Πληροφορίες

Βρείτε μια εύκολη και φθηνή μέθοδο για τη βαφή dNTP

Βρείτε μια εύκολη και φθηνή μέθοδο για τη βαφή dNTP


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Θέλω να μετρήσω την OD για να γνωρίζω τη συγκέντρωση του dNTP. Καμιά ιδέα για βαφή dNTP στη φθηνότερη τιμή και τον ευκολότερο τρόπο;


Μπορεί να υπάρχει μια τέτοια βαφή, αλλά δεν το γνωρίζω. Ο τυπικός τρόπος μέτρησης των dNTPs και των νουκλεϊκών οξέων γενικά είναι η απορρόφηση στα 260 nm. Αυτό το άρθρο έχει έναν πίνακα μοριακών συντελεστών απόσβεσης για dNTP (Πίνακας 10.2). Αυτοί είναι

μήκος κύματος μοριακός συντελεστής εξάλειψης dATP 259 nm 15.200 dCTP 280 nm 13.100 dGTP 253 nm 13.700 dTTP 267 nm 9.600

Στην πράξη για εργασίες ρουτίνας με DNA μπορείτε να χρησιμοποιήσετε 260 nm και να υποθέσετε ότι μια απορρόφηση 1 αντιστοιχεί σε [DNA] = 50 μg ml-1. Χρησιμοποιώντας έναν μέσο όρο των τιμών στον Πίνακα και αγνοώντας το γεγονός ότι αυτά είναι στην πραγματικότητα σε διαφορετικά μήκη κύματος, και χρησιμοποιώντας ένα κατά προσέγγιση μέσο dNTP MW 500, υπολογίζω μια απορρόφηση για 50 μg ml-1 λύση και των 4 dNTP ως 1.3, οπότε αυτή είναι μια λογική συμφωνία δεδομένων όλων των υποθέσεων που έχω κάνει.

Υπάρχουν φθορίζουσες βαφές που μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τη μέτρηση του DNA, αλλά αυτές βασίζονται στην παρουσία στοιβαγμένων βάσεων, επομένως δεν είναι χρήσιμες για τα ελεύθερα dNTP.

Λοιπόν, άσχημα νέα αν δεν έχετε φασματοφωτόμετρο UV. Υπάρχουν διαθέσιμα σχέδια για την κατασκευή απλών φασματοφωτομέτρων με χρήση Lego και μερικών οπτοηλεκτρονικών εξαρτημάτων. Αυτά τείνουν να χρησιμοποιούν LED ως πηγή φωτός, αλλά δεν ξέρω αν υπάρχουν διαθέσιμα UV LED.


Θα είναι δύσκολο να επιτευχθεί το επίπεδο ανάλυσης μήκους κύματος που απαιτείται για τη διαφοροποίηση των dNTP, δεδομένου ότι κάνετε ένα πείραμα DIY. Μόνο πολύ ακριβή φασματοφωτόμετρα μπορούν να το επιτύχουν και είναι ακριβά.

Μια άλλη τεχνική που μπορείτε να δοκιμάσετε είναι η χρωματογραφία λεπτής στιβάδας (TLC). Είναι φθηνό και μπορείτε εύκολα να κάνετε ένα DIY. Χρειάζεστε όμως πρότυπα για να διαφοροποιήσετε τα NTP, NDP και NMP. Τα δύο τελευταία μπορεί να προκύψουν λόγω υποβάθμισης κατά τη διάρκεια του πειράματος. Οι άνθρωποι γενικά χρησιμοποιούν ένα κοκτέιλ αντιοξειδωτικών και προστατευτικών για να ελαχιστοποιήσουν την αποικοδόμηση των νουκλεοτιδίων.

Μια στρατηγική για να γίνει αυτό είναι να αφαιρέσετε το φωσφορικό άλας χρησιμοποιώντας φωσφατάση και στη συνέχεια να κάνετε TLC με νουκλεοσίδια (που είναι αρκετά σταθερά).

Μπορείτε να ελέγξετε αυτήν την ανασκόπηση για TLC νουκλεϊκού οξέος.


Πρακτική Εισαγωγή στην Ηλεκτροφόρηση για τη Βιολογία

Το εργαστήριο όπου εργάζομαι ενδιαφέρεται για τη μηχανική των βασικών βιολογικών διεργασιών, χρησιμοποιώντας τη μαγιά ως πρότυπο οργανισμό.

Ένας καλός φίλος, φυσικός και στέλεχος μάρκετινγκ τεχνολογίας από εκπαίδευση και επάγγελμα, ελπίζω να έρθει μαζί μου στο εργαστήριο. Αυτές είναι οι άτυπες σημειώσεις μου προς αυτόν για να τον ενημερώσω με πρακτικό τρόπο για το εργαστήριό μας, εστιάζοντας αρχικά στις κλασικές μεθόδους των χρυσαυγιτών. Ελπίζω ότι αυτός και άλλοι που ενδιαφέρονται να κάνουν μια τέτοια μετάβαση σταδιοδρομίας σε βιοεργαστήριο θα βρουν επίσης χρήσιμη αυτή την πρακτική εισαγωγή.


Αφηρημένη

Σε αυτή την εργασία εφαρμόσαμε μια τεχνική φλας φωτόλυσης στη μελέτη της κινητικής συμπεριφοράς ενός συνθετικού άλατος φλαβυλίου σε υδατικό διάλυμα. Οι κινητικές διεργασίες που ενεργοποιούνται από τον παλμό φωτός ενός κοινού φλας κάμερας, ακολουθούνται από ένα ελαφρώς τροποποιημένο, ελεγχόμενο από υπολογιστή, φασματοφωτόμετρο. Το φως προκαλεί αναστρέψιμες αλλαγές απορρόφησης και αποδεικνύονται δύο διαφορετικά παροδικά είδη πριν από την πλήρη ανάκτηση του συστήματος. Αναφέρεται η κινητική συμπεριφορά και τα φάσματα των παροδικών ειδών. Το προτεινόμενο πείραμα είναι φθηνό και εύκολο και επιτρέπει στους μαθητές όλων των επιπέδων να εξοικειωθούν με τις έννοιες της παροδικής κινητικής διάσπασης και των φασμάτων που επιλύονται στο χρόνο.


Επανεξέταση της διαδικασίας βαφής με τη συνθετική βιολογία

Το 20% της ρύπανσης των υδάτων της γης προκαλείται από την επεξεργασία κλωστοϋφαντουργικών προϊόντων και απαιτούνται 1.800 γαλόνια νερού για να κατασκευαστεί ένα μόνο ζευγάρι μπλε τζιν. Αυτή είναι μια εκπληκτική ποσότητα γλυκού νερού που απαιτείται για την κατασκευή ενός ενιαίου ρούχου –, αλλά η βιομηχανία πρόκειται να αλλάξει.

Η Colorifix με έδρα το Ηνωμένο Βασίλειο θέλει να μειώσει τη σπατάλη νερού σε όλη τη διαδικασία της βαφής αξιοποιώντας τις βιολογικές δυνατότητες των μικροβίων.

«Στο πλαίσιο ενός έργου βιοαισθητήρα αρσενικού υπό την ηγεσία του Πανεπιστημίου του Κέιμπριτζ, η ομάδα μας πήγε στη Νότια Ασία με τον πρωτότυπο βιοαισθητήρα μας, εξήγησε στους ανθρώπους πώς λειτουργούσε και στη συνέχεια ζήτησε από τους ανθρώπους μια λίστα με χημικές ουσίες που πίστευαν ότι άξιζαν παρακολούθησης», λέει. Ο Δρ Orr Yarkoni, συνιδρυτής και Διευθύνων Σύμβουλος της Colorifix.

«Όταν επιστρέψαμε [στο Ηνωμένο Βασίλειο] και κάναμε τα μαθήματά μας, ανακαλύψαμε ότι τα περισσότερα από αυτά που αφορούσαν χημικά προέρχονταν από την κλωστοϋφαντουργία και η βαφή ήταν ο κύριος ένοχος τόσο για τη χρήση νερού όσο και για τη χρήση χημικών», λέει ο Yarkoni, ο οποίος στη συνέχεια αποφάσισε να χρησιμοποιήσει συνθετική βιολογία για την παραγωγή των χρωστικών και τη μείωση των ρύπων, αντί να τις παρακολουθεί απλώς.

Μετά από μερικά χρόνια έρευνας με τον Δρ Τζέιμς Ατζιόκα και τον Δρ. Ντέιβιντ Νούτζεντ, το Colorifix κυκλοφόρησε το 2016. Η επιστημονική πρόοδος ήταν ταχεία και η ομάδα εξέτασε γρήγορα τρόπους μείωσης της περιβαλλοντικής ζημίας που προκαλεί η κλωστοϋφαντουργία, πέρα ​​από παραγωγή βαφών.

Οι Δρ. Nugent (αριστερά) και Ajioka (δεξιά) στο εργαστήριο Colorifix στο Norwich της Αγγλίας. Η εικόνα είναι ευγενική προσφορά του Colorifix.

«Κανονικά, [η εναπόθεση μιας βαφής στο ύφασμα] γίνεται με χημικές ουσίες ή βιολογικά παραγόμενες ενώσεις, αλλά χωρίς βιολογικό παράγοντα. Χρησιμοποιούμε τα ίδια τα κύτταρα για να παράγουμε και να εναποθέτουμε τη χρωστική ουσία στην ίνα, επομένως χρησιμοποιούμε τη βιολογία για όλη τη διαδικασία. Κάνοντας αυτό είναι που μας επιτρέπει να εξοικονομήσουμε νερό και ενέργεια και να αφαιρέσουμε χημικά. Χρησιμοποιούμε τη βιολογία για να μεταφέρουμε αυτές τις χρωστικές και τις βαφές στην ίνα», εξηγεί ο Yarkoni.

Μέχρι στιγμής, η Colorifix έχει αναπτύξει μια σουίτα χρωμάτων, καθένα από τα οποία προέρχεται από φυσικές χρωστικές.

«Οι περισσότερες χρωστικές μας σήμερα προέρχονται από έντομα, κάποιες μικροβιολογικές, πτηνά κ.λπ. Λοιπόν, ναι, αυτή τη στιγμή ψάχνουμε παντού για χρωστικές ουσίες. Έχουμε κάνει και μερικές χρωστικές από υποβρύχιους οργανισμούς», λέει ο Yarkoni, ο οποίος σπεύδει να επισημάνει ότι το πραγματικό όφελος του Colorifix είναι η μοναδική του διαδικασία βαφής, περισσότερο από την παραγωγή χρωστικών με βιολογική βάση.

Σε προηγούμενη συνέντευξη στη Vogue Australia, ο Yarkoni τόνισε ότι η διαδικασία βαφής χρησιμοποιεί 10 φορές λιγότερο νερό και καταναλώνει 20 τοις εκατό λιγότερη ενέργεια, κυρίως επειδή η εταιρεία χρησιμοποιεί μελάσα, ένα υποπροϊόν ζάχαρης, για να τροφοδοτήσει τα μικρόβια που παράγουν χρωστική ουσία και αντικαθιστά τη στερέωση. χημικά με την ίδια τη βιολογία. Η κανονική διαδικασία βαφής υφασμάτων συμβαίνει συχνά σε πολύ υψηλές θερμοκρασίες - πολύ πάνω από 100 βαθμούς Κελσίου - οι οποίες καταναλώνουν μεγάλη ποσότητα ενέργειας. Τα μικρόβια του Colorifix μπορούν να βαφτούν στους 37 βαθμούς και στη συνέχεια να αδρανοποιηθούν με θερμότητα σε θερμοκρασία κάτω των 100 βαθμών, γεγονός που εξοικονομεί ενέργεια. Όμως η εταιρεία δεν σκοπεύει να σταματήσει εκεί.

Ένα δείγμα έγχρωμων υφασμάτων από τη βιολογική διαδικασία βαφής της Colorifix. Η εικόνα είναι ευγενική προσφορά του Colorifix.

«Σε ό,τι αφορά το νερό, είμαστε ενθουσιασμένοι που μπορούμε να πούμε ότι έχουμε πλέον πιλοτάρει με επιτυχία τόσο τη ζύμωση όσο και τη βαφή χρησιμοποιώντας αποκλειστικά αλμυρό νερό, επομένως δεν χρειάζεται πλέον να αγγίζουμε γλυκό νερό στη διαδικασία», ανακοίνωσε ο Yarkoni.

Αυτό είναι ένα τεράστιο άλμα για την κλωστοϋφαντουργία και θα μπορούσε να εξοικονομήσει χιλιάδες γαλόνια γλυκού νερού σε όλη τη διαδικασία βαφής. Το καλύτερο είναι ότι, παρά την εξοικονόμηση ενέργειας και νερού, η διαδικασία για τη βαφή ενός υφάσματος παραμένει σε μεγάλο βαθμό αμετάβλητη.

«Το υγρό βαφής μας πηγαίνει ουσιαστικά στην υπάρχουσα μηχανή βαφής – είναι όλα συμβατά και το μόνο που χρειάζεται να κάνουν είναι να αλλάξουν το υγρό βαφής που μπαίνει στη μηχανή τους», λέει ο Yarkoni, αναφερόμενος στο υδατικό διάλυμα χημικών ουσιών που χρησιμοποιούνται για τη χρώση ενός ένδυμα. «Η μόνη διαφορά είναι ότι [η εγκατάσταση βαφής] μπορεί να απαλλαγεί από όλα τα άλλα χημικά τους, αφού ο οργανισμός σταθεροποιεί τη βαφή και λερώνει το ύφασμα χωρίς αυτές τις χημικές ουσίες».

Από τζιν μέχρι βαφές και οτιδήποτε ενδιάμεσα, οι εταιρείες συνθετικής βιολογίας ανταποκρίνονται στις εκκλήσεις μιας σπάταλης βιομηχανίας. Εταιρείες όπως η Tinctorium, η PILI και η Colorifix βρίσκουν εναλλακτικούς τρόπους για να παράγουν τα ίδια ζωντανά χρώματα που απευθύνονται στους καταναλωτές χωρίς την πρόσθετη τοξικότητα, χημικά και ρύπανση.

Εισερχόμαστε σε μια κομβική στιγμή στη βιομηχανία της μόδας, όπου οι βιολογικές, βιώσιμες εναλλακτικές θα είναι η νέα μόδα.

Νίκο ΜακΚάρτι

Ο Νίκο είναι διδάκτωρ Βιομηχανικής στο Ινστιτούτο Τεχνολογίας της Καλιφόρνια. Προηγουμένως ολοκλήρωσε το μεταπτυχιακό του στα Συστήματα και τη Συνθετική Βιολογία στο Imperial College του Λονδίνου ως υπότροφος Fulbright.


ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ

Επισκόπηση και βελτιστοποίηση του συστήματος DocMF

Το νέο σύστημα DocMF μετρά τις αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-DNA εξετάζοντας την αλλαγή σήματος φθορισμού μέσω διαδοχικής απεικόνισης στο τσιπ πριν και μετά την αλληλεπίδραση πρωτεΐνης με DNB που περιέχουν στόχους DNA (Εικ. 1 και ταινία S1). Τα DNB αποτελούνται από προσαρμογείς αλληλουχίας και ένθετα τυχαίων αλληλουχιών για να καλύπτουν όλο το φάσμα των θέσεων δέσμευσης πρωτεΐνης. Εκατοντάδες εκατομμύρια DNB φορτώνονται πρώτα στα τσιπ BGISEQ500 σε μια διάταξη με μοτίβο και οι περιοχές εισαγωγής αλληλουχούνται σε ένα σταθερό μήκος χρησιμοποιώντας τη ροή εργασίας DNBSeq (16). Αφού λάβουμε τις μοναδικές πληροφορίες αλληλουχίας για κάθε DNB, αναμορφώνουμε τα μονόκλωνα DNB (ssDNB) αφαιρώντας τον κλώνο που έχει επισημανθεί με χρωστική ουσία που συντίθεται στην αλληλουχία. Στη συνέχεια, ένας φυσικός συμπληρωματικός κλώνος συντίθεται εκ νέου για να σχηματίσει dsDNA και στο άκρο επισημαίνεται με φθορίζουσες βαφές. Για τις πρωτεΐνες που διασπούν το DNA, λαμβάνεται μια πρώτη εικόνα για την καταγραφή της θέσης και της έντασης του σήματος μεμονωμένων DNB, δηλ. αναγνώσεων. Η πρωτεΐνη ενδιαφέροντος δεσμεύεται στους στόχους dsDNA της και διασπά τα αντίστοιχα DNB, οδηγώντας σε μείωση του σήματος ή εξάλειψη αυτών των DNB κατά τη διάρκεια ενός δεύτερου γύρου απεικόνισης (Εικ. 1Α). Μπορούν να αναγνωριστούν συγκεκριμένα μοτίβα από τις αλληλουχίες επιλεγμένων DNB με εξάλειψη ή μείωση σήματος μεγαλύτερη από ένα όριο (Εικ. 1Β) και να επαληθευτούν σε επακόλουθες μοριακούς προσδιορισμούς. Μια ελαφρώς τροποποιημένη ροή εργασίας DocMF χρησιμοποιείται για τον χαρακτηρισμό των προτιμήσεων σύνδεσης πρωτεΐνης-DNA. Σε αυτό το πρωτόκολλο, τα DNB απεικονίζονται για πρώτη φορά μετά την επώαση του επισημασμένου στο τέλος του dsDNA με πρωτεΐνες που δεσμεύουν το DNA για την αρχική ένταση του σήματος. Στο επόμενο βήμα, εκτελείται μια πρόσθετη αντίδραση πολυμεράσης που ονομάζεται MDA για να αντικαταστήσει τον επισημασμένο κλώνο. Το MDA οδηγεί σε απώλεια σήματος κατά τη διάρκεια του δεύτερου σταδίου απεικόνισης, όπως φαίνεται στην εικ. S1. Ωστόσο, εάν μια πρωτεΐνη ενδιαφέροντος συνδεθεί με τους στόχους DNA της και αναστέλλει το MDA, το σήμα από τις θέσεις δέσμευσης πρωτεϊνών που περιέχουν DNB θα παραμείνει αμετάβλητο ή θα επηρεαστεί λιγότερο από αυτό της λωρίδας ελέγχου, η οποία δεν περιλαμβάνει την επώαση πρωτεΐνης αλλά διατηρεί τα άλλα βήματα .

Για να διασφαλιστεί ότι η διαδοχική απεικόνιση είναι εφικτή, είναι σημαντικό το βήμα απογύμνωσης να μην επηρεάζει τις χωρικές πληροφορίες ή να βλάπτει τη δομή του DNB. Τα τσιπ BGISEQ500 που χρησιμοποιούνται σε αυτό το πείραμα είναι πίνακες με σχέδια. Επομένως, η διαδοχική απεικόνιση δεν επηρεάζει την καταχώριση θέσεων DNB στον ίδιο βαθμό που επηρεάζεται η μέθοδος CHAMP που χρησιμοποιεί τσιπ Miseq (11). Επιπλέον, δοκιμάσαμε μια ποικιλία από ρυθμιστικά διαλύματα απογύμνωσης και διαπιστώσαμε ότι το ρυθμιστικό διάλυμα φορμαμίδης είχε τη μικρότερη επίδραση στην ακεραιότητα του DNB, σπάζοντας μόνο τους δεσμούς υδρογόνου μεταξύ του dsDNA χωρίς να επηρεάσει τη σταθερότητα του DNB ή να αποσπάσει τα DNB από την επιφάνεια. Το Σχήμα S2 δείχνει ότι οι βαθμολογίες ποιότητας αλληλουχίας, συμπεριλαμβανομένων των Q30 (92,83 έναντι 90,32), Lag (0,15 έναντι 0,15) και RunOn (0,15 έναντι 0,12), παρέμειναν ανεπηρέαστες μετά την απογύμνωση με ρυθμιστικό διάλυμα φορμαμίδης. Σε σύγκριση, το ρυθμιστικό διάλυμα απογύμνωσης με NaOH μείωσε σημαντικά το Q30 από περισσότερο από 90% σε σχεδόν 0.

Μετά τη λήψη δύο εικόνων πριν και μετά την αλληλεπίδραση πρωτεΐνης-DNA, συγκρίναμε απευθείας την αλλαγή πτυχής της ακατέργαστης έντασης σήματος κάθε DNB. Εάν η πρωτεΐνη διασπάσει το DNA, τα DNB που έχουν σημαντική μείωση σήματος μπορούν να ανακτηθούν (Εικ. 1Β) και οι αντίστοιχες αλληλουχίες αναλύονται για ταυτοποίηση μοτίβου (Υλικά και Μέθοδοι). Για να μετρήσουμε τις αλληλεπιδράσεις σύνδεσης πρωτεΐνης-DNA, λάβαμε τις πληροφορίες αλληλουχίας δέσμευσης από αυτά τα DNB με ελάχιστη αλλαγή πτυχής σήματος σε σύγκριση με τον έλεγχο.

Το DocMF μπορεί να χαρακτηρίσει ένα ευρύ φάσμα θέσεων περιορισμού ενδονουκλεασών (RSs)

Μετά την καθιέρωση του συστήματος, δοκιμάσαμε έξι περιοριστικές ενδονουκλεάσες (Eco RI, Bpu 10I, Age I, Nme AIII, Mlu I και Bgl I) με διαφορετικά χαρακτηριστικά RS. Τα περιοριστικά ένζυμα τύπου II διασπούν το DNA δίπλα ή εντός των θέσεων αναγνώρισής τους (21), τα οποία έχουν μελετηθεί εκτενώς. Τα επιλεγμένα ένζυμα περιέχουν θέσεις περιορισμού (RSs) που κυμαίνονται από 6 έως 11 bp και περιλαμβάνουν φυσιολογικές παλινδρομικές αλληλουχίες, μη παλινδρομικές αλληλουχίες και εκφυλισμένες βάσεις. Η βιβλιοθήκη DNB περιέχει μια δεξαμενή συνθετικών τυχαίων θραυσμάτων DNA με μήκος 50 nt. Σαράντα από τα 50 νουκλεοτίδια αυτών των τυχαίων αλληλουχιών διαβάστηκαν με χρήση του BGISEQ-500RS High-throughput Sequencing Set (SE100). Ελήφθησαν εικόνες πριν και μετά την επώαση αυτών των ενζύμων στο τσιπ για 2 ώρες ή όλη τη νύχτα. Τα DNB με κατώφλι FFI > 2 (θετικές αναγνώσεις) ταυτοποιήθηκαν για τη διαλογή για μοτίβα (βλ. Υλικά και Μέθοδοι).

Το ακριβές μήκος των θέσεων περιορισμού (RS) (μεγάλο) ελήφθη μέσω μιας μεθόδου «συναρμολόγησης σπόρων» (Υλικά και Μέθοδοι). Στη συνέχεια υπολογίσαμε τα ποσοστά τοποθεσίας όλων μεγάλο-μερές μεταξύ θετικών αναγνώσεων (Υλικά και Μέθοδοι). Χρησιμοποιώντας αυτή τη μέθοδο, για καθεμία από αυτές τις έξι περιοριστικές ενδονουκλεάσες, λάβαμε τα ποσοστά θέσης όλων των μεγάλο-mers (μεγάλο είναι το προβλεπόμενο μήκος ενός RS) και σχεδίασε ένα πλαίσιο για το μεγάλο-μερών με τα κορυφαία 50 μεγαλύτερα ποσοστά τοποθεσίας (Εικ. 2Α). Τα μοτίβα (πορτοκαλί στο Σχήμα 2Α) που αντιστοιχούν στα ακραία σημεία στο πλαίσιο, με το άθροισμα της συχνότητας τοποθεσίας αυτών των ακραίων σημείων (με πράσινο χρώμα στην Εικ. 2Α) >80%, θεωρήθηκαν ως οι προβλεπόμενες από το DocMF θέσεις περιορισμού (RSs) . Έτσι, για τα Eco RI, Bpu 10I, Age I, Nme AIII και Mlu I, λάβαμε τις θέσεις περιορισμού τους (RS) από τις ακραίες τιμές που φαίνονται στο Σχήμα 2Α, επειδή τα αθροίσματα ποσοστού τοποθεσίας αυτών των ακραίων τιμών ήταν όλα μεγαλύτερα από 80% . Για το Bgl I, ωστόσο, το άθροισμα του ποσοστού τοποθεσίας των ακραίων τιμών ήταν μόνο 7,65%, το οποίο είναι πολύ μικρό για να προβλεφθεί ως τοποθεσίες περιορισμού (RSs) χρησιμοποιώντας DocMF. Έτσι, για το Bgl I, χρησιμοποιήσαμε τα 11-mers (επειδή το 11 είναι το προβλεπόμενο μήκος του RS) με τα κορυφαία 372 μεγαλύτερα ποσοστά τοποθεσίας για να προβλέψουμε τις θέσεις περιορισμού (RSs) το άθροισμα του ποσοστού τοποθεσίας αυτών των 372 μοτίβων ήταν μεγαλύτερο από 80 % (Εικ. 2Β). Μια ακολουθία (19) η αναπαράσταση (Εικ. 2C) αυτών των 372 αλληλουχιών αποκάλυψε ότι το RS για το Bgl I ήταν GCCNNNNNGGC, το οποίο συμφωνούσε με το αναφερόμενο RS. Αυτά τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το σύστημά μας σε συνδυασμό με μια βελτιστοποιημένη μέθοδο βιοπληροφορικής θα μπορούσε να προσδιορίσει αξιόπιστα τη θέση αναγνώρισης DNA για διαφορετικούς τύπους περιοριστικών ενζύμων.

(ΕΝΑ) Οικόπεδα κουτιών για τα μοτίβα με το κορυφαίο 50 κορμό10(τιμές τοποθεσίας). Εμφανίζονται οι αλληλουχίες DNA των ακραίων στοιχείων (πορτοκαλί) και το άθροισμα των ρυθμών θέσης των ακραίων στοιχείων (πράσινο). (σι) Σωρευτικές τιμές ιστότοπου για Bgl I. (ντο) Μια αναπαράσταση με λογότυπο ακολουθίας των 372 μοτίβων για το Bgl I.

Το DocMF μπορεί να αναγνωρίσει με ακρίβεια το 5'-NGG-3' PAM του SpCas9

Οι τελεστές CRISPR-Cas είναι ενδονουκλεάσες καθοδηγούμενες από RNA που χρησιμοποιούν ένα PAM ως σήμα δέσμευσης DNA. Το PAM είναι μια σύντομη αλληλουχία DNA, συνήθως μικρότερη από 7 bp, που βρίσκεται κοντά στο DNA στόχο (που ονομάζεται protospacer) του συστήματος CRISPR-Cas (22, 23). Μια ευρέως χρησιμοποιούμενη προσέγγιση αναγνώρισης ΡΑΜ μετασχηματίζει πλασμίδια που φέρουν τυχαιοποιημένες αλληλουχίες ΡΑΜ σε Ε. coli παρουσία ή απουσία του τόπου CRISPR-Cas. Η συχνότητα μιας λειτουργικής ακολουθίας PAM είναι σημαντικά χαμηλότερη όταν υπάρχει η πρωτεΐνη Cas (24Έτσι, αυτή η ανάλυση εξάντλησης PAM (24) απαιτεί δύο σετ βιβλιοθηκών για αναγνώριση PAM 5' ή 3' και αντίστοιχους αρνητικούς ελέγχους. Το μέγεθος της βιβλιοθήκης πρέπει επίσης να είναι μεγάλο για να καλύπτει τις περισσότερες, αν όχι όλες, ακολουθίες PAM. Επιπρόσθετα, η δοκιμασία εξάντλησης πλασμιδίου (24) είναι χρονοβόρα και χαμηλή απόδοση. Αντίθετα, το σύστημα DocMF μπορεί ταυτόχρονα να ελέγξει αλληλουχίες 5′ και 3′ για PAM σε ένα μόνο πείραμα, δημιουργώντας κάλυψη πολλαπλών τάξεων μεγέθους μεγαλύτερη από την παραδοσιακή μέθοδο. Μία από τις δύο περιοχές ΡΑΜ που δεν αναγνωρίζεται από την πρωτεΐνη χρησιμοποιείται ως εσωτερικός αρνητικός έλεγχος.

Σε μια μελέτη proof-of-concept, αξιολογήσαμε την ακρίβεια του DocMF αξιολογώντας τις απαιτήσεις PAM του SpCas9, του πιο ευρέως χρησιμοποιούμενου συστήματος CRISPR-Cas, από S. pyogenes. Το SpCas9 διασπά το dsDNA μετά τη δέσμευση στο αντίστοιχο RNA, και αυτή η διάσπαση αναφέρεται από προσδιορισμούς εξάντλησης PAM ότι εξαρτάται από μια 5'-NGG-3' αλληλουχία PAM (25). Η βιβλιοθήκη PAM DNB που χρησιμοποιείται στο DocMF φαίνεται στο Σχ. 3Α. Η συνθετική ολίγο περιοχή περιείχε μια γνωστή αλληλουχία πρωτοδιαχωριστή 23-nt SpCas9 (χρωματισμένη πορτοκαλί στο Σχ. 3Α) πλαισιωμένη από περιοχές 5' και 3' ΡΑΜ με 15 τυχαία νουκλεοτίδια το καθένα (χρωματισμένο πράσινο στο Σχήμα 3Α). Οι πληροφορίες αλληλουχίας και των δύο περιοχών ΡΑΜ ελήφθησαν με αλληλούχιση μονού άκρου 50 nt.

(ΕΝΑ) Εικονογράφηση προετοιμασίας βιβλιοθήκης PAM DNB. Η συνθετική περιοχή ολίγο περιέχει μια γνωστή αλληλουχία πρωτοδιαχωριστή 25-nt SpCas9 (πορτοκαλί) πλαισιωμένη από περιοχές 5' και 3' ΡΑΜ με 15 τυχαία νουκλεοτίδια η καθεμία (πράσινη). Εκατοντάδες αντίγραφα κάθε τυχαίου πρωτοδιαχωριστή με πλευρές PAM ενσωματώνονται ανά DNB και επιδεικνύεται μόνο αντίγραφο. (σι) Η σχετική συχνότητα ανάγνωσης τόσο στο άκρο 5′ όσο και στο άκρο 3′ για το SpCas9. ο Χ Ο άξονας είναι όλοι οι συνδυασμοί ακολουθιών 7-nt ταξινομημένων με βάση τη διαφορά μεταξύ δύο άκρων με φθίνουσα σειρά. (ντο) Ακολουθία PAM για SpCas9.

Η αλλαγή πτυχής σήματος συγκρίθηκε πριν και μετά την επώαση του SpCas9 στο τσιπ για 4 ώρες. Από τις 494.866.059 αναγνώσεις (DNB), λάβαμε 366.913 DNB που εμφάνισαν αλλαγή πτυχής μεγαλύτερη από 3 και θα μπορούσαν ενδεχομένως να διασπαστούν από το SpCas9. Οι αλληλουχίες 7-nt στις περιοχές 5' και 3' PAM ανακτήθηκαν από αυτά τα DNB για περαιτέρω ανάλυση. Η συχνότητα και των 16.384 (4 7) συνδυασμών ΡΑΜ και για τα 5' και για τα 3' ΡΑΜ υπολογίστηκε και απεικονίστηκε γραφικά έναντι της μεμονωμένης αλληλουχίας στο Σχ. 3Β. Η ενδονουκλεάση SpCas9 αναφέρθηκε ότι δεσμεύεται μόνο στο 3' άκρο της αλληλουχίας στόχου. Ως εκ τούτου, χρησιμοποιήθηκαν 5'-τυχαιοποιημένες αλληλουχίες 7-nt ως ο εσωτερικός αρνητικός έλεγχος. Εφαρμόσαμε τον κανόνα των τριών σίγμα (26) στις ακολουθίες 5′ για να ορίσετε το όριο για τα θετικά σήματα PAM. Με άλλα λόγια, στο όριο του 0,11, περίπου το 99,7% των δεδομένων από την περιοχή 5′ PAM έπεσε σε θόρυβο φόντου. Αυτή η στατιστική αποκοπή οδήγησε σε 944 3' αλληλουχίες ΡΑΜ που κατά προτίμηση κόπηκαν από το SpCas9. Ένα λογότυπο ακολουθίας (19) η αναπαράσταση των αλληλουχιών αποκάλυψε ότι το SpCas9 προτιμούσε ένα μοτίβο 5'-NGG-3', αν και περίπου 5,8% (55 από 944) του 5'-NAG-3' και 1,6% (15 από 944) του 5'-NGA- Το 3′ θα μπορούσε επίσης να αναγνωριστεί (Εικ. 3C), το οποίο είναι σύμφωνο με προηγούμενα ευρήματα (2729).

Το DocMF επιτρέπει την ευαίσθητη in vitro ανίχνευση PAM σε διαφορετικά συστήματα CRISPR-Cas

Για να δείξουμε περαιτέρω τη χρησιμότητα του DocMF στην εύρεση αλληλουχιών PAM, επεκτείναμε τη μελέτη μας σε δύο προηγουμένως αχαρακτήριστα συστήματα CRISPR-Cas, το VeCas9 από Veillonella γένος και BvCas12 από Butyricimonas virosa (24). Το VeCas9 έχει μια πρωτεΐνη τελεστή Cas9 με 1064 αμινοξέα και η πρωτεΐνη BvCas12 έχει μήκος 1245 αμινοξέα. Και οι δύο πρωτεΐνες εκφράστηκαν και καθαρίστηκαν όπως περιγράφεται στα Συμπληρωματικά Υλικά και Μέθοδοι. Το crRNA και το tracrRNA του VeCas9 αναγνωρίστηκαν μέσω προσδιορισμού αλληλουχίας μικρών RNA, ενώ το crRNA του BvCas12 προβλέφθηκε σε silico με βάση τα προηγούμενα αναφερθέντα ορθόλογα Cas12a/Cpf1 (εικ. S3). Για να διερευνήσουμε την ποικιλομορφία των αλληλουχιών PAM τους, πραγματοποιήσαμε το DocMF σε VeCas9 και BvCas12 χρησιμοποιώντας την ίδια βιβλιοθήκη DNB PAM (Εικ. 3Α) που χρησιμοποιήθηκε στη μελέτη SpCas9. Για τα πειράματα VeCas9, συμπεριλάβαμε τρία μεμονωμένα σχέδια gRNA, crRNA:tracrRNA, sgRNA-1 με δομή SpCas9 και ένα περικομμένο sgRNA-2 (εικ. S3).

Πριν χρησιμοποιήσετε το DocMF, μια ανάλυση εξάντλησης PAM (24) πραγματοποιήθηκε για πρώτη φορά στο VeCas9 για σύγκριση μεθοδολογίας (Συμπληρωματικά Υλικά και Μέθοδοι). Όπως φαίνεται στο σχ. S4 (Α και Β), με 4,62 Gb δεδομένων αλληλουχίας, παρατηρήσαμε 508 αλληλουχίες με ουδό 3 για Alicyclobacillus acidoterrestris C2c1 (AacC2c1), ένας θετικός μάρτυρας στον προσδιορισμό εξάντλησης και αναγνώρισε σωστά το αναφερόμενο PAM, 5'-TTN-3' (24). Ωστόσο, με ακόμη περισσότερα δεδομένα αλληλουχίας (7,33 Gb) για το VeCas9, βρέθηκαν 0 και 74 διακριτές αλληλουχίες με κατώφλια 3 και 0,8, αντίστοιχα (εικ. S4, C και D). Τα αποτελέσματα για το VeCas9 ήταν αρκετά παρόμοια με τα σύνολα αρνητικών μαρτύρων μας (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται) και έτσι, δεν μπορέσαμε να εντοπίσουμε τις σωστές αλληλουχίες PAM για το VeCas9 χρησιμοποιώντας την παραδοσιακή μέθοδο εξάντλησης. Η αποτυχία θα μπορούσε να αποδοθεί είτε στην αδύναμη έκφραση της πρωτεΐνης VeCas9 είτε στη λειτουργία της Ε. coli κύτταρα. Επιπλέον, η χαμηλή ευαισθησία (

20× κάλυψη για κάθε ακολουθία PAM 7-nt) του Ε. coli ο προσδιορισμός εξάντλησης θα μπορούσε μόνο να επιδεινώσει τα προβλήματα.

Χρησιμοποιώντας το DocMF, επιλέχθηκαν DNB με αλλαγή πτυχής σήματος πάνω από το όριο για περαιτέρω ανάλυση. Στο διάγραμμα συχνότητας ανάγνωσης (Εικ. 4, Α και Β), η περιοχή 5' PAM του VeCas9 (με sgRNA-1) και η περιοχή 3' PAM του BvCas12 δεν εμφάνισαν μοτίβο δέσμευσης πρωτεΐνης και τα αντίστοιχα 3 SD (0,09 για Το VeCas9 και το 0,075 για το BvCas12) χρησιμοποιήθηκαν για τον καθορισμό των γραμμών αποκοπής. Ως αποτέλεσμα, 4947 και 5580 μοναδικές αλληλουχίες ΡΑΜ προσδιορίστηκαν να διασπαστούν από VeCas9 και BvCas12, αντίστοιχα. Και τα δύο συστήματα CRISPR-Cas μετέφεραν μεγάλες οικογένειες PAM όπως απεικονίζεται στις συναινετικές ακολουθίες και το λογότυπο ακολουθίας, δύο κοινά σχήματα αναφοράς PAM (Εικ. 4, Γ έως Ε και Ζ)22, 23). Οι συναινετικές αλληλουχίες του VeCas9 αποκαλύφθηκαν ως 5'-NNARRNN-3' ή NYARRMY για ένα ακόμη πιο κυρίαρχο σύνολο ακολουθιών PAM ανά διάγραμμα συχνότητας (Εικ. 4C), ενώ το λογότυπο της ακολουθίας ανέφερε 5'-NNNRR-3' ακολουθίες PAM ( Εικ. 4Ε). Το VeCas9 με τα άλλα gRNA παρουσίασε παρόμοιο μοτίβο (εικ. S5). Πάνω από το 99% των PAM με το βραχύ sgRNA-2 βρέθηκαν με τουλάχιστον ένα από τα άλλα δύο RNA, υποδεικνύοντας την υψηλή αναπαραγωγιμότητα αυτής της μεθόδου DocMF. Μικρή διαφορά στο PAM του BvCas12 παρατηρήθηκε επίσης μεταξύ των μεθόδων αναφοράς PAM. Η συναινετική αλληλουχία και το λογότυπο ακολουθίας αναφέρθηκαν 5'-TYTN-3' (Εικ. 4D) ή YYN (Εικ. 4G), αντίστοιχα. Ωστόσο, αυτά τα δύο συστήματα αναφοράς αγνόησαν τη συσχέτιση μεταξύ των επτά θέσεων και ενδέχεται να εισαγάγουν ορισμένα λανθασμένα ενεργά PAM εάν συνδυάσουν τυχαία κάθε θέση.

(ΕΝΑ) Η σχετική συχνότητα ανάγνωσης και στο άκρο 5′ και στο άκρο 3′ για το VeCas9. (σι) Η σχετική συχνότητα ανάγνωσης και στο άκρο 5′ και στο άκρο 3′ για το BvCas12. Συναινετική ακολουθία PAM ανά διάγραμμα συχνότητας με όλες τις ανιχνευμένες ακολουθίες 7-nt για το VeCas9 (ντο) και BvCas12 (ρε). Λογότυπο ακολουθίας PAM ανά ακολουθία για το VeCas9 που δημιουργήθηκε από όλες τις ανιχνευμένες ακολουθίες 7-nt (μι) και από τις κορυφαίες 1000 ακολουθίες 7-nt από ανάλυση FET (φά). Λογότυπο ακολουθίας PAM ανά ακολουθία για BvCas12 που δημιουργήθηκε από όλες τις ανιχνευμένες ακολουθίες 7-nt (σολ) και από τις κορυφαίες 1000 ακολουθίες 7-nt από ανάλυση FET (H). (Εγώ) In vitro επικύρωση των αλληλουχιών ΡΑΜ VeCas9. Επιλέχθηκαν εννέα αλληλουχίες 7-nt η καθεμία πάνω/κάτω από την αποκοπή. Οι αριθμοί κατάταξης FET εμφανίζονται με κόκκινο χρώμα. NC, αρνητικός έλεγχος. (J) In vitro επικύρωση των BvCas12 PAM αλληλουχιών. Επιλέχθηκαν πέντε αλληλουχίες 7-nt πάνω από την αποκοπή και δύο αλληλουχίες 7-nt κάτω από την αποκοπή.

Για να διερευνηθεί η σχετική δραστηριότητα κάθε PAM, εφαρμόστηκαν δύο μέθοδοι, η FET και ο τροχός PAM. Το FET εισήχθη για την ταξινόμηση των ακολουθιών PAM. Το FET είναι ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο τεστ για να προσδιοριστεί εάν η διαφορά μεταξύ δύο ομάδων είναι σημαντική. Επομένως, ένα συγκεκριμένο PAM με μικρότερο Π Η τιμή σύμφωνα με το FET έδειξε ότι η σχετική συχνότητα ανάγνωσης ή η απόδοση κοπής ήταν πιο σημαντική σε σύγκριση με μια με μεγαλύτερη Π αξία. Αφού κατατάξαμε τα PAM με τη σειρά, εξετάσαμε τις συναινετικές αλληλουχίες PAM για τις κορυφαίες 1000 αλληλουχίες (Εικ. 4, F και H). Μια ελαφρώς διακριτή συναινετική ακολουθία PAM, 5'-NNARR-3' για VeCas9 και 5'-TTTN-3 για BvCas12, παρατηρήθηκε κάτω από αυτά τα αυστηρά κριτήρια επιλογής, τα οποία συσχετίστηκαν καλύτερα με τα αποτελέσματα της γραφικής παράστασης συχνότητας (Εικ. 4, C και D ). Για περαιτέρω επικύρωση της πρόβλεψης FET, διεξήχθη in vitro προσδιορισμός νουκλεάσης με τυχαία επιλεγμένες αλληλουχίες ΡΑΜ. Τα προϊόντα PCR που περιείχαν μεμονωμένα ΡΑΜ και έναν κοινό πρωτοδιαχωριστή επωάστηκαν είτε με πρωτεΐνες Cas9 είτε Cas12/Cpf1 στους 37°C για 1 ώρα. Αντιδράσεις με 50 ng εισόδου διεξήχθησαν σε πηκτώματα ΤΑΕ και η εναπομένουσα ποσότητα εισόδου χρησιμοποιήθηκε για τον υπολογισμό της αποτελεσματικότητας διάσπασης. Όπως αποδεικνύεται στο Σχ. 4 (G και H), τα PAM με υψηλότερους αριθμούς κατάταξης FET (με κόκκινο) είχαν λιγότερη είσοδο, υποδεικνύοντας καλύτερη απόδοση κοπής. Το λιγότερο ταξινομημένο PAM έδωσε ελάχιστη κοπή, το προϊόν του οποίου δεν ήταν σχεδόν ορατό σε πηκτώματα αγαρόζης των οποίων η ευαισθησία είναι αρκετές τάξεις μεγέθους χαμηλότερη από το NGS. Η συνέπεια πρότεινε ότι θα μπορούσαμε να χρησιμοποιήσουμε την πρόβλεψή μας FET για να επιλέξουμε τα πιο ενεργά PAM για in vivo επεξεργασία γονιδίων.

Ένας τροχός PAM χρησιμοποιήθηκε επίσης για την πλήρη κατανόηση των ακολουθιών PAM και της εξάρτησής τους από τη βάση. Ο τροχός PAM, που προέρχεται από διαδραστικά διαγράμματα Krona, καταγράφει μεμονωμένες ακολουθίες PAM και τη σχετική τους δραστηριότητα, συμπεριλαμβανομένων αυτών με χαμηλό εμπλουτισμό (20). Μπορεί επίσης να επεκταθεί σε οποιοδήποτε τομέα του τροχού για καλύτερη προβολή ενός υποσυνόλου ακολουθιών και μελέτη της λειτουργίας αυτών των PAM. Το Σχήμα 5 (Α και Β) απεικονίζει τους αντίστοιχους τροχούς PAM για VeCas9 και BvCas12. Για το VeCas9, υπάρχει ισχυρή εξάρτηση βάσης μεταξύ της θέσης 3 και 4. Εάν η θέση 3 είχε βάση R (A ή G), η θέση 4 έτεινε να έχει R (>80% εικ. S6) και ένα μικρό αλλά αξιοσημείωτο επίπεδο C ( >0%). Εάν η θέση 3 είναι Y (T ή C), η θέση 4 προτιμά μόνο R (

99%). Το Τ είναι η λιγότερο ευνοημένη βάση στη θέση 4 ή 5, η οποία συμφωνεί με τα αποτελέσματα κοπής in vitro από το Σχ. 5C (λωρίδες 9 και 10). Το πήκτωμα έδειξε επίσης ότι το NYARRMY (το συναινετικό PAM που βασίζεται στην πιο κυρίαρχη λωρίδα συναινετικής ακολουθίας 1 στο Σχήμα 4Γ), το NNARRNN (λωρίδες 2 έως 4) και το ACAAGCC (58η σειρά κατάταξης ως λωρίδα θετικού ελέγχου 11) κόπηκαν πιο αποτελεσματικά από NNCRRNN (λωρίδα 5), NNTRRNN (λωρίδα 6) ή NNGRRNN (λωρίδα 7), γεγονός που εξηγεί γιατί το Α αποτελούσε 47% στη θέση 3, ενώ οι άλλες τρεις βάσεις ήταν μεταξύ 16 και 19% η καθεμία (Εικ. 5Α και εικ. S6 ). Για τον τροχό BvCas12 PAM που φαίνεται στο Σχ. 5Β, βρήκαμε ότι η θέση -4 ήταν τυχαία όταν και οι δύο θέσεις -2 και -3 ήταν Y (T/C). Έτσι, το PAM YYN παρήγαγε περισσότερα προϊόντα κοπής από το YRN στο Σχ. 5D (λωρίδες 1 και 2). Ωστόσο, η θέση −4 έτεινε να είναι T εάν μία από τις θέσεις −2 ή −3 δεν ήταν Υ. Ως αποτέλεσμα, παρατηρήσαμε ελαφρώς μεγαλύτερη κοπή με το T από το V στη θέση −4, όταν οι θέσεις −2 και −3 είναι είτε RY ή YR (Εικ. 5D λωρίδες 7 έως 10). Το R στη θέση −2 υπαγόρευσε επίσης ότι η θέση −3 θα είναι Y (100% εικ. S6). Όπως φαίνεται στην Εικ. 5D, το σύστημα BvCas12 έδειξε καθαρή κοπή σε 5'-TTTN-3' ή TYTN (Εικ. 5D). Τα δεδομένα μας υποδηλώνουν ότι τόσο το VeCas9 όσο και το BvCas12 είχαν ένα σύνολο χαλαρών ακολουθιών PAM που καταγράφηκαν πλήρως από το DocMF.

(ΕΝΑ) Τροχός PAM για VeCas9. Το επάνω κίτρινο πλαίσιο δίνει μια ένδειξη για κάθε θέση της ακολουθίας PAM και το βέλος απεικονίζει τον προσανατολισμό κάθε βάσης. Η περιοχή ενός τομέα του δακτυλίου για μια βάση σε μια συγκεκριμένη θέση αντιπροσωπεύει τη συχνότητά του σε αυτή τη θέση. (σι) Τροχός PAM για BvCas12. (ντο) Επικύρωση in vitro των αποτελεσμάτων τροχού PAM VeCas9. Το NYARRMY είναι η συναινετική αλληλουχία που βασίζεται στη συχνότητα θέσης, ενώ η ACAAGCC είναι η 58η ακολουθία κατάταξης FET που περιλαμβάνεται ως θετικός έλεγχος. (ρε) Επικύρωση in vitro των αποτελεσμάτων τροχού PAM BvCas12. Το NNNTTTN ή το NNNTYTN είναι η συναινετική ακολουθία που βασίζεται στη συχνότητα θέσης, ενώ η AATTTTG είναι η 70η ακολουθία κατάταξης FET που περιλαμβάνεται ως θετικός έλεγχος. NC (αρνητικός έλεγχος): θετικά PAM που επωάζονται με αντίστοιχη πρωτεΐνη αλλά χωρίς κανένα sgRNA.

Το DocMF μπορεί να αναγνωρίσει με ακρίβεια τις θέσεις δέσμευσης πρωτεϊνών

Οι αλληλεπιδράσεις πρωτεΐνης-DNA έχουν χαρακτηριστεί σε πολλές πλατφόρμες υψηλής απόδοσης, όπως μικροσυστοιχίες, HT-SELEX και CHAMP (4, 11). Τροποποιήσαμε τη ροή εργασίας DocMF που αναφέρεται παραπάνω για να ανιχνεύσουμε μοτίβα σύνδεσης πρωτεΐνης-DNA. Τα βήματα παρέμειναν αμετάβλητα μέχρις ότου ο φυσικός συμπληρωματικός κλώνος συντέθηκε εκ νέου για να σχηματίσει dsDNA 50-bp και το άκρο να επισημανθεί με φθορίζουσες βαφές. Αφού δεσμεύσαμε την πρωτεΐνη που μας ενδιαφέρει στους στόχους dsDNA της και ξεπλένουμε τυχόν περίσσεια, αποκτήσαμε τις πρώτες εικόνες για να καταγράψουμε την ένταση του σήματος. Μετά από αυτή την πρώτη απεικόνιση, μια επώαση στο τσιπ με ρυθμιστικό αντίδρασης MDA, dNTPs και μια πολυμεράση με ισχυρή μετατόπιση κλώνου πραγματοποιήθηκε στους 30°C για 30 λεπτά για να συντεθεί ένας δεύτερος συμπληρωματικός κλώνος χρησιμοποιώντας το ssDNB ως ​​πρότυπο (εικ. S1). Κατά συνέπεια, ο αρχικός φθορίζων κλώνος θα αντικατασταθεί και θα μετατοπιστεί από τα DNB, οδηγώντας σε πτώση σήματος όταν δεν υπήρχε δέσμευση πρωτεΐνης για την πρόληψη του MDA. Για να δοκιμάσουμε αυτήν την ιδέα, χρησιμοποιήσαμε μια καλά μελετημένη πρωτεΐνη, την dCas9, και αφαιρέσαμε τη δράση της ενδονουκλεάσης μέσω σημειακών μεταλλάξεων στους τομείς ενδονουκλεάσης HNH και RucV (17). Οι σημειακές μεταλλάξεις D10A και H840A άλλαξαν δύο σημαντικά υπολείμματα για τη δραστηριότητα της ενδονουκλεάσης, η οποία τελικά έχει ως αποτέλεσμα την απενεργοποίησή της. Αν και το dCas9 στερείται δραστηριότητας ενδονουκλεάσης, παραμένει ικανό να δεσμεύεται με το gRNA του και τον κλώνο DNA που στοχεύεται επειδή η δέσμευση γίνεται μέσω των περιοχών REC1, BH και PI.30). Επιπλέον, το dCas9 έχει προηγουμένως αποδειχθεί ότι δεν συνδέεται με την αλληλουχία στόχο του όταν δεν υπάρχει PAM (NGG)31). Σε αντίθεση με τις παραπάνω μελέτες, οι αναγνώσεις με αλλαγή πτυχής φθορισμού κάτω από το όριο θεωρήθηκαν θετικές, υποδεικνύοντας τα DNB που το dCas9 μπορούσε να αναγνωρίσει και να δεσμεύσει. Επιπλέον, συμπεριλάβαμε μια λωρίδα αρνητικού ελέγχου χωρίς επώαση dCas9 στην ίδια διαδικασία, καθώς το BGISEQ-500 έχει δύο λωρίδες σε ένα μόνο τσιπ. Περίπου το 95% του συνόλου των 253M αναγνώσεων από τη λωρίδα αρνητικού ελέγχου έχασε το ήμισυ της έντασης του σήματος (τα δεδομένα δεν εμφανίζονται). Επιλέξαμε μια αλλαγή σήματος στο 0,5 ως κατώφλι (εικόνα 2/εικόνα 1) και ανακτήσαμε 14.371.289 από 335.497.075 και 15.647.574 από 337.529.837 αναγνώσεις από πειραματικές λωρίδες και λωρίδες ελέγχου, αντίστοιχα. Εισαγάγαμε μια αξιόπιστη έννοια σχετικής ισχύος δέσμευσης για να αξιολογήσουμε την ισχύ δέσμευσης για κάθε ακολουθία 7-nt. Ομοίως, τα δεδομένα στο άκρο 5' που προσαρμόζονται σε μια κανονική κατανομή θεωρήθηκαν ως θόρυβος περιβάλλοντος και υιοθετήθηκε ο κανόνας των τριών σίγμα για να οριστεί η αποκοπή στο 0,135. Αφού αφαιρέσαμε τους θορύβους, παρατηρήσαμε ότι η ακολουθία NGG ήταν απαραίτητη για τη δέσμευση του dCas9 (Εικ. 6), σύμφωνα με προηγούμενα ευρήματα. Αυτό υποδηλώνει ότι με το τροποποιημένο DocMF, οι ροές εργασίας μπορούν να αξιοποιηθούν ως γενικό εργαλείο για την αναγνώριση μοτίβων σύνδεσης DNA.

(ΕΝΑ) Η σχετική ισχύς σύνδεσης τόσο στο άκρο 5′ όσο και στο άκρο 3′ για το dCas9. ο Χ Ο άξονας είναι όλοι οι συνδυασμοί ακολουθιών 7-nt και ταξινομείται αυτόματα κατά γράμμα χρησιμοποιώντας το Excel. (σι) Το λογότυπο ακολουθίας για το dCas9 δημιουργήθηκε από όλες τις ανιχνευμένες αλληλουχίες 7-nt με βάση αυτές με την υψηλότερη σχετική ισχύ δέσμευσης.


Βαφή μπλε μεθυλίου σε μαγιά

Η διαδικασία χρώσης κυανού του μεθυλενίου χρησιμοποιείται για τη μέτρηση της βιωσιμότητας της ζύμης με βάση την υπόθεση ότι το μπλε του μεθυλενίου θα εισέλθει στα κύτταρα και θα διασπαστεί από ζωντανά κύτταρα ζύμης που παράγουν τα ένζυμα που διασπούν το μπλε του μεθυλενίου, αφήνοντας τα κύτταρα άχρωμα. Τα μη βιώσιμα κύτταρα δεν παράγουν αυτό το ένζυμο (ή τα ένζυμα) και ως εκ τούτου το μπλε του μεθυλενίου που εισέρχεται στα κύτταρα είναι μη αποικοδομημένο με αποτέλεσμα τα κύτταρα να παραμένουν έγχρωμα (η οξειδωμένη μορφή συμπυκνώνεται ενδοκυτταρικά).

Στη συνέχεια, τα έγχρωμα και άχρωμα κύτταρα μετρώνται χρησιμοποιώντας ένα αιμοκυτταρόμετρο και προσδιορίζεται ο αριθμός των βιώσιμων και μη βιώσιμων κυττάρων σε μια δεδομένη περιοχή, το αποτέλεσμα θα χρησιμοποιηθεί στη συνέχεια για την εκτίμηση του αριθμού των κυττάρων στο αρχικό δείγμα.

Αυτή είναι μια εύκολη, γρήγορη και φθηνή μέθοδος για τον προσδιορισμό της ποσότητας βιώσιμης μαγιάς που υπάρχει σε ένα δείγμα, αν και αυτή δεν είναι η καλύτερη μέθοδος για διάφορους λόγους. A major reason is that methylene blue rapidly becomes toxic to the yeast and as such preparations should be examined within 10 minutes of preparation.

The older the cells become, the less likely that they are to take up the methylene blue dye from solution since as the yeast age, they deposit lipid and/or sugar in their cell membrane (in the form of free sterols[predominantly ergosterol and zymosterol with minor portions of lanosterol and fecosterol] and phospholipids[phosphotidylcholine and phosphotidylethanolamine with minor portions of phosphotidylinositol, phosphotidylserine and phosphotidyl-glycerol]) as a survival mechanism to protect their internal mechanisms from the buildup of waste in the external environment.

This means that cells which are not viable would not take up the dye and due to their age and not their ability to break down the methylene blue (as a result of their viability) would remain colourless and be determined to be viable (a false positive). The test itself is also not very accurate since yeast might not be evenly distributed in the original sample and depending on the sample taken for determination , may yield higher or lower viability counts than are really present in the original sample.

This viability count and cell count is absolutely essential since the yeasts are the producers of the ethanol through the breakdown of sugars (catabolism of sugars by glycolysis to pyruvate, which is then converted to CO2 and ethanol) present in the wort/must (the pitching rate is a measure of the number of viable yeast present in a particular stock being used for fermentation). These processes can only be performed by viable yeast cells and consequently the greater the umbers of viable yeasts in the sample, the higher the rate of ethanol production. The expected yield of ethanol (alcohol) can also be calculated based on the number of viable yeast present in a particular stock being used for fermentation (along with the sugar present in the wort). This is very important in industrial alcohol production to determine the required alcohol content of the final product and the viability of the yeast pitched must be greater then 85% or it is not used.


Pioneering technique paves way for fast and cheap fabrication of rapid medical diagnostic tools

Example 100-micron wide 3D-printed microchannel scaffolds, shown next to a 20p coin - the cost to print 1000 of these channels. Credit: University of Bristol

New technology developed by the University of Bristol has the potential to accelerate uptake and development of on-chip diagnostic techniques in parts of the world where rapid diagnoses are desperately needed to improve public health, mortality and morbidity.

Microfluidic devices underpin lab-on-a-chip (LOC) technologies which are developed to provide the rapid diagnoses at that are needed at point of care (POC) for the swift and effective treatment of many diseases.

Researchers at Bristol have developed a fast, reliable and cost-effective alternative for producing the soft-lithographic moulds used for fabricating microfluidic devices, published in the journal PLOS ONE. This discovery means fabrication of microfluidic devices (with channel dimensions

width of a human hair) is now both accessible and affordable using simple, low-cost 3-D-printing techniques and the open-source resources developed by the team.

"Previously, techniques for producing the soft-lithographic scaffolds/moulds (microfluidic channel patterns) were time-consuming and extremely expensive, while other low-cost alternatives were prone to unfavourable properties. This development could put LOC prototyping into the hands of researchers and clinicians who know the challenges best, in particular those in resource-limited settings, where rapid diagnostics may often have the greatest impact," said lead author of the study, Dr. Robert Hughes.

Dye-mixing inside a microfluidic chip made using 3D-printed interconnecting channel scaffolds. Credit: University of Bristol

"This technique is so simple, quick & cheap that devices can be fabricated using only everyday domestic or educational appliances and at a negligible cost (

0.05% of cost of materials for a single microfluidic device). This means researchers and clinicians could use our technique and resources to help fabricate rapid medical diagnostic tools, quickly and cheaply, with minimal additional expertise or resources required," said co-author, Mr Harry Felton.

"The simplicity and minimal cost of this technique, as well as the playful click-and-connect approach developed, also makes it suitable for hobbyists and educational use, to teach about microfluidics and the applications of lab-on-a-chip technology," said co-author Ms Andrea Diaz Gaxiola.

"It is our hope that this will democratise microfluidics and lab-on-a-chip technology, help to advance the development of point-of-care diagnostics, and inspire the next generation of researchers and clinicians in the field," said Dr. Hughes.

Simplified flow-diagram of the low-cost technique for fabricating microfluidic devices. Resulting channels can be applied directly to a glass surface with no additional treatment. Credit: University of Bristol

The next step for the team is to identify potential collaborators in both research and education to help demonstrate the impact this technology could have in both settings by developing and supporting outreach activities and applications for on-chip diagnostic testing.


Science works in strange ways. The experiment, which requires a few basic metal materials and a small digital clock, also calls for an uncooked spud and America's least expensive coin -- the penny. After setting up an electrical circuit with the objects, the potato's natural acidity interacts with the penny's copper to complete one half of this natural "battery's" circuit.

Science fair students, like real scientists, should work to gain consent from people before including them in an experiment.


Συνεταιρισμοί

Department of Microbiology, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Scott Sherrill-Mix, Young Hwang, Aoife M. Roche, Abigail Glascock, Susan R. Weiss, Yize Li, Louis J. Taylor & Frederic D. Bushman

Department of Medicine, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Scott Sherrill-Mix, Jevon Graham-Wooten & Ronald G. Collman

Department of Genetics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Leila Haddad, Peter Deraska, Caitlin Monahan, Andrew Kromer & Arupa Ganguly

Department of Emergency Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA

Department of Biochemistry and Biophysics, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, 19104, USA


Be safe and follow some simple rules

  • Never use the same pots and utensils for dyeing that you use for cooking.
  • Wear rubber gloves and use a face mask when measuring mordants and dyes.
  • Work in a well ventilated area.
  • Dispose of used mordants and dye baths safely.

Λοιπόν το έχεις. A simple and practical guide to the use of mordants and fixitives in your natural dyeing products!

Whilst all this talk may seem a little off-putting at first, hopefully you now see how simple and fun the whole affair really is!

But… if you’re still feeling a bit shell shocked, do consider my Natural Dyeing Bootcamp. I cover 4 stunning natural dyeing projects in detail that don’t require mordants or fixatives at all!

Not sure where to get started? Check out my 30 day Natural Dyeing Boot Camp! Try It Now


Δες το βίντεο: Deoxynucleotide dNTP vs Dideoxynucleotid ddNTP (Νοέμβριος 2022).