του DNA. Οι απαντήσεις σε αυτά τα ερωτήματα εμπνέουν νέα μαθηματικά και πιθανώς καλύτερη κατανόηση του μορίου της ζωής.

Για να κατανοήσετε τα μαθηματικά του σχήματος του DNA, πρέπει να λάβετε υπόψη τόσο τη γεωμετρία όσο και την τοπολογία του. Αυτές είναι έννοιες σχετικές αλλά διακριτές.

Η γεωμετρία περιγράφει ένα αντικείμενο σε μια συγκεκριμένη χρονική στιγμή – παγωμένο άκαμπτο στο χώρο, όπως ένα γλυπτό. Στο κύτταρο, η έλικα του DNA τυλίγει πάνω της, ή «υπερπηνία». Ο τρόπος με τον οποίο το DNA διπλώνει και τυλίγει κωδικοποιεί πολύτιμες γεωμετρικές πληροφορίες που μπορεί να είναι ζωτικής σημασίας για τον έλεγχο του τρόπου με τον οποίο εκφράζονται τα γονίδια.

Αυτά τα τρία αντικείμενα έχουν πολύ διαφορετικές γεωμετρίες, αλλά είναι τοπολογικά ίδια – που σημαίνει ότι τα αντικείμενα μπορούν να λυγίσουν ή να συστραφούν από το ένα σχήμα στο άλλο. Πίστωση: Mariel Vazquez, CC BY

Η τοπολογία περιγράφει πώς ένα αντικείμενο παραμορφώνεται ομαλά, σαν να είναι κατασκευασμένο από πηλό χωρίς να κάνει νέες τρύπες ή να σπάει. Για παράδειγμα, φανταστείτε ένα λάστιχο να τριγυρίζει σε μια υδρομασάζ. Καθώς το νερό στροβιλίζεται, το λάστιχο στρίβει, τεντώνεται και συρρικνώνεται. Όλα τα σχήματα που υιοθετεί η μπάντα καθώς κινείται είναι τοπολογικά πανομοιότυπα, αλλά γεωμετρικά διαφορετικά.

Η απλή αντιγραφή του DNA δημιουργεί μεγάλο αριθμό προβλημάτων που σχετίζονται με το σχήμα, αλλά οι εικόνες των σχολικών βιβλίων σπάνια απεικονίζουν αυτό το τοπολογικό αίνιγμα.

Κατά τη διάρκεια του κυτταρικού κύκλου, κάθε χρωμόσωμα αντιγράφεται σε δύο πανομοιότυπα αντίγραφα. Για να συμβεί αυτό, η έλικα του DNA πρέπει να ξετυλιχθεί, προκαλώντας πίεση στο DNA. Το DNA ανταποκρίνεται σε αυτό το στρες με υπερτυλίξεις, όπως ένα παλιό καλώδιο τηλεφώνου. Αλλά το κύτταρο δεν μπορεί να ανεχθεί υπερβολική περιέλιξη. Εάν το DNA παραμορφωθεί πάρα πολύ, το κύτταρο θα υποφέρει.

Ένα μόριο DNA μπορεί να είναι γραμμικό – όπως στην περίπτωση των ανθρώπινων χρωμοσωμάτων – ή κυκλικό. Παραδείγματα κυκλικών μορίων DNA περιλαμβάνουν βακτηριακά χρωμοσώματα και ανθρώπινο μιτοχονδριακό DNA. Εάν το μόριο του DNA είναι κυκλικό, τότε κυτταρικές διεργασίες όπως η αντιγραφή μπορεί να συνδέουν το DNA σε κόμβους ή συνδέσμους, όπως δαχτυλίδια σε μια μπρελόκ. Οι κόμβοι και οι σύνδεσμοι του DNA μπορούν να προκαλέσουν δυσλειτουργία των κυττάρων ή ακόμα και θάνατο.

Σκίτσο μιας δεξιάς διπλής έλικας DNA (αριστερά). Το άνοιγμα της έλικας, που υποδεικνύεται από ένα τρίγωνο, προκαλεί το DNA σε υπερέλιξη (δεξιά). Ένα υπερπηνίο εμφανίζεται όταν ο άξονας της έλικας, που υποδεικνύεται με μοβ, περιελίσσεται πάνω του. Πίστωση: Mariel Vazquez, CC BY

Σκεφτείτε το βακτήριο Ε. coli. Ο γενετικός του κώδικας βρίσκεται σε ένα μόνο χρωμόσωμα DNA. Σε Ε. coli και άλλα βακτήρια, η διπλή έλικα του DNA κλείνει σε κύκλο, σαν ένα στριμμένο λάστιχο.

Αντιγραφή του Ε. coli Το χρωμόσωμα μπορεί να συμβεί σε μόλις 20 λεπτά σε έναν δοκιμαστικό σωλήνα. Αλλά όταν ένα κυκλικό χρωμόσωμα αντιγράφεται, η διαδικασία αποδίδει δύο αλληλένδετα χρωμοσώματα. Δηλαδή, τα νέα χρωμοσώματα σχηματίζουν δύο δακτυλίους που συνδέονται μεταξύ τους. Τα νέα χρωμοσώματα πρέπει να αποσυνδεθούν πριν το κύτταρο διαιρεθεί σε δύο κύτταρα. Διαφορετικά είτε θα έσπασαν στο δρόμο προς το κύτταρο-στόχο τους, είτε ένα κύτταρο θα κληρονομούσε δύο αλληλοσυνδεόμενα αντίγραφα ενός χρωμοσώματος και στο άλλο θα έλειπε το χρωμόσωμα εντελώς.

Το κύτταρο στρατολογεί ένζυμα για να αποσυνδέσει το DNA. Τα ένζυμα που ονομάζονται τοποϊσομεράσες και ανασυνδυασές λειτουργούν ως ψαλίδια και κόλλα για το DNA. Μπορούν να αλλάξουν τη γεωμετρία και την τοπολογία του DNA, διατηρώντας έτσι ένα σταθερό γονιδίωμα. Σε Ε. coli, οι τοποϊσομεράσες εργάζονται ακούραστα κατά τη διάρκεια και μετά την αντιγραφή για να διατηρήσουν υγιή επίπεδα υπερσπειρώματος και να αποσυνδέσουν με ασφάλεια τα χρωμοσώματα.

Αντιγραφή ενός κυκλικού μορίου DNA. Τα βέλη δείχνουν την κατεύθυνση της αναπαραγωγής (αριστερά). Τα νέα μόρια αλληλοσυνδέονται σε αυτή τη διαδικασία (δεξιά). Πίστωση: Mariel Vazquez, CC BY

Όταν οι τοποϊσομεράσες δεν λειτουργούν

Όταν οι τοποϊσομεράσες δεν λειτουργούν, το κύτταρο τελικά πεθαίνει. Αυτό τους καθιστά καλούς στόχους για το σχεδιασμό φαρμάκων. Αλλά τα κύτταρα έχουν διαφορετικούς τύπους τοποϊσομερασών και άλλα ένζυμα όπως οι ανασυνδυασμένες που μπορεί να είναι σε θέση να έρθουν στη διάσωση. Για παράδειγμα, δείξαμε ότι, σε Ε. coli κύτταρα όπου οι τοποϊσομεράσες που είναι υπεύθυνες για την αποσύνδεση έχουν απενεργοποιηθεί, άλλα ένζυμα που ονομάζονται ανασυνδυασμένες ειδικές θέσης μπορούν να λύσουν τους συνδέσμους αντιγραφής.

Τόσο οι τοποϊσομεράσες όσο και οι τοποειδικές ανασυνδυασές δεσμεύουν το δίκλωνο DNA και μπορούν να αλλάξουν το σχήμα του εισάγοντας θραύσματα. Οι τοποϊσομεράσες τύπου II εισάγουν ένα σπάσιμο κατά μήκος του μορίου DNA και μεταφέρουν ένα άλλο κομμάτι DNA μέσω του σπασίματος πριν το σφραγίσουν ξανά. Οι ειδικές για τη θέση ανασυνδυασμένες προσκολλώνται σε δύο θέσεις κατά μήκος του DNA, εισάγουν μία τομή σε καθεμία και μετά επανασυνδέουν τα άκρα.

Το εργαστήριό μου χρησιμοποιεί μαθηματικά και προσομοιώσεις υπολογιστή για να καταλάβει πώς αυτά τα ένζυμα αποσυνδέουν τα μόρια του DNA. Ενώ η τοπική δράση είναι καλά κατανοητή σε βιοχημικό επίπεδο, το πώς ακριβώς τα ένζυμα απλοποιούν την τοπολογία του DNA εξακολουθεί να είναι ένα μυστήριο.

Σε μια από τις μελέτες μας, επικεντρωθήκαμε σε Ε. coli κύτταρα όπου οι τοποϊσομεράσες δεν δρουν. Δείξαμε πώς να λύσετε έναν σύνδεσμο αναπαραγωγής στον ελάχιστο αριθμό βημάτων.

Γενικά, μπορεί να υπάρχουν πολλά μονοπάτια αποσύνδεσης. Χρησιμοποιούμε προσομοιώσεις υπολογιστή για να εκχωρήσουμε πιθανότητες σε κάθε μονοπάτι. Η εργασία μας δείχνει ότι, στην περίπτωση των συνδέσμων αντιγραφής, η απλούστερη οδός είναι αυτή που πιθανότατα ακολουθούν τα ένζυμα.

Οι εξελιγμένες μαθηματικές μέθοδοι μπορούν να βοηθήσουν να εξηγηθεί πώς τα ένζυμα αποσυνδέουν το DNA. Χωρίς μαθηματική μοντελοποίηση, οι ερευνητές θα περιορίζονταν σε απλουστευμένα μοντέλα που προτείνονται από βιολογικά πειράματα.

Αυτό το άρθρο δημοσιεύθηκε αρχικά στο The Conversation. Διαβάστε το αρχικό άρθρο.


Στρίψτε για να ξεμπλέξετε

Η διαπλοκή των μορίων του DNA οδηγεί συχνά στο σχηματισμό «υπερλεπτών γεφυρών» μεταξύ αδελφών χρωματίδων που πρέπει να επιλυθούν κατά τον διαχωρισμό των χρωματιδών σε θυγατρικά κύτταρα. Αν και έχει διαπιστωθεί ότι αυτές οι γέφυρες DNA επικαλύπτονται από την ελικάση PICH, παραμένει άγνωστο πώς το PICH βοηθά στην επίλυσή τους. Μια μελέτη αποκαλύπτει τώρα ότι το PICH κατευθύνει το σχηματισμό θετικής υπερέλιξης DNA παρουσία τοποϊσομερασών τύπου Ι για να προωθήσει την επακόλουθη αποσύμπλεξη αυτών των ελίκων DNA από τοποϊσομεράσες τύπου II. Είναι αξιοσημείωτο ότι το PICH θα μπορούσε να είναι σε θέση να αναδιαμορφώσει την τοπολογία του DNA με εξώθηση βρόχων DNA ενώ κινείται κατά μήκος της διπλής έλικας.

Λόγω της μακράς, ελικοειδούς φύσης τους, τα αδελφά μόρια DNA αναδύονται από τον μηχανισμό αντιγραφής πολύ μπερδεμένα 1 . Αυτές οι διαπλοκές DNA τυπικά επιλύονται από τοποϊσομεράσες τύπου II, οι οποίες είναι ένζυμα που δημιουργούν προσωρινά ένα σπάσιμο διπλού κλώνου σε μία έλικα DNA για να επιτρέψουν τη διέλευση μιας δεύτερης έλικας DNA μέσα από το διάκενο της πρώτης. Η αποτυχία να ξεμπερδέψει το μεγαλύτερο μέρος της κατένωσης του DNA πριν από την έναρξη της κυτταρικής διαίρεσης - για παράδειγμα, ως αποτέλεσμα της αναστολής της τοποϊσομεράσης - δημιουργεί τις λεγόμενες «γέφυρες αναφάσης»: DNA που τεντώνεται μεταξύ των διαχωρισμένων αδελφών χρωματίδων. Ωστόσο, ακόμη και σε μη διαταραγμένα κύτταρα, οι διασυνδέσεις μεταξύ αδελφών χρωματίδων επιμένουν για τουλάχιστον ένα μικρό χρονικό διάστημα μέχρι την ανάφαση. Τέτοιες «υπερλεπτές γέφυρες» (UFBs) έχει αναφερθεί ότι αποτελούνται από DNA χωρίς νουκλεοσώματα επικαλυμμένο από πολλές ξεχωριστές πρωτεΐνες, συμπεριλαμβανομένων των ελικάσες PICH (Plk1-αλληλεπιδρώντας ελικάση σημείου ελέγχου) 2 και BLM (ελικάση Bloom) 3 και του συμπλέγματος TRR πολλαπλών υπομονάδων που αποτελείται από τοποϊσομεράση ΙΙΙα (Top3A), Rmi1 και Rmi2 τύπου ΙΑ.


Σταθεροποιητικό DNA

Σκεφτείτε το βακτήριο Ε. coli. Ο γενετικός του κώδικας βρίσκεται σε ένα μόνο χρωμόσωμα DNA. Σε Ε. coli και άλλα βακτήρια, η διπλή έλικα του DNA κλείνει σε κύκλο, σαν ένα στριμμένο λάστιχο.

Αντιγραφή του Ε. coli Το χρωμόσωμα μπορεί να συμβεί σε 20 λεπτά σε ένα δοκιμαστικό σωλήνα. Αλλά όταν ένα κυκλικό χρωμόσωμα αντιγράφεται, η διαδικασία αποδίδει δύο αλληλένδετα χρωμοσώματα. Δηλαδή, τα νέα χρωμοσώματα σχηματίζουν δύο δακτυλίους που συνδέονται μεταξύ τους. Τα νέα χρωμοσώματα πρέπει να αποσυνδεθούν πριν το κύτταρο διαιρεθεί σε δύο κύτταρα. Διαφορετικά είτε θα έσπασαν στο δρόμο προς το κύτταρο-στόχο τους, είτε ένα κύτταρο θα κληρονομούσε δύο αλληλοσυνδεόμενα αντίγραφα ενός χρωμοσώματος και στο άλλο θα έλειπε το χρωμόσωμα εντελώς.

Το κύτταρο στρατολογεί ένζυμα για να αποσυνδέσει το DNA. Ένζυμα που ονομάζονται τοποϊσομεράσες και ανασυνδυασές λειτουργούν ως ψαλίδια και κόλλα για το DNA. Μπορούν να αλλάξουν τη γεωμετρία και την τοπολογία του DNA, διατηρώντας έτσι ένα σταθερό γονιδίωμα. Σε Ε. coli, οι τοποϊσομεράσες εργάζονται ακούραστα κατά τη διάρκεια και μετά την αντιγραφή για να διατηρήσουν υγιή επίπεδα υπερσπειρώματος και να αποσυνδέσουν με ασφάλεια τα χρωμοσώματα.

Αντιγραφή ενός κυκλικού μορίου DNA. Τα βέλη δείχνουν την κατεύθυνση της αναπαραγωγής (αριστερά). Τα νέα μόρια αλληλοσυνδέονται σε αυτή τη διαδικασία (δεξιά). - Πίστωση εικόνας: Mariel Vazquez, CC BY


2. Ιστορικό

Μερικοί ορισμοί, η διπλή έλικα και η χρωματίνη

Αρχικά, θα πρέπει να εισαγάγουμε μερικές από τις λέξεις και τις έννοιες που θα χρησιμοποιήσουμε ξανά και ξανά σε όσα ακολουθούν. Αυτός είναι ο στόχος αυτής της πρώτης ενότητας—μπορεί επομένως να χρησιμοποιηθεί ως γλωσσάρι για να επιστρέψετε όταν χρειάζεται.

Το DNA είναι το γενετικό υλικό που βρίσκεται μέσα σε όλους τους ζωντανούς οργανισμούς: περιέχει όλες τις πληροφορίες για να μας κάνει αυτό που είμαστε. Το DNA είναι ένα πολύ μακρύ, δίκλωνο πολυμερές, όπου κάθε κλώνος περιέχει μια αλληλουχία νουκλεοτιδίων. Υπάρχουν τρία συστατικά σε ένα νουκλεοτίδιο: ζάχαρη, φωσφορικό άλας και βάση. Ενώ το σάκχαρο και το φωσφορικό είναι το ίδιο για κάθε νουκλεοτίδιο, υπάρχουν τέσσερις πιθανές βάσεις στο αλφάβητο του DNA: κυτοσίνη (C), γουανίνη (G), αδενίνη (Α) και θυμίνη (Τ). Οι δύο κλώνοι στο μόριο συνδέονται με δεσμούς υδρογόνου μεταξύ των βάσεων: αυτοί σχηματίζονται μεταξύ C και G, ή μεταξύ Α και Τ. Επομένως, οι δύο κλώνοι είναι «συμπληρωματικοί»: αν γνωρίζετε την αλληλουχία ενός κλώνου, μπορείτε να καταλάβετε η αλληλουχία του άλλου, καθώς οι βάσεις θα είναι αυτές που σχηματίζουν δεσμούς υδρογόνου με τις βάσεις στον πρώτο κλώνο. Κάθε ζεύγος βάσεων - μία σε κάθε σκέλος - ονομάζεται «ζεύγος βάσεων», που συχνά δηλώνεται «bp». Οι αποστάσεις κατά μήκος των μορίων DNA μετρώνται μετρώντας πόσα ζεύγη βάσεων πρέπει να διανύσουμε για να πάμε από το ένα σημείο στο άλλο: οι τυπικές αποστάσεις που θα χρησιμοποιήσουμε είναι ζεύγη κιλοβάσεων ή μέγα-ζεύγη βάσεων (kbp ή Mbp, αντίστοιχα).

Τώρα, ώρα για λίγη γεωμετρία! Το DNA είναι ένα στενό πολυμερές, με πάχος περίπου 2 nm, παρόμοιο με το πλάτος ενός ζεύγους βάσεων. Η φυσιολογική μορφή του DNA μέσα στο σώμα μας ονομάζεται «B-DNA», η εικονική δεξιά διπλή έλικα που ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά από τους Watson, Crick και Franklin (εικόνα 1(ένα)). Η ιστορία λέει ότι η Rosalind Franklin απομόνωσε δύο τύπους ινών DNA από φυσικές πηγές: B-DNA, όταν διατηρούσε τις ίνες υγρές και A-DNA όταν τις διατηρούσε στεγνές (εικόνα 1(σι)). Ο Τζέιμς Γουάτσον και ο Φράνσις Κρικ ερμήνευσαν τη μορφή Β, την απλούστερη από τις δύο, στην εμβληματική εργασία τους το 1953 για τη δομή του DNA.

Φιγούρα 1. Δομές DNA. (ένα) Δομική αναπαράσταση B-DNA (αριστερά) και A-DNA (δεξιά). (σι) Μια απλή αναπαράσταση ζευγών βάσεων ως παραλληλεπίπεδα και φωσφορικών αλάτων ως σφαίρες. Καθώς η απόσταση μεταξύ των γειτονικών φωσφορικών αλάτων είναι σταθερή, δεν μπορούν να στοιβάζονται ακριβώς το ένα πάνω στο άλλο. Προκειμένου να αποκολληθεί όσο το δυνατόν περισσότερη επιφάνεια των υδρόφοβων βάσεων, οι βάσεις μπορεί να διατάσσονται με λοξό τελευταίο (αριστερά) ή ελικοειδή (δεξιά) τρόπο: στο 3D η πιο ευνοϊκή διαμόρφωση είναι η δεύτερη και αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο Το DNA είναι διπλή έλικα. Αναπαράγεται από τους Calladine C R, Drew H R, Luisi B F και Travers A A 2004 Κατανόηση του DNA: Το μόριο και πώς λειτουργεί (Λονδίνο: Elsevier/Academic Press).

Γιατί το DNA σχηματίζει μια διπλή έλικα απεικονίζεται όμορφα στο βιβλίο Κατανόηση του DNA από τον Chris Calladine και τον Horace Drew (οι μεταγενέστερες εκδόσεις είναι επίσης από κοινού από τους Ben Luisi και Andrew Travers). Το βασικό ζήτημα είναι ότι, ενώ τα φωσφορικά και τα σάκχαρα είναι διαλυτά στο νερό, οι βάσεις δεν είναι (λίγο σαν λίπος). Τα κύτταρα και οι πυρήνες μας είναι γεμάτα νερό, επομένως τα ζεύγη βάσεων προσπαθούν να θάψουν όσο το δυνατόν μεγαλύτερο μέρος της επιφάνειάς τους σε περιοχές απρόσιτες από τα μόρια του νερού. Ένα χρήσιμο γεωμετρικό μοντέλο για ένα ζεύγος βάσεων είναι ένα τούβλο πλάτους 2 nm (η διάμετρος του DNA), βάθους περίπου 1 nm και ύψους 0,34 nm. Τα φωσφορικά άλατα μπορούν να θεωρηθούν μικρές σφαίρες στην πλευρά κάθε τούβλου (εικόνα 1(σι)), χωρίζονται κατά 0,6 nm. Επειδή τα φωσφορικά είναι δεμένα, δεν είναι δυνατόν να αλλάξει πολύ αυτή η απόσταση. Ως αποτέλεσμα, δεν είναι δυνατό να στοιβάζονται οι βάσεις η μία πάνω στην άλλη για να θάψουν το ευρύτερο πρόσωπό τους, επειδή τα φωσφορικά άλατα θα απομακρύνουν τις βάσεις, επιτρέποντας την είσοδο του νερού. Μια πιθανή λύση είναι η λοξή δομή της σκάλας (εικόνα 1(σι) αριστερά) ωστόσο, η φύση ευνοεί την ελικοειδή δομή στο δεξιό πλαίσιο του σχήματος 1, καθώς αυτό οδηγεί σε λίγο περισσότερη θωράκιση των λιπαρών βάσεων από το νερό.

Τώρα απαιτούνται μερικοί ακόμη αριθμοί και ορισμοί. Ενώ το δίκλωνο DNA είναι το γενετικό υλικό των περισσότερων ζωντανών οργανισμών, έρχεται σε διαφορετικά μεγέθη και σχήματα. Σε προκαρυώτες όπως τα βακτήρια, το DNA υπάρχει ως κλειστός βρόχος λίγων Mbp. Οι ευκαρυώτες περιορίζουν το DNA τους μέσα σε έναν πυρήνα, ο οποίος χωρίζεται από το υπόλοιπο κύτταρο (το κυτταρόπλασμα) από μια πυρηνική μεμβράνη. Οι ευκαρυωτικοί οργανισμοί ποικίλλουν από τη μαγιά των αρτοποιών, μέχρι τα σκουλήκια, τις μύγες και τα έντομα, μέχρι τα θηλαστικά όπως εμείς. Συνήθως υπάρχουν αρκετοί κλώνοι DNA στους ευκαρυωτικούς πυρήνες. Για παράδειγμα, τα περισσότερα ανθρώπινα κύτταρα είναι διπλοειδή, που σημαίνει ότι περιέχουν 23 ζεύγη χρωμοσωμάτων (ένα από κάθε ζευγάρι από τη μητέρα, ένα από τον πατέρα). Κάθε χρωμόσωμα είναι ένα γραμμικό κομμάτι DNA, συνήθως πολύ μεγαλύτερο από ό,τι στα βακτήρια. Στον άνθρωπο, τα χρωμοσώματα είναι συνήθως περίπου 100 Mbp.

Στους ευκαρυώτες, το DNA συνδέεται πάντα με πρωτεΐνες, που ονομάζονται ιστόνες (τα περισσότερα είναι οκταμερή, δηλ. σύμπλοκα οκτώ πρωτεϊνών) για να σχηματίσουν την «ίνα χρωματίνης» που συνθέτει τα χρωμοσώματά μας. Η βασική μονάδα της χρωματίνης είναι το σωματίδιο του πυρήνα του νουκλεοσώματος (εικόνα 2 (ένα)). Ένα σωματίδιο πυρήνα νουκλεοσώματος αποτελείται συνήθως από 146 ζεύγη βάσεων διπλού ελικοειδούς DNA που τυλίγονται σφιχτά γύρω από ένα οκταμερές ιστόνης για λίγο λιγότερο από δύο στροφές. Το περιτύλιγμα είναι από μόνο του ελικοειδές: περιέργως, αυτή η έλικα είναι αριστερόχειρας (με πολύ λίγες εξαιρέσεις) σε αντίθεση με τη δεξιά έλικα του ίδιου του DNA. Η αλληλεπίδραση μεταξύ οκταμερών ιστόνης και DNA οφείλεται σε απλή ηλεκτροστατική, καθώς τα οκταμερή ιστόνης είναι πολύ θετικά φορτισμένα, ενώ το DNA είναι αρνητικά φορτισμένο λόγω της παρουσίας φωσφορικών αλάτων. Δεν είναι απολύτως σαφές γιατί το DNA υπάρχει ως χρωματίνη στους ευκαρυώτες, αλλά όχι στα βακτήρια καθώς το εξελικτικό πλεονέκτημα είναι εκ πρώτης όψεως ασαφές. Ένας πιθανός λόγος είναι ότι το σφιχτά τυλιγμένο DNA μπορεί να χωρέσει στον πυρήνα πιο εύκολα (αν και χρειάζονται πολλά άλλα στρώματα συμπίεσης, δείτε την ενότητα «Βασικά στοιχεία οργάνωσης του DNA» και ενότητα 3). Επιπλέον, το περιτύλιγμα πιθανότατα προστατεύει μηχανικά το DNA, αλλά επίσης καθιστά τα γονίδιά μας πολύ λιγότερο ενεργά από αυτά των βακτηρίων, κάτι που μπορεί να είναι καλό για πιο σύνθετους οργανισμούς που επιτρέπουν πιο ακριβή έλεγχο της γονιδιακής έκφρασης.

Σχήμα 2. Χρωματίνη. (ένα) Κρυσταλλική δομή του νουκλεοσώματος, που δείχνει το DNA και τις πρωτεΐνες ιστόνης. Χρωματική κωδικοποίηση πρωτεϊνών: H2A, πορτοκαλί H2B, κόκκινο H3, μπλε και H4, πράσινο. Δύο αντίγραφα κάθε ιστόνης H2A, H2B, H3 και H4 αυτοσυναρμολογούνται σε ένα οκταμερές ιστόνης. (σι) Μια ίνα χρωματίνης αποτελείται από πολλά νουκλεοσώματα, το καθένα με ένα αριστερό περιτύλιγμα DNA. Υπάρχουν πολλές πιθανές δομές για μια ίνα χρωματίνης, αυτή που απεικονίζεται εδώ αντιστοιχεί σε ανοιχτή χρωματίνη, που πιθανώς αντιστοιχεί σε ενεργή χρωματίνη: αναφέρεται επίσης ως ίνα 10 nm, καθώς το πάχος της συμπίπτει με αυτό ενός οκταμερούς ιστόνης. Οι ανενεργές περιοχές χρωματίνης πιστεύεται ότι αναδιπλώνονται σε πιο συμπαγείς δομές. Αναπαράγεται από τους Calladine C R, Drew H R, Luisi B F και Travers A A 2004 Κατανόηση του DNA: Το μόριο και πώς λειτουργεί (Λονδίνο: Elsevier/Academic Press).

Διαδοχικά σωματίδια πυρήνα νουκλεοσώματος ενώνονται με μικρές εκτάσεις που ονομάζονται συνδετικό DNA, του οποίου το μέγεθος ποικίλλει (μια πιθανή διάταξη της προκύπτουσας ίνας χρωματίνης σκιαγραφείται στο σχήμα 2 (σι)). Στα θηλαστικά, το συνδετικό DNA είναι συνήθως περίπου 50 ζεύγη βάσεων, ενώ στη ζύμη είναι πολύ μικρότερο (περίπου 20 ζεύγη βάσεων ή ακόμα και λίγο λιγότερο). Λίγο περίεργα, αν και τα σωματίδια του πυρήνα των νουκλεοσωμάτων είναι πιο σφιχτά συσκευασμένα, το γονιδίωμα της ζύμης είναι πιο ενεργό από αυτό των θηλαστικών. Σε όλες τις περιπτώσεις, το συνδετικό DNA είναι αρκετά μικρό ώστε να φαίνεται άκαμπτο (το μήκος του είναι μικρότερο από το μήκος εμμονής, το οποίο συζητάμε με περισσότερες λεπτομέρειες παρακάτω). Η φυσική της χρωματίνης συζητείται σε ένα εξαιρετικό άρθρο ανασκόπησης από τον Helmut Schiessel στο Journal of Physics: Condensed Matter, το οποίο συνιστάται για τον αναγνώστη που θέλει να μάθει περισσότερα για αυτό το θέμα.

Τέλος, μερικά ακόμη στοιχεία σχετικά με τον τρόπο με τον οποίο ανακτώνται οι πληροφορίες που αποθηκεύονται στο DNA από τον κυτταρικό μηχανισμό θα μας βοηθήσουν σε αυτό που ακολουθεί. Πρώτον, το «κεντρικό δόγμα» της βιολογίας δηλώνει ότι το DNA δημιουργεί RNA και ότι το RNA παράγει πρωτεΐνες, οι μοριακές μηχανές που κάνουν το μεγαλύτερο μέρος της εργασίας που απαιτείται μέσα σε ένα κύτταρο. Η πρώτη διαδικασία είναι γνωστή ως μεταγραφή, στην οποία θα επικεντρωθούμε σε αυτό το βιβλίο, η δεύτερη ονομάζεται μετάφραση. Η μεταγραφή του DNA πραγματοποιείται από έναν μοριακό κινητήρα που ονομάζεται πολυμεράση RNA. Μια πολυμεράση RNA τυπικά μεταγράφει περίπου 100 bp s -1 στα βακτήρια, ενώ στους ανθρώπους, τα νουκλεοσώματα δημιουργούν φραγμό στην πρόοδό της και ο ρυθμός είναι περίπου 25 bp s -1 ή περίπου 1 kbp min -1. Δεν είναι ενεργοποιημένα όλα τα γονίδια στα μόρια DNA: το πρότυπο των ενεργών γονιδίων αλλάζει από κύτταρο σε κύτταρο (ένα μάτι, ένα συκώτι και ένα λευκό αιμοσφαίριο έχουν όλα πολύ διαφορετικά σύνολα ενεργών γονιδίων) και με την πάροδο του χρόνου (όταν κολλάμε γρίπη , ένα συγκεκριμένο σύνολο γονιδίων ενεργοποιείται για την αντιμετώπιση της φλεγμονής). Το μοτίβο της γονιδιακής ενεργοποίησης εξαρτάται από μια πολύπλοκη αλληλεπίδραση μεταξύ της θέσης των γονιδίων, των βοηθητικών πρωτεϊνών (που ονομάζονται παράγοντες μεταγραφής) και των μοριακών σημαδιών στο DNA και των ιστονών που βρίσκονται «επάνω» του γενετικού κώδικα και διευκολύνουν ή εμποδίζουν τη μεταγραφή. Μια δεύτερη διαδικασία που θα θίξουμε είναι η αντιγραφή του DNA. Πριν από τη διαίρεση του κυττάρου, το DNA του πρέπει να αντιγραφεί (έτσι ώστε ακριβώς πριν από τη μίτωση να υπάρχουν 92 χρωμοσώματα στον πυρήνα). Ο αναδιπλασιασμός εκτελείται από μια άλλη πολυμεράση, γνωστή ως πολυμεράση DNA - αυτή είναι λίγο πιο γρήγορη από την ξαδέρφη της RNA, και κινείται με ταχύτητα έως και 5 kbp min -1 στα θηλαστικά (1000 bp s -1 στα βακτήρια).

Ο αριθμός σύνδεσης

Καθώς το DNA είναι μια διπλή έλικα, μπορούμε να ρωτήσουμε ποιο είναι το «βήμα» του (το ύψος μιας πλήρους στροφής). Στο B-DNA, αυτό είναι περίπου 10,5 ζεύγη βάσεων ή 3,6 nm. Ο αριθμός σύνδεσης είναι ένας άλλος σημαντικός παράγοντας για την περιγραφή της τρισδιάστατης δομής ενός μορίου DNA, τον οποίο περιγράφουμε σε αυτή την ενότητα. Θα χρησιμοποιήσουμε αυτήν την έννοια στην ενότητα 3, όταν θα συζητήσουμε τη φυσική της υπερέλιξης του DNA.

Ο αριθμός σύνδεσης ορίζεται για οποιεσδήποτε δύο καμπύλες, είτε κλειστές, είτε διατηρούνται σταθερές στα άκρα τους: μετρά τον αριθμό των φορών που οι δύο καμπύλες περιστρέφονται η μία γύρω από την άλλη. Μπορούμε επίσης να ορίσουμε έναν αριθμό σύνδεσης για μια κορδέλα, λαμβάνοντας υπόψη την περιέλιξη των δύο άκρων της: σε αυτήν την περίπτωση, αυτή η ποσότητα είναι απλώς ίση με τον αριθμό των φορών που στρίβουμε την κορδέλα. Εάν κλείσουμε την κορδέλα, πρέπει να κάνουμε έναν ακέραιο αριθμό στροφών 360 μοιρών, έτσι ώστε η επάνω άκρη στη μία άκρη της κορδέλας να ταιριάζει με την επάνω άκρη της άλλης άκρης (βίντεο 1).

Βίντεο 1. Αυτό το βίντεο δείχνει ένα απλό πείραμα που δείχνει την έννοια του συνδέσμου αριθμού, χρησιμοποιώντας μια χάρτινη κορδέλα, κόλλα και ένα ψαλίδι. Διαθέσιμο στη διεύθυνση http://iopscience.iop.org/book/978-0-7503-1602-6.

Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό του αριθμού σύνδεσης μιας κλειστής κορδέλας, όπως μια λαστιχένια ταινία, είναι ότι παραμένει σταθερός με την πάροδο του χρόνου, ενώ αυτό δεν ισχύει για μια γραμμική κορδέλα (όπως αυτές που χρησιμοποιούνται για το τύλιγμα δώρων). Γιατί; Αρχικά, σκεφτείτε την ανοιχτή κορδέλα. Εάν στρίψετε τα άκρα, μπορείτε να αλλάξετε σαφώς τον αριθμό σύνδεσης κατά βούληση. Μόλις σφραγίσετε τα δύο άκρα, όμως, για παράδειγμα, όταν κολλήσετε τα άκρα μιας χάρτινης κορδέλας μεταξύ τους, τότε ο αριθμός σύνδεσης παγιδευτεί, δεν υπάρχει τρόπος να τον αλλάξετε.

Επειδή οι δύο κλώνοι ενός μορίου DNA στη χαλαρή του κατάσταση διατηρούνται κοντά και σε ίση απόσταση με το ζευγάρωμα βάσεων μέσω δεσμών υδρογόνου, μπορούμε να τις αναπαραστήσουμε με τις δύο άκρες μιας κορδέλας δεδομένου πλάτους και θα χρησιμοποιήσουμε αυτήν την αναλογία ως εξής. Μια κορδέλα που μοιάζει με DNA είναι πολύ στριμμένη. Καθώς η διπλή έλικα του B-DNA κάνει μια πλήρη στροφή κάθε 10,5 ζεύγη βάσεων (βλ. παραπάνω), ο αριθμός σύνδεσης ενός βρόχου B-DNA (που ονομάζεται πλασμίδιο) 1050 ζευγών βάσεων είναι 100, ενώ ο αριθμός σύνδεσης ενός τυπικού ανθρώπου Το χρωμόσωμα είναι περίπου 10 εκατομμύρια!

Δύο κλειστές καμπύλες με συνδετικό αριθμό n συνδέονται στο n σημεία. Μπορείτε να πείσετε τον εαυτό σας για αυτό με ένα απλό αλλά προσεγμένο πείραμα (βίντεο 1). Πρώτα, πάρτε δύο κορδέλες, χρωματίζοντάς τες στη μία πλευρά για να μπορείτε να δείτε καθαρά το στρίψιμο. Στη συνέχεια, πάρτε τις δύο άκρες της πρώτης κορδέλας και κολλήστε τις μεταξύ τους, χωρίς να εισάγετε καμία περιστροφή. Μετά από αυτό, πάρτε τη δεύτερη κορδέλα και τώρα στρίψτε την κατά 360 μοίρες πριν κολλήσετε τις άκρες, προσέχοντας τα χρωματιστά πρόσωπα να ταιριάζουν μεταξύ τους. Τώρα πάρτε λίγο ψαλίδι και κόψτε και τις δύο κορδέλες στη μέση, κατά μήκος των μακριών αξόνων τους. Η μη στριμμένη κορδέλα κόβεται εύκολα για να δώσει δύο ασύνδετες μικρότερες κορδέλες. Η περίπτωση της στριμμένης κορδέλας δεν είναι τόσο ασήμαντη: τα δύο μισά που προκύπτουν συνδέονται σε ένα σημείο, σχηματίζοντας αυτό που είναι γνωστό στα μαθηματικά ως σύνδεσμος Hopf (βίντεο 1). Παρεμπιπτόντως, αν σας άρεσε αυτό το πείραμα, μπορείτε να δοκιμάσετε να δείτε τι θα συμβεί εάν η κορδέλα έχει μισή ή μιάμιση περιστροφή: τα αποτελέσματα είναι αρκετά ενδιαφέροντα!

Σε αυτό το απλό πείραμα, αν σκεφτούμε την κορδέλα ως μόριο DNA, το ψαλίδι αντιπροσωπεύει την πρωτεΐνη ελικάσης, η οποία κόβει τους δύο κλώνους του DNA κατά την αντιγραφή. Η σύνδεση δεν είναι καλό για τα μόρια που αναπαράγονται πρόσφατα: θέλουν απεγνωσμένα να ακολουθήσουν χωριστούς δρόμους για να δημιουργήσουν δύο διαφορετικά κύτταρα. Πράγματι, εάν ο σύνδεσμος δεν αναιρεθεί γρήγορα, το κύτταρο θα πεθάνει (πιο ακρίβεια, αυτοκτονήσει, που ονομάζεται «απόπτωση») αντί να αναπαραχθεί με επιτυχία. Αυτός ο τοπολογικός κίνδυνος που κρύβεται πίσω από την αντιγραφή του DNA είναι ο λόγος για τον οποίο τα κύτταρα περιέχουν μια τεράστια ποσότητα «τοπολογικών ενζύμων», γνωστά συλλογικά ως τοποϊσομεράσες. Η τοποϊσομεράση τύπου II είναι μια μοριακή μηχανή ικανή να κόβει και στη συνέχεια να επανασυνδέει το δίκλωνο DNA, για να λύσει έναν κόμπο ή έναν σύνδεσμο. Το DNA των περισσότερων βακτηρίων είναι ένας ενιαίος γιγαντιαίος βρόχος, επομένως το μοντέλο του πειράματός μας προσομοιώνει απευθείας αυτό που του συμβαίνει κατά την αντιγραφή. Επομένως, μια τοποϊσομεράση τύπου II πρέπει να δρα σε καθένα από τα

400 000 σημεία σύνδεσης που δημιουργούνται σε κάθε γύρο αντιγραφής ενός Escherichia coli σφάλμα, το οποίο εμφανίζεται περίπου μία φορά κάθε 30 λεπτά σε ταχέως αναπτυσσόμενα βακτήρια στο εργαστήριο. Αν και τα ανθρώπινα χρωμοσώματα είναι γραμμικά, δεν είναι ασφαλή ούτε από την παγίδα σύνδεσης. Πράγματι, τα περισσότερα ευκαρυωτικά χρωμοσώματα περιέχουν έναν εκτεταμένο αριθμό γονιδιωματικών βρόχων, οι οποίοι συγκρατούνται μεταξύ τους από πρωτεΐνες που δεσμεύουν το DNA (περισσότερα για αυτό στην ενότητα 3), και αυτοί οι βρόχοι είναι συχνά παρόντες κατά την αντιγραφή, οδηγώντας σε εμπλοκή εάν η τοποϊσομεράση II είναι ανενεργή.

Είναι αξιοσημείωτο ότι η παγίδα σύνδεσης αξιοποιείται από πολλά αντικαρκινικά φάρμακα, τα οποία βασίζονται σε διαφορετικές μοριακές οδούς για την αναστολή της δράσης των τοποϊσομερασών. Η ιδέα είναι ότι τα καρκινικά κύτταρα διαιρούνται ταχύτερα από άλλα, επομένως αντιμετωπίζουν το πρόβλημα σύνδεσης πιο συχνά. Επειδή η αναστολή της τοποϊσομεράσης οδηγεί σε σύνδεση και κυτταρικό θάνατο, αυτά τα φάρμακα είναι στατιστικά πιο πιθανό να σκοτώσουν καρκινικά κύτταρα, τα οποία είναι πιο πιθανό να διαιρούνται ανά πάσα στιγμή. Αυτός είναι επίσης ο λόγος για τον οποίο τα τυπικά αντικαρκινικά φάρμακα έχουν δυσάρεστες παρενέργειες όπως η τριχόπτωση: στοχεύουν όλα τα κύτταρα που διαιρούνται γρήγορα—επομένως τα τριχωτά κύτταρα καταστρέφονται, καθώς και τα καρκινικά κύτταρα.

Βασικές αρχές οργάνωσης γονιδιώματος

Για να κατανοήσουμε πόσο τρομακτικό είναι το πρόβλημα της οργάνωσης του γονιδιώματος μέσα στο κύτταρο, μπορούμε να ξεκινήσουμε από μια απλή εκτίμηση στο πίσω μέρος του φακέλου. Το ανθρώπινο γονιδίωμα ενός διπλοειδούς πυρήνα περιέχει περίπου 6 δισεκατομμύρια ζεύγη βάσεων συνολικά. Γνωρίζουμε ότι ένα ζεύγος βάσεων στο Β-DNA έχει μέγεθος περίπου 0,34 nm, επομένως, εάν επεκτείναμε όλο το DNA μέσα σε ένα μόνο κύτταρο του σώματός μας, θα είχε μήκος περίπου 2 μέτρα, ωστόσο θα πρέπει να χωρέσει σε πυρήνα, που έχει διάμετρο μόνο περίπου 10 μικρά. Για να καταγράψετε την τεράστια έκταση του προβλήματος, προσπαθήστε να υπολογίσετε ολόκληρη την ποσότητα DNA σε μέτρα που περιέχει το κάθε σώμα μας. Αυτό είναι ένα πραγματικά αστρονομικό ποσό: θα ήταν αρκετό για να φτάσει στον Πλούτωνα από τη Γη! Ο λόγος για τον οποίο μια τέτοια απίστευτη ποσότητα DNA μπορεί να αποθηκευτεί σε κύτταρα, ή οργανισμούς, είναι ότι είναι τόσο λεπτό. Ακόμα κι έτσι, ένα αρκετά μεγάλο κλάσμα της μάζας μας είναι DNA, και η συσκευασία όλων είναι ένα εξαιρετικά μη τετριμμένο πρόβλημα για τη φυσική των πολυμερών.

Για να συζητήσουμε πώς οι ζωντανοί οργανισμοί λύνουν αυτό το πρόβλημα, ας ξεκινήσουμε με τις απλούστερες μορφές ζωής. Οι βακτηριοφάγοι, ή φάγοι, είναι ιοί που επιτίθενται και σκοτώνουν βακτήρια—επομένως, είναι καταρχήν χρήσιμοι για ευκαρυώτες όπως εμείς, και μπορεί ακόμη και να παρέχουν μια βιώσιμη, αν είναι τρομακτική, εναλλακτική λύση αντί των αντιβιοτικών, εάν εξαντληθούμε από αυτά στο μέλλον (σε αντίθεση με τα φάρμακα, αυτοί οι ιοί εξελίσσονται με τα βακτήρια, επομένως μπορούν να συνεχίσουν να τα σκοτώνουν καθώς μεταλλάσσονται). Οι φάγοι είναι ουσιαστικά σφαίρες (το καψίδιο) γεμάτες με ένα πολυμερές, δίκλωνο DNA, σε σχεδόν κρυσταλλικές πυκνότητες. Η οργάνωση του γονιδιώματος δεν είναι απλούστερη από αυτό - ωστόσο, χρειάστηκε πολύς χρόνος για να προσδιοριστεί η δομή του DNA μέσα στο καψίδιο!

Ένα από τα ζητήματα που κάνει το πρόβλημα μη τετριμμένο είναι ένας ανταγωνισμός μεταξύ ζυγαριών. Το ένα είναι το μέγεθος του καψιδίου, το οποίο για τους περισσότερους φάγους είναι περίπου 50-100 nm. Ένα άλλο είναι το μήκος εμμονής του DNA, το οποίο είναι το μήκος πάνω από το οποίο κάμπτεται το DNA λόγω θερμικών διακυμάνσεων. Το μήκος επιμονής είναι επίσης περίπου 50 nm, επομένως οι διακυμάνσεις είναι σημαντικές σε αυτήν την κλίμακα, γεγονός που μπερδεύει λίγο τα πράγματα. Η τρέχουσα συναίνεση είναι ότι οι ηλεκτροστατικές και στερικές αλληλεπιδράσεις DNA-DNA είναι οι βασικοί παράγοντες σε αυτές τις πυκνότητες και οδηγούν σε μια διάταξη του DNA που μοιάζει με καρούλι, λίγο σαν μια άγκυρα ναυτικού που είναι καλά αποθηκευμένη μακριά. Εάν ενδιαφέρεστε για τη φυσική των φάγων, ο Charles Knobler και ο Bill Gelbart έγραψαν ένα προσεγμένο δημοφιλές άρθρο φυσικής στο Η Φυσική Σήμερα το 2008, που αξίζει να διαβαστεί.

Η κατανόηση των βασικών στοιχείων της διάταξης του DNA στους βακτηριοφάγους είναι χρήσιμη, ειδικά επειδή δείχνει ότι τα απλά μοντέλα φυσικής πολυμερών και οι ιδέες είναι πολύ χρήσιμες στο πεδίο. Ωστόσο, η οργάνωση του γονιδιώματος σε βακτήρια και ευκαρυώτες είναι πολύ πιο περίπλοκη! Αυτό συμβαίνει επειδή οι φυσικές παράμετροι διαφέρουν και επειδή υπάρχουν πρωτεΐνες που σχετίζονται με τέτοια γονιδιώματα, που επηρεάζουν τη φυσική τους. Θα συζητήσουμε τη σημασία των πρωτεϊνών για την οργάνωση του γονιδιώματος στους ευκαρυώτες στην ενότητα 3. Εδώ, εξετάζουμε ορισμένα βασικά χαρακτηριστικά της φυσικής πολυμερών του οργανισμού, τα οποία αξίζει να ληφθούν υπόψη.

Σε ένα βακτήριο όπως π.χ Escherichia coli, υπάρχουν περίπου 4 εκατομμύρια ζεύγη βάσεων (που θα ήταν περίπου 1 mm αν τεντωθούν) που περιέχονται σε ένα μέγεθος κυψέλης περίπου 1–2 microns. Ένας απλός υπολογισμός δείχνει ότι η πυκνότητα είναι πολύ μικρότερη από ό,τι στον φάγο, καθώς το ίδιο το DNA αποτελεί μόνο περίπου το 1% του συνολικού όγκου των κυττάρων. Το βακτηριακό DNA διαφέρει επίσης από το DNA του φάγου στο ότι ξετυλίγεται συνεχώς ελαφρώς από μερικές από τις πρωτεΐνες του μικροβίου —με αποτέλεσμα το DNA να είναι «υπερτυλιγμένο». Θα δούμε μερικές συνέπειες αυτού στην ενότητα 3.

Στους ανθρώπους (ή σε άλλους ευκαρυώτες), το DNA υπάρχει ως χρωματίνη. Ο όγκος που καταλαμβάνουν τα χρωμοσώματά μας είναι περίπου το 10%-20% του όγκου του πυρήνα όπου είναι περιορισμένα. Ενώ το πρόβλημα της οργάνωσης του γονιδιώματος είναι πολύ δύσκολο, γνωρίζουμε μερικά πράγματα για τη μορφολογία των χρωμοσωμάτων χάρη στη μικροσκοπία (στην πραγματικότητα, αυτά τα γεγονότα ήταν γνωστά πολύ πριν από τους Watson και Crick!). Πρώτον, τα χρωμοσώματα συμπυκνώνονται και γίνονται μεμονωμένα ορατά κάτω από ένα μικροσκόπιο κατά τη μίτωση -όταν το κύτταρο διαιρείται- σχηματίζοντας τις γνωστές κυλινδρικές δομές σε σχήμα Χ που εμφανίζονται στα εγχειρίδια βιολογίας. Όταν το κύτταρο δεν διαιρείται (κατά τη διάρκεια της «ενδιάμεσης φάσης») τα χρωμοσώματα αποσυμπυκνώνονται, και πολύ περισσότερο παρόμοια με τα διογκωμένα πολυμερή.

Γνωρίζουμε επίσης ότι κατά τη διάρκεια της ενδιάμεσης φάσης τα χρωμοσώματα σχηματίζουν «εδάφη». By 'painting' each of them a different colour, we can see that each chromosome occupies its own volume, and there is little intermingling between different chromosomes. The physical basis of territory formation was studied by Angelo Rosa and Ralf Everaers a few years back. They modelled human chromosomes as a melt of polymers interacting only via volume exclusion. Under such assumptions, after the mitotic cylinders decondense at the onset of interphase, if we could wait long enough all chromosomes would intermingle (because this is the equilibrium state of a melt of linear polymers). However, due to sheer size, the dynamics of human chromosomes are so sluggish that they remain separate forever in practice, as calculations suggest that the intermingling time is several decades! Rosa and Everaers' simulations also suggest that within simpler eukaryotes such as yeast, the intermingling is much quicker, and territories should not be observed there, in good agreement with experimental observations.


The biochemical steps by which bacterial topoisomerases alter the topology of DNA are well known. However, it has been a more vexing task to establish physiological roles and sites of action of the different topoisomerases within the context of the bacterial cell cycle. This difficulty can be attributed in part to the redundancy among the activities of the different enzymes. In this microreview, we will focus on recent progress in understanding the topological structure of the chromosome, analysis of topoisomerase mechanism in single-molecule assays and recent data on the regulation and integration of topoisomerase activity within the cell cycle that have all brought a new perspective to the action of topoisomerases in the bacterial cell.

Topological linkage between the two strands of DNA molecules such as the closed circular chromosome of Escherichia coli is described by the linking number, Lk, a quantitative measure of the number of times the two parental strands are wound about each other. In a simple sense, this winding takes two forms: the windings of each strand about the other in the DNA helix, which are often referred to as duplex turns and the windings of the helix about itself in superhelical turns. Again, in the simplest sense, Lk is the sum of the number of duplex turns and superhelical turns with a sign convention thrown in to account for the fact that Lk cannot be changed in a closed DNA ring unless at least one of the strands is broken and resealed. Superhelicity is a powerful thermodynamic driving force for many reactions that occur on the chromosome. This is because the preferred thermodynamic state of a closed circular DNA molecule is the relaxed one, in which there are no supercoils. Thus, reactions that demand unwinding of the parental template strands, such as the transition from a closed to open complex between RNA polymerase and a promoter or DNA replication, are favoured in negatively supercoiled molecules, whereas reactions that demand rewinding of the template strands, such as regression of nascent DNA at a stalled replication fork, are favoured in positively supercoiled molecules. Because Lk cannot change in a closed ring, any alteration of local DNA topology is absorbed by a compensating alteration in a distal part of the molecule. Therein lie the problems solved by topoisomerases.

There are three major tasks for topoisomerases in the bacterial cell: removal of excess positive windings of the chromosome generated as a result of DNA replication maintenance of topological homeostasis of the chromosome and reduction of the topological linkage between sister chromosomes to exactly zero during chromosome partition and cytokinesis. Replication of the Ε. coli chromosome is bidirectional, and each replication fork proceeds at a speed of 700–1000 nucleotides s −1 . Removal of each duplex turn as the parental template is unwound generates a compensatory positive overwinding that can take one of two forms: a positive supercoil that forms in the unreplicated region of the chromosome ahead of the fork or a precatenane, a positive winding of the two partially replicated sister strands about each other behind the fork. This latter topological form was first suggested by Champoux and Been (1980 ) who noted that, unless the replisomes themselves formed a topological barrier, the positive windings should be able to equilibrate both in front of and behind the replication forks. If not removed at the completion of replication, precatenanes convert to catenanes, i.e. linkages between the two sister chromosomes. DNA replication in Ε. coli generates somewhere in the region of 200 excess positive linkages s −1 that have to be removed by the topoisomerases.

As if this were not enough of a topological problem, topological homeostasis is beset by the fact that transcription also roils the landscape. As pointed out in the twin-domain supercoiling model of Liu and Wang (1987 ), movement of RNA polymerase through a DNA template creates a screw-like action. If the DNA is constrained from rotating, positive supercoils will accumulate ahead of the transcribing RNA polymerase and negative supercoils will accumulate behind. Thus, to maintain an appropriate global superhelical density on the chromosome, these excess supercoils have to be removed.

Finally, even one residual topological linkage between sister chromosomes at the point of chromosome partition and cytokinesis during the cell cycle is catastrophic, resulting in chromosome breakage and the generation of anucleate cells. In addition, all these topological issues are complicated by the fact that the chromosome itself is organized into topological domains with barriers that impede the free diffusion of supercoils. Any complete description of topoisomerase function in the cell must therefore take into account the likelihood that spatial and temporal control of topoisomerase action is essential.

Can we now provide a complete assessment of topoisomerase action for even one of these tasks? Πιθανώς όχι. We have learned many new things about topoisomerase action in the cell over the last few years, but some of the new data provoke a reconsideration of previous thinking. Of the four topoisomerases present in Ε. coli, biochemical analysis in vitro has demonstrated that topoisomerase (Topo) I, Topo III and Topo IV share the ability to relax negative supercoils [(–)sc]. Topo IV and DNA gyrase can relax positive supercoils [(+)sc]. Furthermore, Topo III, Topo IV and gyrase can decatenate and unknot circular DNA molecules ( Champoux, 2001 ). The original idea was that gyrase is primarily responsible for the relaxation of (+)sc. Although standard biochemical measurements made in solution that average the action of all topoisomerase molecules on all substrate molecules demonstrated that the gyrase- and Topo IV-catalysed rates of (+)sc removal were comparable (≈ 0.2–0.3 strand passage events min −1 ), the gyrase-catalysed reaction was processive, whereas the Topo IV-catalysed reaction was distributive ( Hiasa and Marians, 1994 ). Moreover, the unique ability of gyrase directly to convert positive supercoils to negative ones ( Brown and Cozzarelli, 1979 ) strongly implicated gyrase as the primary agent in removing positive supercoils to achieve topological homeostasis. Similarly, the large difference in decatenation activity observed for Topo IV (five strand passage events min −1 ) compared with gyrase (0.07 events min −1 ) ( Hiasa and Marians, 1996 ) suggested a unique role for Topo IV in the removal of precatenanes and catenanes. This assignment was supported by the demonstration in vivo that Topo IV alone removed catenanes between plasmid DNA rings and knots within a DNA ring generated by the action of a site-specific resolvase ( Zechiedrich et al., 1997 Deibler et al., 2001 ) and that the rate of decatenation of plasmid DNA molecules when gyrase alone was active was roughly 1/100th of that when both gyrase and Topo IV were active ( Zechiedrich and Cozzarelli, 1995 ). This picture has now been muddied.

Khodursky et al. (2000 ) measured the rate of replication fork progression in synchronized cells in which either gyrase alone or both gyrase and Topo IV were inactivated by treatment with different concentrations of novobiocin. Passage of the replication fork was scored by the increase in the dosage of any particular gene as measured by hybridization of the DNA to microarrays consisting of polymerase chain reaction (PCR) products representing 96% of the Ε. coli open reading frames (ORFs). By taking samples over time after release from the synchronization procedure and correlating the increase in gene dosage with the physical map of the chromosome, progression of the replication fork could be visualized and the rate of progression determined. Their results suggest that, in the absence of gyrase, the rate of chromosomal replication fork progression is decreased to one-third the initial value, but replication, presumably now supported by Topo IV, can still progress over long distances. Inhibition of both gyrase and Topo IV caused a complete cessation of fork progression. To assess whether Topo IV-supported replication fork progression resulted from the elimination of (+)sc or precatenanes, the authors examined the influence of the absence of Topo IV and gyrase activity on the accumulation of (+)sc in intracellular plasmid DNAs. Accumulation of (+)sc, presumably resulting from an imbalance in the removal of supercoils generated during transcription on the plasmids, required elimination of both activities. Because neither Topo I nor Topo III is expected to have the ability to relax (+)sc, the authors argued that Topo IV was supporting replication fork progression by removing (+)sc, not precatenanes.

These studies challenge two previous tenets of intracellular management of topology: that only gyrase supports replication fork progression and that Topo IV prefers to work on precatenanes. With respect to the latter point, previous studies established that precatenanes do arise during the replication of small plasmid DNAs in vivo και in vitro ( Peter et al., 1998). Whereas Khodursky et al. (2000 ) demonstrated that Topo IV bound to (+)sc and (–)sc with equal avidity, other studies show that Topo IV binds fivefold better to right-handed catenanes compared with (+)sc ( Hiasa and Marians, 1996 ). It has also been demonstrated in vitro that Topo IV, but not gyrase, can unlink precatenated DNA ( Nurse et al., 2003 ) and that precatenane removal can support fork progression ( Hiasa and Marians, 1996 ). Interestingly, a study that examined the position of etoposide-induced Topo II cleavage sites on plasmid DNA replicating in Ξενόπους egg extracts concluded that the enzyme was working by eliminating precatenanes ( Lucas et al., 2001 ). Biochemically, Topo IV is the direct bacterial ancestor of the eukaryotic Topo II ( Peng and Marians, 1995 ). Looking at the microarray data on fork progression through the lens of the previous data on precatenanes, we need to consider that perhaps precatenanes do not arise during chromosomal replication. The anchoring of the replication factory in the centre of the cell could conceivably prevent conversion of (+)sc to precatenanes by diffusion behind the replisome. This possibility will be discussed again below.

New single-molecule techniques of investigating topoisomerase action have delivered interesting and important information. In these experiments, a long DNA (≈ 40 kbp) is stretched between a glass slide and a magnetic bead floating above the slide. The bead can be rotated by a magnet. Thus, when a single molecule of duplex DNA is rotated, either (+) or (–)sc are generated to compensate for either the underwinding or the overwinding of the DNA ( Strick et al., 2000 ). A slightly different system is used to form braids between two duplex DNAs ( Charvin et al., 2003 Stone et al., 2003). Here, both molecules are attached to two beads, one is held in an optical trap and the other is held by a micropipette. Rotation of the micropipette generates a braid that is akin to the interwinding of two DNA duplexes in a catenane. Variation in topology corresponds to the distance between the bead and the slide in the former case and between the two beads in the latter case, both of which are recorded by a video camera.

In single-molecule experiments, Crisona et al. (2000 ) demonstrated that Topo IV relaxed (+)sc at a rate of three strand passage events s −1 , 20-fold greater than the rate for relaxation of (–)sc. This preference for left-handed crossings of the duplex as opposed to right-handed ones was dramatically illustrated by the activity of Topo IV on braided DNAs ( Stone et al., 2003). When the braids were intertwined by a moderate number of linkages, the preference was nearly absolute. Only the left-handed braid was unlinked. Unlinking of the right-handed braid required that the DNAs be extensively intertwined so that compensatory left-handed supercoils were generated. Similar observations were made by Charvin et al. (2003 ). To account for the fact that it has been demonstrated quite clearly that Topo IV is active on right-handed substrates, such as the catenanes that arise during θ-type DNA replication, Crisona et al. (2000 ) showed that, at the catenane density typically found during replication of small plasmid DNAs, the angle of crossing adopted by the catenated duplexes will be close to random. This phenomenon occurs because, at these low densities of specific catenation, the crossings are relatively mobile, the angle of intersection of the duplex DNAs could reflect that of either a right-handed or a left-handed crossing high catenation densities will tend to be more restrictive. Thus, despite the clear chiral sensing exhibited by the enzyme, it will still be able to unlink the nominally right-handed crossings.

The argument that Topo IV relaxes (+)sc in the cell has received significant support from these single-molecule analyses. The preference of Topo IV for left-handed crossings allows it to be active on the positive supercoils that arise during replication yet spare the negative supercoils, thus preserving the overall negative superhelicity of the chromosome as a driving force for DNA metabolism. The rate of relaxation of positive supercoils determined is similar to the rate of unlinking of DNA braids (2.5 and one strand passage events s −1 for left-handed and right-handed braids respectively). These rates are consistent with the overall decatenation rate during plasmid replication in vivo ( Zechiedrich and Cozzarelli, 1995 ). Such rates suggest that the action of 50 or so molecules of Topo IV on each half of the chromosome (or within the topological domains where replication is ongoing) would be sufficient to support replication fork progression completely.

Whereas numerology of this sort is seductive and appears to give a satisfactory answer, it does not seem that all issues have been resolved. Obviously, there are many factors in the cell that can modify the activity of the enzymes in question. Nevertheless, based on the microarray and single-molecule analyses, a reasonable model is that removal of (+)sc by gyrase and Topo IV followed by the removal of a few residual catenanes by Topo IV is the pathway taken by the cell to deal with the variations in Lk produced by replication. In this model, all topological entanglements between the sisters are eliminated at the end of replication, and complete segregation could be achieved immediately. However, the picture in the cell seems to be more complex.

Khodursky et al. (2000 ) found that Topo IV supported fork progression at one-third the rate observed when both gyrase and Topo IV were present, yet the rates derived from the single-molecule analysis and the concentration of Topo IV in the cell ( Espeli et al., 2003a ) suggest that it should be able to support fork progression at the maximum rate. Unfortunately, no similar single-molecule analysis of gyrase has been reported, therefore it is difficult to assess whether such one-to-one correspondences can be made. It will be important to determine whether the rate of (+)sc unlinking by gyrase is in the range of 4 s −1 , as predicted by combining the microarray and single-molecule observations discussed above. However, the reduction in the rate of fork progression observed when gyrase is inactivated suggests that most of the 1000 or so molecules of Topo IV present in the cell ( Espeli et al., 2003a ) do not have free access to the DNA. Also, in these experiments, unlike when both gyrase and Topo IV were active, Topo IV-supported fork progression ceased after some time and replication was not completed.

Observations made on the consequences of partial inactivation of gyrase activity in vivo challenge the view that Topo IV is involved in the support of replication fork progression. Grompone et al. (2003 ) have shown that, in a context in which the activity of gyrase is decreased slightly (a temperature-sensitive gyrB mutant is held at the semi-permissive temperature), cell growth is completely dependent on the replication restart machinery (for a review of replication restart, see Cox et al., 2000 ). This observation suggests that, when gyrase is not fully functional, (+)sc accumulate ahead of the fork and block progression. If Topo IV is able to support fork progression at one-third of the wild-type rate by removing (+)sc when gyrase is totally absent, why is it not able to compensate for a slight reduction in gyrase activity? Grompone et al. (2003 ) suggest that the partially inactive gyrase is unable to keep pace with the generation of (+)sc such that an excess of (+)sc stalls the replication fork, the components of the replisome dissociate, and the (+)sc are then transformed into precatenanes allowing subsequent assembly of a new replisome by the restart machinery and resumption of replication fork progression. These observations suggest that Topo IV does not compensate for either the absence or the debilitation of gyrase during replication fork progression by removing either (+)sc or precatenanes. This interpretation implies that precatenanes are not a barrier to replication and that the Topo IV present in the cell is not free to interact with the DNA at all times.

Support for the restriction of Topo IV activity comes from studies from this laboratory suggesting a spatial and temporal regulation of Topo IV activity ( Espeli et al., 2003a ). Quinolone-induced, DNA gyrase- or Topo IV-mediated cell killing as a function of the cell cycle was measured to determine when gyrase and Topo IV activity was manifest. An isogenic pair of strains was used in which the GyrA subunit of DNA gyrase was either sensitive or resistant to the quinolone norfloxacin and also carried a temperature-sensitive dnaC mutation that allowed synchronization of cell growth by a triple temperature shift procedure. Formation of quinolone-induced double-strand breaks correlates with the cytotoxicity of these drugs and has been shown to occur when the replication fork encounters the frozen topoisomerase–quinolone–DNA complex ( Hiasa et al., 1996 Hiasa and Shea, 2000 ). When gyrase was sensitive to norfloxacin, cell killing was coincident with the onset of replication, consistent with random positioning of gyrase on the DNA. On the other hand, when gyrase was resistant to norfloxacin, cell killing occurred only late in the cell cycle, implying that Topo IV was restricted from access to the DNA until the end of the replication cycle. This interpretation was supported by the use of TUNEL to label all quinolone-mediated, SDS-induced, double-strand breaks on the nucleoid across the cell cycle. This technique should measure residence of any gyrase or Topo IV molecule on the DNA. The results were in complete agreement with the cell killing experiments. This regulation of Topo IV activity appears to be linked to the specific localization of its subunits, ParE and ParC, in the cell. In most cells, ParC localized to the replication factory in a manner that was dependent on the τ and γ subunits of the cellular replicase. Surprisingly, ParE localization was not the same. ParE formed foci in the DNA-free spaces of the cell, primarily in proximity to the forming septum. We have proposed that temporal regulation of Topo IV activity is enforced by a spatial regulation that keeps the two subunits apart for the majority of the cell cycle and allows them to associate in the centre of the cell when decatenation is absolutely required at the end of replication. Consistent with this model is the finding that a mutation in dnaX (encoding τ and γ) that does not affect replication impairs chromosome decatenation and causes ParC to become delocalized.

Another interesting possibility is that components of the septal ring are important for both the subcellular localization and the activity of Topo IV. We have demonstrated an interaction between ParC and the C-terminal domain of FtsK ( Espeli et al., 2003b ). FtsK is a bifunctional protein composed of three domains ( Liu et al., 1998). The N-terminal transmembrane domain is required for cell viability and is presumed to be involved in closure of the septal ring ( Draper et al., 1998). The C-terminal part of FtsK is cytoplasmic and is required for XerCD-catalysed resolution of chromosomal dimers at dif ( Steiner et al., 1999). This portion of FtsK is composed of two domains: a proline- and glutamine-rich domain of unknown function and a 500-amino-acid, C-terminal, AAA domain (domain 3, FtsKντο) that is necessary for normal chromosome segregation ( Liu et al., 1998 ), in part because of its effect on XerCD recombination at dif ( Recchia et al., 1999). FtsKντο is a hexameric DNA-dependent ATPase that can alter the topology of DNA and affect the direction of XerCD-catalysed resolution in vitro ( Aussel et al., 2002). Topo IV-catalysed decatenation of multiply linked DNA dimers in vitro is stimulated two- to threefold by FtsKντο, whereas the gyrase-catalysed reaction is not ( Espeli et al., 2003b ). Therefore, FtsK may capture Topo IV at the septum and participate in chromosome decatenation. This possibility is supported by the recent demonstration that, in the presence of FtsKντο, XerCD can decatenate plasmid DNAs that carry a dif site (Ip et al., 2003). This exciting observation raises the interesting possibilities that FtsK participates directly in chromosome decatenation, possibly with the XerCD–FtsK combination acting as a fail-safe decatenation activity, and that there may be a specific locus in the cell at which all chromosome decatenation occurs.

How can one reconcile the various observations that indicate on the one hand that Topo IV is free to access the chromosome and participates in supporting replication fork progression and indicate on the other hand that access of Topo IV to the DNA is restricted to late in the cell cycle when it probably acts only on catenanes? Perhaps the key to doing so lies in the fact that, under the conditions used by Khodursky et al. (2000 ) for their measurements of Topo IV-supported replication fork progression, gyrase was inactivated, resulting in global relaxation of the chromosome (i.e. negative supercoiling would be lost rapidly). Recent observations suggest that proper chromosome dynamics require negative supercoiling. MukB is an SMC-like protein thought to be involved in packaging the sister chromosomes shortly after they exit the replication factory ( Ohsumi et al., 2001 ). Μεταλλάξεις σε mukB are temperature sensitive, displaying chromosome segregation defects and producing anucleate cells at the non-permissive temperature ( Niki et al., 1991 ). Suppression of the mukB phenotypes is achieved by inactivating Topo I ( Sawitzke and Austin, 2000 ). Suppression results from an increase in negative supercoiling because partial inactivation of gyrase in mukB topA double mutants restores the mukB φαινότυπους. Thus, it would seem that probing gyrase and Topo IV function by inactivating gyrase comes at the price of perturbing normal chromosome dynamics. One must therefore consider the possibility that specific regulation of Topo IV localization is lost under these conditions. Furthermore, the presumed massive entanglement of the sister chromosomes that ensues subsequent to inactivation of gyrase may also account for why the presumed Topo IV-supported replication fork progression petered out in the microarray experiments of Khodursky et al. (2000 ). Grompone et al. (2003 ) did not inactivate gyrase completely thus, it is possible that, under their conditions, there was sufficient global negative supercoiling to maintain proper chromosome dynamics.

Understanding bacterial chromosome dynamics is a newly burgeoning endeavour. Recent observations raise the possibility that the chromosome may be acted upon by forces that induce physical stress on the DNA. SetB is an integral membrane protein that we identified in a screen for high-copy suppressors of the temperature-sensitive and partition phenotypes of the parC1215 allele ( Espeli et al., 2003c ). Inactivation of this protein provokes a delay in chromosome segregation, whereas its overproduction induces nucleoid stretching and disintegration. SetB localizes in the cell with a helical pattern and interacts by two-hybrid analysis with MreB. ParM, an MreB homologue encoded by the R1 plasmid, was recently shown to drive plasmid partition by filament polymerization that pushed the sisters apart ( Moller-Jensen et al., 2002). Furthermore, expression in otherwise wild-type cells of mutant forms of MreB that are unable to polymerize induces defective nucleoid separation and cell division ( Kruse et al., 2003). We therefore favour the hypothesis that SetB participates in the application of a force to the chromosome that helps to drive chromosome segregation. Topological domains that are under stress will assume conformations directed at relieving that stress. Thus, if such a system operates, one must consider that the form and distribution of topology in the replicating chromosome could be distinct from what we now imagine. Along these lines, rescue of the parC temperature-sensitive strain by overexpression of SetB is hypersensitive to the quinolone norfloxacin (unpublished data), suggesting that the requirement for gyrase had become particularly acute. One possible interpretation of this observation is that the excess tension applied to the chromosome when SetB is overexpressed induces a conformation that allows gyrase to serve as the cellular decatenase.

A description of how replication topology is handled in the cell that could fit all the data and the interpretations discussed here is that gyrase operates to remove the (+)sc formed during replication, that any precatenanes formed do not interfere with replication and are removed only at the end of the cell cycle, probably when they have been converted to catenanes, and that Topo IV acts primarily on catenanes (Fig. 1). The primary principle governing how the excess positive windings generated by replication are distributed would seem to be linked to the nature of chromosomal domains. If future single-molecule studies support the contention that gyrase operates at about two to four strand passage events s −1 , then any topological domain that contains an advancing replication fork requires the simultaneous action of 13–25 gyrase molecules. Let us take 20 as an average value. Because gyrase wraps 150 bp of DNA about itself ( Liu and Wang, 1978 ), these molecules will occupy 3 kbp of unreplicated DNA.

Possible distribution of DNA topology, DNA gyrase and Topo IV in the cell. The cartoon depicts a bacterial cell that is nearing completion of cytokinesis. The cell is being divided by the invaginating septal ring. Catenanes between the two sister chromosomes that are undergoing partition are being removed by Topo IV that is anchored at the septal ring by virtue of its interaction with the C-terminal, AAA domain of FtsK. The DNA translocation activity of this domain of FtsK may participate directly in the decatenation reaction. Replication has initiated on the sister chromosomes undergoing partition. The second-generation sister chromosomes are organized into negatively supercoiled topological domains that are possibly anchored by DNA gyrase. The topological domain that is ahead of the replication fork (i.e. between the replication factory and the domain barrier in the cartoon) is positively supercoiled. Gyrase is concentrated in this domain in order to provide sufficient unlinking activity. The drawing is not to scale. Duplex DNA is represented by a single line. Newly replicated regions of the chromosomes are in red. The invaginating septum is represented by the grey rectangles.

What happens when the advancing fork squeezes the gyrase consortium up against the domain barrier? In part, the result depends on both the behaviour of the bound gyrase and the nature of the domain barrier itself. One possibility is that, as the gyrase molecules presumably dissociate to allow passage of the fork, all the duplex windings of the non-replicated region are converted to precatenanes, 300 of them. Such a situation would seem to be untenable. This conversion would require 300 rotations of the replication fork per domain, something that is probably unlikely. In addition, if chromosomal domains are of the order of 50 kbp, the arithmetic argues that there would be in the range of 25 000 precatenanes converted to catenanes at the end of replication. Interestingly, given the rates measured for Topo IV unlinking of braided DNA, 40 or so Topo IV molecules could remove all those linkages in about 10 min, a period that roughly corresponds to the D period of the Ε. coli cell cycle ( Cooper and Helmstetter, 1968 ). On the other hand, the extent of linkage between the sister chromosomes implied by this density of precatenanes would seem to be a force for sister chromosome cohesion that would act against extrusion of the sisters into opposite halves of the cell as posited in models of replication-driven chromosome partition ( Lemon and Grossman, 2001 ).

A more likely possibility is that domain barriers are not fixed and can slip forward as the fork moves forward. Perhaps the pressure of the gyrase consortium encountering the domain barrier acts as some type of trigger in this process or perhaps the domain barrier is the gyrase consortium itself. Under these circumstances, gyrase molecules that dissociate to allow passage of the fork could rebind further downstream. In this manner, there would be little slop of positive supercoils over to precatenanes. Clearly, many questions about the management of DNA topology in the cell remain to be answered.


No Time to Relax

To get a sense for supercoiled DNA, imagine twisting a piece of string. Let the string go, and it unwinds. Twist it enough, and it folds back on itself. The degree of twist puts stress on the string, which governs the shape it takes.

DNA behaves in a similar fashion. Like the string, it prefers to be in its most relaxed state — the iconic double helix. But DNA rarely gets to relax. It’s subject to a continual onslaught of molecules that bind it — the enzymes that untangle, unwind and then replicate DNA the molecules that mark which genes are active and which are silent and the proteins that pack the lengthy molecule into a manageable size. All of these molecules contort DNA into new shapes, blocking it from the repose of the simple double helix.

Irobalieva RN et al., Nat. Comm. 2015

Video: This simulation illustrates the dynamic dance of tiny circles of supercoiled DNA.

These interactions represent the inner workings of the cell, the basis of all life. How the cell decides to activate a certain gene, for example, involves a complex assembly of molecules in the right place at the right time. Protein-DNA interactions also present prime targets for drugs as well as insights into disease. Imagine a drug that could block activation of a cancer-linked gene without interfering with other genes.

Unfortunately, these interactions are very difficult to study because biological molecules morph shapes so easily. A mechanic would have a hard time fixing a car if the parts constantly mutated.

To capture the complex structure of these nanoscale interactions, scientists typically crystalize the molecules, freezing their shape for the camera. The vast majority of these studies use short strands of relaxed DNA — the standard double-helix form — because they’re easy to work with and cheap to make. But that may not capture the true picture relaxed DNA often behaves differently than that found in the cell, contorted around all manner of proteins.

Zechiedrich and her collaborators have spent the last two decades making small pieces of supercoiled DNA, whose behavior better mimics DNA in the living cell. Essentially, they take a short strand of DNA and twist it — once, twice, three times or more — either with or against the coil. Then they glue the ends together. The end result is a tiny circle of DNA coiled in one direction or another. Zechiedrich, her collaborator and Baylor colleague Jonathan Fogg and others have shown that these twisted coils dance, shimmying through a microscopic ballet. Each molecule can assume a variety of shapes, from simple circles to figure eights, racquets, handcuffs, needles and rods. “Linear DNA is stiff and inflexible,” said De Witt Sumners, a mathematician at Florida State University in Tallahassee. “But when you get it bent into a small circle, the duplex opens up and adopts a large number of interesting shapes — this is completely unexpected.”

The newest study from Zechiedrich’s lab provides the clearest picture yet of these tiny rings. The researchers captured microscopic images of individual circlets in a variety of diverse shapes. Pairing the images with sophisticated computational models created by collaborator Sarah Harris, a biologist at the University of Leeds, they were able to predict the precise movements of each molecule.

Though scientists already knew bits and pieces of how supercoiled DNA functions, the combination of microscopy and modeling in the new paper helps to create a more precise picture. “For a large part of the biological community, seeing is believing,” said Stephen Levene, a biophysicist and bioengineer at the University of Texas, Dallas, who was not involved in the study. “You can show math models, but unless you have some convincing structural data, it’s hard to get people to appreciate what’s going on.”


The dynamic interplay between DNA topoisomerases and DNA topology

Topological properties of DNA influence its structure and biochemical interactions. Within the cell, DNA topology is constantly in flux. Transcription and other essential processes, including DNA replication and repair, not only alter the topology of the genome but also introduce additional complications associated with DNA knotting and catenation. These topological perturbations are counteracted by the action of topoisomerases, a specialized class of highly conserved and essential enzymes that actively regulate the topological state of the genome. This dynamic interplay among DNA topology, DNA processing enzymes, and DNA topoisomerases is a pervasive factor that influences DNA metabolism in vivo. Building on the extensive structural and biochemical characterization over the past four decades that has established the fundamental mechanistic basis of topoisomerase activity, scientists have begun to explore the unique roles played by DNA topology in modulating and influencing the activity of topoisomerases. In this review we survey established and emerging DNA topology-dependent protein–DNA interactions with a focus on in vitro measurements of the dynamic interplay between DNA topology and topoisomerase activity.

Αυτή είναι μια προεπισκόπηση του περιεχομένου συνδρομής, πρόσβαση μέσω του ιδρύματός σας.


Δες το βίντεο: Topologia Topologia forte: definição (Φεβρουάριος 2023).