Πληροφορίες

3.3C: Μικροσκοπία παρεμβολής - Βιολογία

3.3C: Μικροσκοπία παρεμβολής - Βιολογία


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

ΣΤΟΧΟΙ ΜΑΘΗΣΗΣ

  • Περιγράψτε τις αρχές και τους διαφορετικούς τύπους μικροσκοπίας παρεμβολής

Στερεοφωνική πηγή φωτός

Η μικροσκοπία παρεμβολής χρησιμοποιεί ένα πρίσμα για να χωρίσει το φως σε δύο ελαφρώς αποκλίνουσες δέσμες που στη συνέχεια περνούν μέσα από το δείγμα. Επομένως, βασίζεται στη μέτρηση των διαφορών στο δείκτη διάθλασης κατά τον ανασυνδυασμό των δύο ακτίνων. Η παρεμβολή εμφανίζεται όταν μια δέσμη φωτός καθυστερεί ή προωθείται σε σχέση με την άλλη.

Υπάρχουν τρεις τύποι μικροσκοπίας παρεμβολής: η κλασική, η διαφορική αντίθεση και η αντίθεση φθορισμού. Από την εισαγωγή της στα τέλη της δεκαετίας του 1960, η μικροσκοπία αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής (DIC) είναι δημοφιλής στη βιοϊατρική έρευνα επειδή παράγει εικόνες υψηλής ανάλυσης λεπτών δομών ενισχύοντας τις διεπαφές με αντίθεση. Η εικόνα που παράγεται είναι λεπτής οπτικής τομής και εμφανίζεται τρισδιάστατη, με μια σκιά γύρω της. Αυτό δημιουργεί μια αντίθεση σε όλο το δείγμα που είναι φωτεινή στη μία πλευρά και πιο σκούρα στην άλλη.

Το μικροσκόπιο παρεμβολής

Το μικροσκόπιο είναι ένα μικροσκόπιο φωτός φωτεινού πεδίου με την προσθήκη των ακόλουθων στοιχείων: έναν πολωτή μεταξύ της φωτεινής πηγής και του συμπυκνωτή, ένα πρίσμα διαχωρισμού δέσμης DIC, ένα πρίσμα συνδυασμού δέσμης DIC και έναν αναλυτή. Ο χειρισμός του πρίσματος αλλάζει τον διαχωρισμό της δέσμης, ο οποίος αλλάζει την αντίθεση της εικόνας. Όταν οι δύο δέσμες περνούν από το ίδιο υλικό σε όλο το δείγμα, δεν προκαλούν παρεμβολές. Όταν οι δύο δοκοί περνούν από διαφορετικό υλικό κατά μήκος του δείγματος, όπως στις άκρες, προκαλούν αλλοίωση όταν συνδυάζονται.

Το μικροσκόπιο αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής φθορισμού (FLIC) αναπτύχθηκε συνδυάζοντας μικροσκοπία φθορισμού με DIC για την ελαχιστοποίηση των επιπτώσεων της φωτολεύκανσης στα φθοροχρωματικά δεσμευμένα στο χρωματισμένο δείγμα. Το ίδιο μικροσκόπιο είναι εξοπλισμένο για την ταυτόχρονη απεικόνιση ενός δείγματος χρησιμοποιώντας DIC και φωτισμό φθορισμού.

Βασικά σημεία

  • Η μικροσκοπία παρεμβολής είναι ανώτερη από τη μικροσκοπία αντίθεσης φάσης στην ικανότητά της να εξαλείφει φωτοστέφανα και επιπλέον φως.
  • Στη μικροσκοπία αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής (DIC), η διαφορά οπτικής διαδρομής προσδιορίζεται από το γινόμενο της διαφοράς του δείκτη διάθλασης (μεταξύ του δείγματος και του περιβάλλοντος μέσου του) και του πάχους που διανύεται από μια δέσμη φωτός μεταξύ δύο σημείων της οπτικής διαδρομής.
  • Οι εικόνες που παράγονται από την DIC έχουν μια χαρακτηριστική εμφάνιση σκιάς.

Βασικοί Όροι

  • φωτολεύκανση: Η καταστροφή ενός φωτοχημικού φθορισμού από φως υψηλής έντασης
  • φθοροχρώμιο: Οποιαδήποτε από τις διάφορες φθορίζουσες βαφές που χρησιμοποιούνται για τη χρώση βιολογικού υλικού πριν από τη μικροσκοπική εξέταση

Μικροσκόπιο: Τύποι μικροσκοπίου

Τα ακόλουθα σημεία επισημαίνουν τους δεκατρείς κύριους τύπους μικροσκοπίων. Μερικοί από τους τύπους είναι: Απλό μικροσκόπιο 2. Σύνθετο μικροσκόπιο 3. Ερευνητικό μικροσκόπιο 4. Διόφθαλμο μικροσκόπιο ανατομής 5. Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης 6. Μικροσκόπιο παρεμβολής 7. Μικροσκόπιο αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής 8. Μικροσκόπιο φθορισμού 9. Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο 10. Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης και άλλα.

Τύπος # 1. Απλό μικροσκόπιο:

1. Ένα απλό μικροσκόπιο είναι ένας κυρτός φακός μικρής εστιακής απόστασης.

2. Χρησιμοποιείται για να σχηματίσει μια εικονική εικόνα ενός αντικειμένου που βρίσκεται ακριβώς μέσα στην κύρια εστίασή του.

3. Αποτελείται από έναν μόνο κυρτό φακό ή από συνδυασμό φακών που λειτουργεί ως κυρτός φακός.

4. Ο κυρτός φακός μεγεθύνει το αντικείμενο και επίσης βοηθά στη δημιουργία μιας μεγεθυμένης εικόνας ενός κοντινού αντικειμένου που φαίνεται να βρίσκεται σε απόσταση διακριτής όρασης.

5. Κάτω από απλό μικροσκόπιο η μεγεθυμένη εικόνα (Εικ. 143) του αντικειμένου σχηματίζεται στον αμφιβληστροειδή του ματιού του θεατή.

6. Ένας απλός φακός μπορεί να μεγεθύνει ένα αντικείμενο μόνο τρεις φορές OX). Για μεγέθυνση μεγαλύτερη από 3Χ, χρησιμοποιείται ένας συνδυασμός πολλών φακών. Ένας τέτοιος συνδυασμός πολλών φακών (που ονομάζονται στοιχεία) λειτουργεί ως ένας απλός κυρτός φακός και μπορεί να επιτευχθεί μεγέθυνση περίπου 20Χ.

7. Βελτιωμένα απλά μικροσκόπια, που χρησιμοποιούνται από τους βιολόγους κατά την επιτόπια εργασία, μπορούν να μεγεθύνουν ένα αντικείμενο ακόμη και έως και 100 φορές. Σε τέτοια μικροσκόπια, χρησιμοποιούνται φακοί πολλαπλών στοιχείων. Αποτελείται από έναν συνδυασμό διπλού κοίλου φακού από γυαλί κορώνας τοποθετημένου ανάμεσα σε δύο διπλούς κυρτούς φακούς από πυριτό γυαλί. Αυτό ονομάζεται aplanarlens ή αχρωματική τριπλέτα. Τρεις από αυτούς τους επίπεδους φακούς συγκολλούνται μεταξύ τους και λειτουργούν ως ένας φακός.

Ένα ανατομικό μικροσκόπιο (Εικ.144) είναι ένα παράδειγμα απλού μικροσκοπίου που χρησιμοποιείται είτε για την ανατομή του υλικού είτε για την προβολή της μεγεθυσμένης εικόνας του υλικού. Αποτελείται από μία μόνο μονάδα φακού. Αυτή η μονάδα φακού μπορεί να είναι ακόμη και ένας συνηθισμένος μεγεθυντικός φακός.

Χρησιμοποιείται είτε για την ανατομή του υλικού είτε για λιγότερες μεγεθύνσεις, δηλαδή μόνο 6Χ, 12Χ ή σπάνια 20Χ. Χρησιμοποιείται κυρίως για διαχωρισμό εμβρύων, ταξινομικές μελέτες κλπ. Έχει βασικό πόδι και άκρο. Το ‘στάδιο’, που αποτελείται από μια απλή γυάλινη πλάκα, είναι προσαρτημένο στο άκρο.

Για τους σκοπούς της ρύθμισης του φωτός, ένας καθρέφτης προσαρτάται στο άκρο κάτω από τη σκηνή. Ο καθρέφτης μπορεί να μετακινηθεί κάθετα με τη βοήθεια μιας βίδας ρύθμισης. Στην άκρη του άκρου υπάρχει ένας διπλωμένος βραχίονας, στον οποίο τοποθετείται φακός ορισμένης μεγέθυνσης (6Χ, 12Χ κ.λπ.). Ο διπλωμένος βραχίονας μετακινείται για να διατηρείται ο φακός στην επιθυμητή θέση στη σκηνή.

Το υλικό που πρόκειται να δει κανείς ή να τεμαχιστεί κάτω από ένα μικροσκόπιο ανατομής τοποθετείται στη σκηνή. Το μάτι τοποθετείται κοντά στον φακό. Ο διπλωμένος βραχίονας γέρνει για να φέρει τον φακό πάνω από το υλικό. Το φως ρυθμίζεται από την κίνηση του καθρέφτη. Η εστίαση γίνεται με τη βοήθεια της βίδας ρύθμισης αυτού του μικροσκοπίου.

Τύπος # 2. Σύνθετο μικροσκόπιο:

Ένα σύνθετο μικροσκόπιο (Εικ. 145) περιλαμβάνει είτε δύο (αντικείμενους και προσοφθάλμιο) είτε τρία (συμπυκνωτή, αντικειμενικούς φακούς και προσοφθάλμιο ή οφθαλμικό) είδη φακών. Ο συμπυκνωτής, που βρίσκεται πάνω από τον καθρέφτη και κάτω από τη σκηνή, συλλέγει και εστιάζει τις φωτεινές ακτίνες στο επίπεδο του αντικειμένου.

Οι αντικειμενικοί φακοί (10X, 40X, 100X) είναι τοποθετημένοι σε ένα περιστρεφόμενο ακροφύσιο. Κάθε αντικειμενικός στόχος αποτελείται από ένα σύνολο στοιχείων συγχωνευμένα για να λειτουργήσουν ως ένας ενιαίος φακός. Οι στόχοι συλλέγουν ακτίνες φωτός από το αντικείμενο και σχηματίζουν μια μεγεθυμένη πραγματική εικόνα σε κάποια απόσταση από πάνω τους (Εικ. 146).

Οι προσοφθάλμιοι ή οφθαλμοί βρίσκονται στην κορυφή του σωλήνα του σώματος. Το προσοφθάλμιο έχει συνήθως φακούς 5Χ, 10Χ ή 15Χ. Ο προσοφθάλμιος φακός μεγεθύνει την εικόνα που σχηματίζεται από τον αντικειμενικό φακό (Εικ. 146). Ένα μικροσκόπιο με ένα οφθαλμικό ή προσοφθάλμιο φακό ονομάζεται μονόφθαλμο μικροσκόπιο ενώ αυτό με δύο οφθαλμικό μικροσκόπιο ονομάζεται διόφθαλμο μικροσκόπιο.

1. Το όργανο ονομάζεται έτσι επειδή αποτελείται από δύο ή περισσότερα συστήματα φακών (Εικ. 145).

2. Στο πάνω μέρος υπάρχει ο οφθαλμικός φακός. Μπορεί να γυρίσει ή να αφαιρεθεί. Στην κορυφή του οφθαλμικού φακού αναγράφεται 5Χ ή 10Χ που σημαίνει την 5πλάσια ή 10πλάσια μεγέθυνση, αντίστοιχα.

3. Ακριβώς κάτω από το οφθαλμικό είναι ένας σωλήνας σώματος, το κάτω άκρο του οποίου περιέχει ένα κυκλικό κομμάτι που ονομάζεται μύτη. Περιέχει τρεις φακούς που ονομάζονται αντικειμενικοί φακοί. Το τεμάχιο μύτης μπορεί να περιστραφεί για να αλλάξει η θέση των αντικειμένων.

4. Η επίπεδη πλατφόρμα που υπάρχει κάτω από τους στόχους ονομάζεται στάδιο.

5. Στο μπράτσο του μικροσκοπίου υπάρχουν δύο πόμολα που ονομάζονται χοντρό κουμπί ρύθμισης και κομβίο λεπτής ρύθμισης.

6. Από τους τρεις στόχους, ο συντομότερος είναι ο αντικειμενικός στόχος χαμηλής ισχύος. Έχει τον μεγαλύτερο φακό, αλλά η μεγεθυντική του ισχύς είναι η μικρότερη από τους αντικειμενικούς φακούς. Στον αντικειμενικό φακό μπορεί επίσης να γραφτεί 10Χ όπως στον οφθαλμικό φακό. Σημαίνει ότι εάν χρησιμοποιείται οφθαλμικός φακός 10Χ, η μεγέθυνση είναι 10 Χ 10 – 100 φορές.

7. Ο άλλος στόχος είναι ο στόχος υψηλής ισχύος. Η μεγέθυνσή του είναι ίση με τον αριθμό που είναι γραμμένος πάνω του πολλαπλασιαζόμενος με τη δύναμη του οφθαλμού, δηλαδή 5Χ ή 10Χ (αντικειμενικός x οφθαλμικός).

8. Ο τρίτος στόχος είναι η εμβάπτιση λαδιού. Γενικά, περιέχει μια μαύρη ταινία γύρω από το κάτω άκρο. Μια σταγόνα λαδιού χρησιμοποιείται στη διαφάνεια τη στιγμή της μελέτης με τον στόχο εμβάπτισης λαδιού. Η μεγέθυνσή του μπορεί να εκτιμηθεί ως οφθαλμικός x αντικειμενικός.

Η χρήση λαδιού είναι απαραίτητη για να διατηρούνται οι ακτίνες φωτός σωστά ευθυγραμμισμένες με τον μικρό στόχο.

9. Ακριβώς κάτω από τη σκηνή βρίσκεται ο συμπυκνωτής. Η λειτουργία του είναι να συγκεντρώνει το φως από τον καθρέφτη και να το κατευθύνει στον αντικειμενικό φακό. Ο συμπυκνωτής μπορεί να χαμηλώσει ή να ανυψωθεί από ένα κουμπί που υπάρχει στη μία πλευρά του μικροσκοπίου κάτω από τη σκηνή.

10. Ο συμπυκνωτής περιέχει ένα κλείστρο που ονομάζεται διάφραγμα ίριδας.

11. Ακριβώς κάτω από τον συμπυκνωτή υπάρχει ένα κάτοπτρο που έχει τη μία επιφάνεια επίπεδη και την άλλη κοίλη; Χρησιμοποιήστε την κοίλη επιφάνεια στο φως της ημέρας. Η επίπεδη επιφάνεια του καθρέφτη χρησιμοποιείται όταν χρησιμοποιείται ηλεκτρικός λαμπτήρας.

1. Καθαρίστε τους οφθαλμικούς και τους αντικειμενικούς φακούς με χαρτί φακών και μην τους αφαιρείτε.

2. Ενώ μελετάτε ένα αντικείμενο, μάθετε να κρατάτε το ένα χέρι στο κουμπί λεπτής εστίασης και να εστιάζετε συνεχώς πάνω-κάτω.

3. Κατά τη μελέτη οποιουδήποτε είδους προετοιμασίας, μην γέρνετε το μικροσκόπιο.

4. Αφήστε τον αντικειμενικό φακό χαμηλής ισχύος στη θέση του αφού ολοκληρώσετε όλες τις παρατηρήσεις.

5. Για να εξετάσετε ένα αντικείμενο, χρησιμοποιήστε πάντα πρώτα τη χαμηλή ισχύ και μετά τους άλλους αντικειμενικούς σκοπούς.

6. Μην αφήνετε ποτέ έναν αντικειμενικό φακό να χτυπήσει είτε στη σκηνή είτε σε μια διαφάνεια κατά την εστίαση.

7. Χρησιμοποιείτε πάντα τη λεπτή ρύθμιση με αντικειμενικό στόχο υψηλής ισχύος.

8. Όλα τα παρασκευάσματα υγρής τοποθέτησης θα πρέπει να καλύπτονται εκ των προτέρων με κάλυμμα.

9. Αποφύγετε τη συνήθεια να αφαιρείτε τα μέρη του μικροσκοπίου.

10. Μη χρησιμοποιείτε αντικειμενικό αντικείμενο εμβάπτισης λαδιού χωρίς λάδι.

11. Το διάφραγμα πρέπει να είναι ορθάνοιχτο κατά τη χρήση αντικειμενικού φακού εμβάπτισης λαδιού.

Τύπος # 3. Ερευνητικό μικροσκόπιο:

1. Είναι ένα σύνθετο μικροσκόπιο που διαθέτει φακούς εξαιρετικής ποιότητας και ορισμένες πρόσθετες δυνατότητες όπως φακό εμβάπτισης λαδιού, ενσωματωμένο φωτισμό, διόπτρα και προσάρτηση για φωτογραφική μηχανή.

2. Ο αντικειμενικός φακός 100X ονομάζεται φακός εμβάπτισης λαδιού. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί μόνο με την εισαγωγή μιας σταγόνας λαδιού εμβάπτισης μεταξύ του αντικειμενικού φακού και του γυαλιού καλύμματος. Εάν δεν χρησιμοποιείται λάδι, η εικόνα του αντικειμένου θα εμφανίζεται θολή. Το ειδικό βάρος του λαδιού εμβάπτισης είναι ισοδύναμο με το γυαλί.

3. Στην ενσωματωμένη εγκατάσταση φωτισμού, ο καθρέφτης του μικροσκοπίου αντικαθίσταται από έναν ηλεκτρικό λαμπτήρα που στεγάζεται σε θάλαμο εφοδιασμένο με διάφραγμα.

4. Διόπτρα σημαίνει αντί για ένα μάτι ο ερευνητής μπορεί να χρησιμοποιήσει και τα δύο μάτια μαζί για την παρακολούθηση. Για αυτήν την εγκατάσταση, αυτό το μικροσκόπιο είναι εξοπλισμένο με δύο προσοφθάλμιους φακούς αντί για έναν.

5. Τα μικροσκόπια με εξάρτημα για φωτογραφική μηχανή παρέχονται με τριοφθαλμικούς σωλήνες. Από αυτούς τους τρεις σωλήνες, οι δύο διαθέτουν δύο οφθαλμικά μάτια για διόφθαλμη θέαση, ενώ ο τρίτος σωλήνας διαθέτει κάμερα για λήψη φωτογραφιών.

6. Με τη χρήση αντικειμενικού φακού 15Χ και αντικειμενικού φακού 100Χ, μπορεί να επιτευχθεί μέγιστη μεγέθυνση 1500 φορές κάτω από ένα ερευνητικό μικροσκόπιο.

Τύπος # 4. Διόφθαλμο μικροσκόπιο ανατομής:

1. Σε αυτό το μικροσκόπιο δύο μικροσκοπικά συστήματα είναι τοποθετημένα δίπλα (Εικ. 147).

2. Τα δύο σετ προσοφθάλμιων φακών και οι στόχοι αυτού του μικροσκοπίου παράγουν δύο εικόνες που στήνονται από δύο πρίσματα που υπάρχουν μέσα στο σώμα.

3. Υπάρχει επαρκής χώρος μεταξύ του αντικειμενικού και της σκηνής. Αυτό βοηθά στην εύκολη ανατομή και σωστή μελέτη του υλικού.

4. Αυτό το μικροσκόπιο χρησιμοποιείται για τη διενέργεια λεπτών ανατομών των δειγμάτων και για τη μελέτη των μικτών στηριγμάτων τους, επειδή υπάρχει διαθέσιμη τρισδιάστατη εικόνα λόγω της δυνατότητας διόφθαλμης θέασης.

5. Η μέγιστη μεγέθυνση που επιτυγχάνεται με αυτό το μικροσκόπιο είναι 150Χ.

Τύπος # 5. Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης:

1. Ανακαλύφθηκε από τον καθηγητή Frits Zernike από την Ολλανδία. Η εμπορική του παραγωγή ξεκίνησε για πρώτη φορά στη Γερμανία το 1942. Για την αναγνώριση της ανακάλυψης της αντίθεσης φάσης, ο Zernike τιμήθηκε με το Noble για τη Φυσική το 1953.

2. Μόνο ζωντανά και μη χρωματισμένα κύτταρα μελετώνται στο μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Αυτό συμβαίνει επειδή τα ζωντανά κύτταρα δεν είναι συνήθως έγχρωμα (δηλ. είναι αντικείμενα καθαρής φάσης), αλλά το φως που μεταδίδεται από τις διαφορετικές δομές τους θα έχει διαφορές φάσης που προκαλούνται τόσο από διακυμάνσεις στον δείκτη διάθλασης που προκύπτουν από αλλαγές στην πρωτοπλασματική συγκέντρωση όσο και από διαφορές στο πάχος .

3. Πρόκειται για ένα ειδικά σχεδιασμένο μικροσκόπιο φωτός στο οποίο τοποθετούνται δακτυλιοειδής πλάκα φάσης και δακτυλιοειδές διάφραγμα (Εικ. 148).

4. Το δακτυλιοειδές διάφραγμα βρίσκεται κάτω από τον συμπυκνωτή. Αποτελείται από έναν κυκλικό δίσκο που έχει μια κυκλική δακτυλιοειδή αυλάκωση. Οι φωτεινές ακτίνες αφήνονται να περάσουν μέσα από το δακτυλιοειδές αυλάκι. Μέσω της δακτυλιοειδούς αυλάκωσης του δακτυλιοειδούς διαφράγματος, οι ακτίνες φωτός πέφτουν στο δείγμα ή στο αντικείμενο που πρόκειται να μελετηθεί.

Στο πίσω εστιακό επίπεδο του στόχου αναπτύσσεται μια εικόνα. Η δακτυλιοειδής πλάκα φάσης τοποθετείται σε αυτό το πίσω εστιακό επίπεδο. Αυτή η πλάκα φάσης είναι είτε μια πλάκα αρνητικής φάσης με παχιά κυκλική περιοχή είτε μια πλάκα θετικής φάσης που έχει μια λεπτή κυκλική αύλακα. Αυτή η παχιά ή λεπτή περιοχή στην πλάκα φάσης ονομάζεται συζυγής περιοχή. Η πλάκα φάσης είναι ένας διαφανής δίσκος.

5. Με τη βοήθεια του δακτυλιοειδούς διαφράγματος και της πλάκας φάσης, λαμβάνεται η αντίθεση φάσης σε αυτό το μικροσκόπιο. Αυτό επιτυγχάνεται με το διαχωρισμό των άμεσων ακτίνων από τις ακτίνες που διαθλάζονται. Οι άμεσες ακτίνες φωτός περνούν μέσα από τη δακτυλιοειδή αύλακα, ενώ οι ακτίνες φωτός που περιθλούνται διέρχονται από την περιοχή έξω από την αύλακα.

6. Ανάλογα με τους διαφορετικούς δείκτες διάθλασης των διαφορετικών κυτταρικών συστατικών, το αντικείμενο που θα μελετηθεί δείχνει διαφορετικό βαθμό αντίθεσης σε αυτό το μικροσκόπιο.

7. Δεν απαιτείται ειδική προετοιμασία στερέωσης ή χρώσης κ.λπ. για τη μελέτη αντικειμένου σε μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. Αυτό εξοικονομεί πολύ χρόνο από τον ερευνητή, επειδή μια καθαρή εικόνα μη χρωματισμένων ή ζωντανών κυττάρων φαίνεται εύκολα κάτω από αυτό το μικροσκόπιο.

8. Οι εφαρμογές της μικροσκοπίας αντίθεσης φάσης στη βιολογική έρευνα είναι πολυάριθμες.

Με αυτό μπορεί κανείς να μελετήσει:

(i) Οι πραγματικές διεργασίες της μίτωσης και της μείωσης σε ζωντανά κύτταρα

(ii) Οι πραγματικές επιδράσεις πολλών χημικών ουσιών στα ζωντανά κύτταρα

(iii) Η συμπεριφορά πολλών μικροσκοπικών οργανισμών (π.χ. πρωτόζωων) απέναντι σε διάφορους χημικούς και φυσικούς παράγοντες και

(iv) Διεργασίες που σχετίζονται με τη διαπερατότητα της πλασματικής μεμβράνης κ.λπ.

Τύπος # 6. Μικροσκόπιο παρεμβολής:

1. Αυτός είναι ένας βελτιωμένος τύπος μικροσκοπίου αντίθεσης φάσης που εμφανίζει την παρεμβολή μεταξύ του μεταδιδόμενου φωτός και αυτού που δεν μεταδίδεται μέσω ενός δείγματος.

2. Τα χρώματα παρεμβολής που παράγονται σε αυτό το μικροσκόπιο υποδεικνύουν διαφορές στο δείκτη διάθλασης.

3. Το φως σε αυτό το μικροσκόπιο χωρίζεται σε δύο δέσμες, εκ των οποίων η μία περνά μέσα από το δείγμα και η άλλη μέσω μιας δέσμης αναφοράς. Οι δύο δέσμες στη συνέχεια γίνονται για να παρεμβάλλονται στο επίπεδο εικόνας. Οι περιοχές του δείγματος που έχουν παρόμοιες οπτικές διαδρομές εμφανίζονται στην εικόνα με παρόμοιο χρώμα ή με παρόμοια φωτεινότητα.

4. Διαφορετικά από το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης, στο μικροσκόπιο παρεμβολής το κεντρικό κύμα και το κύμα περίθλασης διαχωρίζονται πλήρως κατά τη διέλευση από την πλάκα φάσης.

5. Σε αυτό το μικροσκόπιο, η δακτυλιοειδής πλάκα φάσης στερεώνεται κάτω από τον συμπυκνωτή υπο-σταδίου ενώ η πλάκα φάσης στερεώνεται πάνω από τον αντικειμενικό φακό στον αντικειμενικό φακό. Ο οφθαλμικός φακός χρησιμοποιείται για την παρατήρηση της εικόνας.

6. Αυτό το μικροσκόπιο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μέτρηση του πάχους της κυψέλης και των συστατικών της. Χρησιμοποιείται επίσης για τον προσδιορισμό του ξηρού βάρους μικροσκοπικών αντικειμένων όπως πρωτεΐνες, νουκλεϊκό οξύ κ.λπ.

Τύπος # 7. Μικροσκόπιο αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής:

1. Ονομάζεται επίσης μικροσκόπιο DIC ή μικροσκόπιο Nomarski, αυτό είναι μια βελτιωμένη έκδοση του μικροσκοπίου παρεμβολής.

2. Στο οπτικό σύστημα αυτού του μικροσκοπίου χρησιμοποιείται μόνο μία δέσμη φωτός.

3. Περνώντας μέσα από το αντικείμενο, τον αντικειμενικό και ένα ειδικό διπλοδιαθλαστικό πρίσμα, η μονή δέσμη φωτός χωρίζεται σε παρεμβαλλόμενες δέσμες.

4. Ένας πολωτής, φίλτρα αναλυτή και ένα πρίσμα αντιστάθμισης υπάρχουν επίσης σε αυτό το μικροσκόπιο.

5. Εξαιρετική αντίθεση των άκρων των κυττάρων και των οργανιδίων τους φαίνεται κάτω από αυτό το μικροσκόπιο και το οπτικό τους αποτέλεσμα είναι τρισδιάστατο.

6. Παρόμοια με το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης, μόνο τα μη χρωματισμένα κύτταρα ή υλικά μελετώνται από αυτό το μικροσκόπιο.

Τύπος # 8. Μικροσκόπιο φθορισμού:

1. Αυτός είναι ένας προηγμένος τύπος μικροσκοπίου φωτός στο οποίο το δείγμα ακτινοβολείται σε μήκη κύματος που θα διεγείρουν τα φυσικά ή τεχνητά εισαγόμενα φθοριόχρωμα. Ένα οπτικό φίλτρο αυτού του μικροσκοπίου απορροφά τα συναρπαστικά μήκη κύματος αλλά μεταδίδει τη φθορίζουσα εικόνα που μπορεί να μελετηθεί κανονικά.

2. Είναι ένα μικροσκόπιο που χρησιμοποιείται για την παρατήρηση του φθορισμού σε κύτταρα και ιστούς. (Ο φθορισμός είναι ένα φαινόμενο στο οποίο το μήκος κύματος του αόρατου υπεριώδους φωτός μετατρέπεται σε μήκος κύματος φωτός στο ορατό εύρος).

3. Ένα μικροσκόπιο φθορισμού αποτελείται από (i) μια λάμπα, (ii) το οπτικό σύστημα και (iii) ένα σύστημα παρατήρησης.

4. Το υπεριώδες φως (UV) χρησιμοποιείται ως πηγή φωτισμού σε αυτό το μικροσκόπιο. Για τη λήψη ακτίνων UV, χρησιμοποιούνται λαμπτήρες τόξου υδραργύρου υψηλής πίεσης, λαμπτήρες τόξων xenon ή λαμπτήρες αλογόνου βολφραμίου. Σε αυτό τοποθετείται επίσης ένα ζεύγος προσαρμογέων (συμπληρωματικά φίλτρα). Δεδομένου ότι οι ακτίνες UV είναι επιβλαβείς για το ανθρώπινο μάτι, ο οφθαλμικός φακός που χρησιμοποιείται σε αυτό το μικροσκόπιο είναι κατασκευασμένος από συνηθισμένο γυαλί. Αυτό βοηθά στην πρόληψη της υπεριώδους ακτινοβολίας που φθάνει στο μάτι, αλλά ο φθορισμός μπορεί να παρατηρηθεί εύκολα.

5. Αυτό το μικροσκόπιο μπορεί να ανιχνεύσει φθορίζοντα υλικά (π.χ. βαφές) εύκολα στα κύτταρα, ακόμα κι αν υπάρχουν σε ίχνη.

6. Χρησιμοποιείται επίσης στη μελέτη DNA, RNA, πρωτεϊνών και ζωνών χρωμοσωμάτων, εντοπισμού του χρωμοσώματος Υ στον άνθρωπο, ανίχνευσης ετεροχρωματίνης και σε αρκετές μελέτες ανοσολογίας.

Τύπος # 9. Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο:

1. Το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο είναι ένα όργανο που χρησιμοποιεί το μικρό μήκος κύματος μιας δέσμης ηλεκτρονίων, αντί των κυμάτων φωτός, για να επιτύχει πολύ υψηλή μεγέθυνση και ανάλυση μικροσκοπικών δομών για τις οποίες το μικροσκόπιο φωτός είναι ανεπαρκές. Περιέχει ένα ηλεκτρικό όπλο του οποίου η δέσμη διαθλάται και εστιάζεται σε ένα δείγμα από ένα σύστημα ηλεκτρονικών φακών. Η εικόνα του δείγματος μεγεθύνεται και προβάλλεται σε μια σκηνή ή μια φθορίζουσα οθόνη.

2. Με βάση πολλές προηγούμενες έρευνες στη Φυσική, οι Knoll και Ruska (1931) του Βερολίνου ήταν οι πρώτοι που ανέπτυξαν ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Με τη βοήθεια του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου τους, μπορούσαν να μεγεθύνουν αντικείμενα έως και 12.000 φορές.

Με ένα βελτιωμένο είδος ηλεκτρονικού μικροσκοπίου που αναπτύχθηκε από τους Borries και Ruska (1938), μπορούσαν να λάβουν εικόνες μεγέθυνσης 20.000 φορές. Σε αυτό το καλούπι η μεγέθυνση του αντικειμενικού πηνίου ήταν 100 και το πηνίο του προβολέα ήταν 200. Η ανάλυση αυτού του μικροσκοπίου ήταν 100 Α.

Τα ηλεκτρονικά μικροσκόπια με ανάλυση 4-1 OÅ ή ακόμα καλύτερη είναι πλέον διαθέσιμα.

3. Μπορεί να επιτευχθεί μεγέθυνση έως και 1.60.000 φορές βλέποντας ενδιάμεσα πηνία μεταξύ του αντικειμενικού πηνίου και του προβολέα του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου.

4. Μερικές από τις βασικές διαφορές (Εικ. 149) μεταξύ ενός μικροσκοπίου φωτός και ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου αναφέρονται στον Πίνακα 13.1.

Μερικές διαφορές μεταξύ του μικροσκοπίου φωτός και του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου:

1. Σε αυτό το μικροσκόπιο χρησιμοποιείται ορατό φως.

2. Η πηγή illumi­nation βρίσκεται στο κάτω μέρος.

3- Για μεγέθυνση σε αυτό το μικροσκόπιο το σύστημα φακών αποτελείται από γυάλινους φακούς,

4. Οι φακοί είναι οφθαλμικοί, αντικειμενικοί και συμπυκνωτικοί.

5. Η εικόνα είτε φαίνεται με το μάτι είτε καταγράφεται σε φωτογραφικό και συγγραφικό φιλμ με κάμερα σε αυτό το μικροσκόπιο.

1. Τα ηλεκτρόνια χρησιμοποιούνται στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο.

2. Η πηγή φωτισμού βρίσκεται στην κορυφή σε αυτό το μικροσκόπιο.

3. Το σύστημα φακών αποτελείται από ηλεκτρομαγνητικά πηνία σε αυτό το μικροσκόπιο.

4. Αυτό το μικροσκόπιο έχει πηνία προβολέα, ένα αντικείμενο και ένα συμπυκνωτή.

5.Η εικόνα σε ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο είτε εγγράφεται σε οθόνη φθορισμού και ντροπαλής είτε καταγράφεται σε φωτογραφικό φιλμ.

Ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο αποτελείται από ένα ηλεκτρικό πιστόλι, στήλη μικροσκοπίου, ηλεκτρομαγνητικά πηνία, μια οθόνη φθορισμού και μερικά άλλα αξεσουάρ που περιγράφονται παρακάτω:

(α) Το όπλο ηλεκτρονίων βρίσκεται στην κορυφή του σώματος του μικροσκοπίου. Είναι η πηγή ηλεκτρονίων. Αποτελείται από ένα νήμα βολφραμίου που περιβάλλεται από μια αρνητικά προκατειλημμένη ασπίδα με ένα άνοιγμα. Η δέσμη ηλεκτρονίων απομακρύνεται μέσω αυτού του ανοίγματος.

(β) Η στήλη ή η κεντρική στήλη του μικροσκοπίου αποτελείται από έναν εκκενωμένο μεταλλικό σωλήνα. Προστατεύει το άτομο που χειρίζεται το μικροσκόπιο από τις ακτίνες Χ που παράγονται όταν τα ηλεκτρόνια χτυπούν στην επιφάνεια του μεταλλικού σωλήνα.

(γ) Τα ηλεκτρομαγνητικά πηνία ή φακοί περιλαμβάνουν πηνία προβολέα, αντικειμενικό φακό και συμπυκνωτή. Σε κάθε πηνίο, τα πηνία του ηλεκτρικού καλωδίου τυλίγονται σε έναν κοίλο μεταλλικό κύλινδρο. Το μαγνητικό πεδίο, που παράγεται με τη διέλευση του ηλεκτρικού ρεύματος μέσω του μαγνητικού πηνίου, λειτουργεί ως μεγεθυντικός φακός.

(δ) Η φθορίζουσα οθόνη χρησιμοποιείται για την παρατήρηση της μεγεθυσμένης εικόνας του αντικειμένου. Παραμένει επικαλυμμένο με μια χημική ουσία η οποία, όταν διεγείρεται, σχηματίζει την εικόνα όπως στην οθόνη της τηλεόρασης.

(ε) Κάποια άλλα βασικά εξαρτήματα του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου περιλαμβάνουν μετασχηματιστές υψηλής τάσης (για την ανάπτυξη ρεύματος υψηλής τάσης για το ηλεκτρονιακό πιστόλι και ηλεκτρομαγνητικά πηνία), αντλίες κενού (για τη διατήρηση υψηλού κενού μέσα στη στήλη του μικροσκοπίου), ένα σύστημα ψύξης νερού (για πρόληψη από υπερθέρμανση διαφόρων εξαρτημάτων), μια αντλία κυκλοφορίας, μια εγκατάσταση ψύξης και επίσης’ ένα σύστημα φίλτρων.

Όλα αυτά τα μέρη απαιτούν περίπλοκες ρυθμίσεις και συμβάλλουν στο τεράστιο μέγεθος του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου.

6. Ο σχηματισμός εικόνας σε αυτό το μικροσκόπιο συμβαίνει με τη σκέδαση ηλεκτρονίων. Τα ηλεκτρόνια χτυπούν τους ατομικούς πυρήνες και διασπείρονται. Αυτά τα διασκορπισμένα ηλεκτρόνια σχηματίζουν την εικόνα ηλεκτρονίων. Με την προβολή σε μια φθορίζουσα οθόνη ή φωτογραφικό φιλμ, αυτή η εικόνα ηλεκτρονίων μετατρέπεται σε ορατή εικόνα του αντικειμένου.

7. Η δέσμη ηλεκτρονίων σε αυτό το μικροσκόπιο γίνεται με την επιτάχυνση των ηλεκτρονίων μέσω μιας διαφοράς δυναμικού από 1-1500 kV σε ένα όπλο ηλεκτρονίων.

8. Μόνο τα αποξηραμένα δείγματα μελετώνται με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο. Τα ζωντανά κύτταρα δεν μπορούν να μελετηθούν με αυτό το μικροσκόπιο επειδή διαθέτουν νερό που προκαλεί μεγάλη σκέδαση ηλεκτρονίων.

9. Εξαιρετικά λεπτές τομές (πάχος 10-50 nm), οι οποίες είναι περισσότερες από 200 φορές λεπτότερες από αυτές που χρησιμοποιούνται συνήθως για μικροσκοπία φωτός, κόβονται για ηλεκτρονική μικροσκοπία. Αυτά κόβονται με τη βοήθεια διαμαντιών ή γυάλινων μαχαιριών ενός υπερμικροτώματος.

Τύπος # 10. Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης ή TEM:

1. Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης ή TEM (Εικ. 8) είναι μια μορφή ηλεκτρονικού μικροσκοπίου στο οποίο τα ηλεκτρόνια επιτρέπεται να μεταδοθούν μέσω των αντικειμένων.

2. Το προς μελέτη δείγμα φωτίζεται ομοιόμορφα από μια ευρεία δέσμη ηλεκτρονίων στα 40-100 kV και η εικόνα σχηματίζεται απευθείας εστιάζοντας εκείνα τα ηλεκτρόνια που περνούν περισσότερο ή λιγότερο αδιάσπαρτα μέσα από το δείγμα είτε σε φθορίζουσα οθόνη είτε σε φωτογραφικό φιλμ.

3. Αυτό το μικροσκόπιο έχει λεπτή ανάλυση 0,3 nm ή μικρότερη, αλλά συνήθως δεν είναι κατάλληλο για ζωντανά δείγματα.

Τύπος # 11. Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης ή SEM:

1. Αυτή είναι επίσης μια μορφή ηλεκτρονικού μικροσκοπίου στο οποίο δημιουργείται μια εξαιρετικά λεπτή δέσμη ηλεκτρονίων στα 3-30 kV για τη σάρωση μιας επιλεγμένης ή συγκεκριμένης περιοχής του δείγματος. Αυτός είναι στην πραγματικότητα ένας συνδυασμός της τεχνολογίας της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας και της ηλεκτρονικής τηλεόρασης.

2. Το προς εξέταση δείγμα είναι συνήθως ένα συμπαγές αντικείμενο. Τα δευτερεύοντα ηλεκτρόνια, τα οποία εκπέμπονται από ή κοντά στην επιφάνεια, συλλέγονται και αναλύονται. Μετά την ανάλυση, σχηματίζουν ένα σήμα που διαμορφώνει τη δέσμη ενός καθοδικού σωλήνα (Εικ. 151) που σαρώνεται συγχρονικά με μια δευτερεύουσα δέσμη.

3. Οι εικόνες, που σχηματίζονται σε αυτό το μικροσκόπιο, μοιάζουν με αυτές που φαίνονται σε φακό χεριού. Μπορούν να μεγεθυνθούν περίπου 100.000 φορές.

4. Αυτό το μικροσκόπιο είναι εξαιρετικά χρήσιμο για τη μελέτη επιφανειακών δομών παχιών δειγμάτων, κυττάρων, ιστών και μεμβρανών.

5. Επειδή τα ηλεκτρόνια σε αυτό το μικροσκόπιο σχηματίζουν την εικόνα εκπέμποντας από την επιφάνεια του δείγματος, η εικόνα παρέχει μια τρισδιάστατη εμφάνιση. Αυτή η τρισδιάστατη εικόνα σχηματίζεται από δευτερεύοντα ηλεκτρόνια τα οποία πρώτα συλλέγονται, ενισχύονται και στη συνέχεια χρησιμοποιούνται για το σχηματισμό εικόνας στην οθόνη φωσφόρου ενός καθοδικού σωλήνα ακτίνων.

6. Σε αυτό το μικροσκόπιο υπάρχουν τουλάχιστον δύο καθοδικοί σωλήνες ακτίνων, εκ των οποίων ο ένας χρησιμοποιείται για οπτική παρατήρηση του δείγματος και ο άλλος για φωτογράφηση.

Τύπος # 12. Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο ή STEM μετάδοσης σάρωσης:

1. Στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης σάρωσης ή STEM, το δείγμα σαρώνεται με τον ίδιο τρόπο όπως στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης ή στο SEM, αλλά τα μεταδιδόμενα ηλεκτρόνια συλλέγονται και χρησιμοποιούνται για το σχηματισμό εικόνας στην οθόνη.

2. Το κύριο πλεονέκτημα αυτού του ηλεκτρονικού μικροσκοπίου είναι ότι είναι εξοπλισμένο με συστήματα ανιχνευτών. Λόγω αυτής της δυνατότητας, μπορεί να ανιχνεύσει χωριστά τα σκεδαζόμενα ηλεκτρόνια, τα μη σκεδαζόμενα ηλεκτρόνια, καθώς και εκείνα τα ηλεκτρόνια που βρίσκονται εκεί ως αποτέλεσμα του συνδυασμού των σκεδαζόμενων και μη σκεδαζόμενων ηλεκτρονίων.

Τύπος # 13. Μικροσκόπιο Πόλωσης:

1. Αυτό είναι ένα ειδικό είδος μικροσκοπίου φωτός εξοπλισμένο με πολωτή και αναλυτή.

2. Το επίπεδο πολωμένο φως χρησιμοποιείται σε αυτό το μικροσκόπιο για τη μελέτη της παρουσίας κατά προτίμηση προσανατολισμένων συστατικών, του σχήματός τους, της κατεύθυνσης του προσανατολισμού τους και του δείκτη διάθλασής τους στα κύτταρα και τους ιστούς.

3. Η αρχή αυτού του μικροσκοπίου βασίζεται στη συμπεριφορά ορισμένων συστατικών του κυττάρου όταν παρατηρούνται κάτω από πολωμένο φως.

4. Ο πολωτής και ο αναλυτής, τα δύο κύρια συστατικά αυτού του μικροσκοπίου, είναι κατασκευασμένα είτε από πρίσμα νικόλ είτε από δίσκο polaroid. Πάνω από τον πολωτή είναι τοποθετημένος ο συμπυκνωτής. Ο αναλυτής βρίσκεται πάνω από τον στόχο. Ένας αντισταθμιστής ή πλάκα γύψου εισάγεται επίσης μεταξύ του πολωτή και του αναλυτή.

5. Αυτό το μικροσκόπιο χρησιμοποιείται επίσης τόσο για ποσοτικές όσο και για ποιοτικές μελέτες σε διάφορους βιολογικούς κλάδους συμπεριλαμβανομένης της κυτταρολογίας, της ανατομίας, της ιστολογίας και της παθολογίας.


2.3 Όργανα μικροσκοπίας

Οι πρώτοι πρωτοπόροι της μικροσκοπίας άνοιξαν ένα παράθυρο στον αόρατο κόσμο των μικροοργανισμών. Αλλά η μικροσκοπία συνέχισε να προοδεύει στους αιώνες που ακολούθησαν. Το 1830, ο Joseph Jackson Lister δημιούργησε ένα ουσιαστικά σύγχρονο μικροσκόπιο φωτός. Ο 20ός αιώνας είδε την ανάπτυξη μικροσκοπίων που αξιοποιούσαν το μη ορατό φως, όπως το μικροσκόπιο φθορισμού, το οποίο χρησιμοποιεί μια πηγή υπεριώδους φωτός και το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, το οποίο χρησιμοποιεί δέσμες ηλεκτρονίων μικρού μήκους κύματος. Αυτές οι εξελίξεις οδήγησαν σε σημαντικές βελτιώσεις στη μεγέθυνση, την ανάλυση και την αντίθεση. Συγκριτικά, τα σχετικά υποτυπώδη μικροσκόπια του van Leeuwenhoek και των συγχρόνων του ήταν πολύ λιγότερο ισχυρά ακόμη και από τα πιο βασικά μικροσκόπια που χρησιμοποιούνται σήμερα. Σε αυτή την ενότητα, θα ερευνήσουμε το ευρύ φάσμα της σύγχρονης μικροσκοπικής τεχνολογίας και κοινών εφαρμογών για κάθε τύπο μικροσκοπίου.

Μικροσκοπία φωτός

Πολλοί τύποι μικροσκοπίων εμπίπτουν στην κατηγορία των μικροσκοπίων φωτός, τα οποία χρησιμοποιούν το φως για την οπτικοποίηση εικόνων. Παραδείγματα μικροσκοπίων φωτός περιλαμβάνουν μικροσκόπια φωτεινού πεδίου, μικροσκόπια σκοτεινού πεδίου, μικροσκόπια αντίθεσης φάσης, μικροσκόπια αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής, μικροσκόπια φθορισμού, μικροσκόπια λέιζερ ομοεστιακής σάρωσης και μικροσκόπια δύο φωτονίων. Αυτοί οι διάφοροι τύποι μικροσκοπίων φωτός μπορούν να χρησιμοποιηθούν για να αλληλοσυμπληρώνονται στη διάγνωση και την έρευνα.

Μικροσκόπια Brightfield

Το μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου, ίσως ο πιο συχνά χρησιμοποιούμενος τύπος μικροσκοπίου, είναι ένα σύνθετο μικροσκόπιο με δύο ή περισσότερους φακούς που παράγουν μια σκοτεινή εικόνα σε φωτεινό φόντο. Μερικά μικροσκόπια φωτεινού πεδίου είναι μονόφθαλμα (με ένα μόνο προσοφθάλμιο), αν και τα περισσότερα νεότερα μικροσκόπια φωτεινού πεδίου είναι διόφθαλμα (με δύο προσοφθάλμιους φακούς), όπως αυτό που φαίνεται στο Σχήμα 2.12 και στις δύο περιπτώσεις, κάθε προσοφθάλμιο φακό περιέχει έναν φακό που ονομάζεται οφθαλμικός φακός . Οι οφθαλμικοί φακοί συνήθως μεγεθύνουν τις εικόνες 10 φορές (10⨯). Στο άλλο άκρο του σωλήνα του σώματος υπάρχει ένα σετ αντικειμενικών φακών σε ένα περιστρεφόμενο ακροφύσιο. Η μεγέθυνση αυτών των αντικειμενικών φακών κυμαίνεται τυπικά από 4⨯ έως 100⨯, με τη μεγέθυνση για κάθε φακό να ορίζεται στο μεταλλικό περίβλημα του φακού. Ο οφθαλμικός και ο αντικειμενικός φακός συνεργάζονται για να δημιουργήσουν μια μεγεθυμένη εικόνα. Η συνολική μεγέθυνση είναι το γινόμενο της οφθαλμικής μεγέθυνσης επί της αντικειμενικής μεγέθυνσης:

Για παράδειγμα, εάν επιλεγεί ένας αντικειμενικός φακός 40⨯ και ο οφθαλμικός φακός είναι 10⨯, η συνολική μεγέθυνση θα είναι

Το αντικείμενο που προβάλλεται ονομάζεται δείγμα. Το δείγμα τοποθετείται σε μια γυάλινη πλάκα, η οποία στη συνέχεια στερεώνεται στη θέση της στη σκηνή (μια πλατφόρμα) του μικροσκοπίου. Μόλις ασφαλιστεί η αντικειμενοφόρος πλάκα, το δείγμα στη διαφάνεια τοποθετείται πάνω από το φως χρησιμοποιώντας τα μηχανικά πόμολα βαθμίδας x-y. Αυτά τα πόμολα μετακινούν τη διαφάνεια στην επιφάνεια της σκηνής, αλλά δεν ανεβάζουν ή χαμηλώνουν τη σκηνή. Μόλις το δείγμα κεντραριστεί πάνω από το φως, η θέση της σκηνής μπορεί να ανυψωθεί ή να χαμηλώσει για να εστιάσετε την εικόνα. Το κουμπί χονδροειδούς εστίασης χρησιμοποιείται για κινήσεις μεγάλης κλίμακας με αντικειμενικούς φακούς 4⨯ και 10⨯, ενώ το κουμπί λεπτής εστίασης χρησιμοποιείται για κινήσεις μικρής κλίμακας, ειδικά με αντικειμενικούς φακούς 40⨯ ή 100⨯.

Όταν οι εικόνες μεγεθύνονται, γίνονται πιο αμυδρά επειδή υπάρχει λιγότερο φως ανά μονάδα επιφάνειας εικόνας. Ως εκ τούτου, οι εικόνες υψηλής μεγέθυνσης που παράγονται από μικροσκόπια απαιτούν έντονο φωτισμό. Σε ένα μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου, αυτό το φως παρέχεται από έναν φωτιστή, ο οποίος είναι συνήθως ένας λαμπτήρας υψηλής έντασης κάτω από τη σκηνή. Το φως από τη συσκευή ακτινοβόλησης περνά μέσα από τον φακό συμπυκνωτή (που βρίσκεται κάτω από τη σκηνή), ο οποίος εστιάζει όλες τις ακτίνες φωτός στο δείγμα για να μεγιστοποιήσει τον φωτισμό. Η θέση του συμπυκνωτή μπορεί να βελτιστοποιηθεί χρησιμοποιώντας το προσαρτημένο κουμπί εστίασης του συμπυκνωτή, μόλις επιτευχθεί η βέλτιστη απόσταση, ο συμπυκνωτής δεν πρέπει να μετακινηθεί για να ρυθμίσετε τη φωτεινότητα. Εάν χρειάζονται λιγότερα από τα μέγιστα επίπεδα φωτός, η ποσότητα φωτός που χτυπά το δείγμα μπορεί εύκολα να ρυθμιστεί ανοίγοντας ή κλείνοντας ένα διάφραγμα μεταξύ του συμπυκνωτή και του δείγματος. Σε ορισμένες περιπτώσεις, η φωτεινότητα μπορεί επίσης να ρυθμιστεί χρησιμοποιώντας τον ρεοστάτη, έναν διακόπτη dimmer που ελέγχει την ένταση του φωτιστικού.

Ένα μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου δημιουργεί μια εικόνα κατευθύνοντας το φως από το φωτιστικό στο δείγμα, αυτό το φως μεταδίδεται διαφορικά, απορροφάται, ανακλάται ή διαθλάται από διαφορετικές δομές. Διαφορετικά χρώματα μπορεί να συμπεριφέρονται διαφορετικά καθώς αλληλεπιδρούν με χρωμοφόρα (χρωστικές ουσίες που απορροφούν και αντανακλούν συγκεκριμένα μήκη κύματος φωτός) σε μέρη του δείγματος. Συχνά, τα χρωμοφόρα προστίθενται τεχνητά στο δείγμα χρησιμοποιώντας λεκέδες, οι οποίες χρησιμεύουν για την αύξηση της αντίθεσης και της ανάλυσης. Γενικά, οι δομές στο δείγμα θα φαίνονται πιο σκούρες, σε διάφορους βαθμούς, από το φωτεινό φόντο, δημιουργώντας εξαιρετικά ευκρινείς εικόνες σε μεγεθύνσεις έως περίπου 1000⨯. Περαιτέρω μεγέθυνση θα δημιουργούσε μια μεγαλύτερη εικόνα, αλλά χωρίς αυξημένη ανάλυση. Αυτό μας επιτρέπει να βλέπουμε αντικείμενα τόσο μικρά όσο τα βακτήρια, τα οποία είναι ορατά σε περίπου 400⨯ περίπου, αλλά όχι μικρότερα αντικείμενα όπως οι ιοί.

Σε πολύ υψηλές μεγεθύνσεις, η ανάλυση μπορεί να διακυβευτεί όταν το φως διέρχεται από τη μικρή ποσότητα αέρα μεταξύ του δείγματος και του φακού. Αυτό οφείλεται στη μεγάλη διαφορά μεταξύ των δεικτών διάθλασης του αέρα και του γυαλιού, ο αέρας διασκορπίζει τις ακτίνες φωτός πριν μπορέσουν να εστιαστούν από τον φακό. Για να λυθεί αυτό το πρόβλημα, μια σταγόνα λαδιού μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να γεμίσει το χώρο μεταξύ του δείγματος και ενός φακού εμβάπτισης λαδιού, ενός ειδικού φακού που έχει σχεδιαστεί για χρήση με λάδια εμβάπτισης. Δεδομένου ότι το λάδι έχει δείκτη διάθλασης πολύ παρόμοιο με αυτόν του γυαλιού, αυξάνει τη μέγιστη γωνία στην οποία το φως που αφήνει το δείγμα μπορεί να χτυπήσει τον φακό. Αυτό αυξάνει το φως που συλλέγεται και, συνεπώς, την ανάλυση της εικόνας (Εικόνα 2.13). Μια ποικιλία λαδιών μπορεί να χρησιμοποιηθεί για διαφορετικούς τύπους φωτός.

Micro Συνδέσεις

Συντήρηση μικροσκοπίου: Βέλτιστες πρακτικές

Ακόμη και ένα πολύ ισχυρό μικροσκόπιο δεν μπορεί να δώσει εικόνες υψηλής ανάλυσης εάν δεν καθαριστεί και συντηρηθεί σωστά. Δεδομένου ότι οι φακοί έχουν σχεδιαστεί και κατασκευαστεί προσεκτικά για να διαθλούν το φως με υψηλό βαθμό ακρίβειας, ακόμη και ένας ελαφρώς βρώμικος ή γρατσουνισμένος φακός θα διαθλάσει το φως με ακούσιους τρόπους, υποβαθμίζοντας την εικόνα του δείγματος. Επιπλέον, τα μικροσκόπια είναι αρκετά ευαίσθητα όργανα και πρέπει να δίνεται μεγάλη προσοχή για να αποφευχθεί η καταστροφή εξαρτημάτων και επιφανειών. Μεταξύ άλλων, η σωστή φροντίδα του μικροσκοπίου περιλαμβάνει τα ακόλουθα:

  • καθαρίζοντας τους φακούς με χαρτί φακών
  • να μην επιτρέπεται στους φακούς να έρχονται σε επαφή με τη διαφάνεια (π.χ. αλλάζοντας γρήγορα την εστίαση)
  • προστατεύοντας τον λαμπτήρα (αν υπάρχει) από θραύση
  • μη ωθώντας έναν στόχο σε μια διαφάνεια
  • δεν χρησιμοποιείτε το κουμπί χονδρικής εστίασης όταν χρησιμοποιείτε αντικειμενικούς φακούς 40⨯ ή μεγαλύτερους
  • χρησιμοποιώντας μόνο λάδι εμβάπτισης με ειδικό αντικειμενικό στόχο λαδιού, συνήθως τον αντικειμενικό φακό 100⨯
  • λάδι καθαρισμού από τους φακούς εμβάπτισης μετά τη χρήση του μικροσκοπίου
  • καθαρίζοντας οποιοδήποτε λάδι μεταφέρθηκε κατά λάθος από άλλους φακούς
  • καλύπτοντας το μικροσκόπιο ή τοποθετώντας το σε ντουλάπι όταν δεν χρησιμοποιείται

Σύνδεσμος στη Μάθηση

Επισκεφτείτε την ηλεκτρονική πηγή που συνδέεται παρακάτω για προσομοιώσεις και επιδείξεις που περιλαμβάνουν τη χρήση μικροσκοπίων. Λάβετε υπόψη ότι η εκτέλεση συγκεκριμένων τεχνικών και διαδικασιών μπορεί να διαφέρει ανάλογα με το συγκεκριμένο όργανο που χρησιμοποιείτε. Επομένως, είναι σημαντικό να μαθαίνετε και να εξασκείτε με ένα πραγματικό μικροσκόπιο σε εργαστηριακό περιβάλλον υπό την επίβλεψη ειδικού.

Μικροσκοπία Darkfield

Ένα μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου είναι ένα μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου που έχει μια μικρή αλλά σημαντική τροποποίηση στον συμπυκνωτή. Ένας μικρός, αδιαφανής δίσκος (διάμετρος περίπου 1 cm) τοποθετείται μεταξύ του φωτιστικού και του φακού του συμπυκνωτή. Αυτή η αδιαφανής αναστολή φωτός, όπως ονομάζεται ο δίσκος, εμποδίζει το μεγαλύτερο μέρος του φωτός από το φωτιστικό καθώς περνά μέσα από τον συμπυκνωτή στο δρόμο του προς τον αντικειμενικό φακό, παράγοντας έναν κοίλο κώνο φωτός που εστιάζεται στο δείγμα. Το μόνο φως που φτάνει στον στόχο είναι το φως που έχει διαθλαστεί ή ανακλαστεί από δομές στο δείγμα. Η εικόνα που προκύπτει συνήθως δείχνει φωτεινά αντικείμενα σε σκούρο φόντο (Εικόνα 2.14).

Η μικροσκοπία σκοτεινού πεδίου μπορεί συχνά να δημιουργήσει εικόνες δειγμάτων υψηλής αντίθεσης, υψηλής ανάλυσης χωρίς τη χρήση λεκέδων, κάτι που είναι ιδιαίτερα χρήσιμο για την προβολή ζωντανών δειγμάτων που μπορεί να θανατωθούν ή να διακυβευτούν με άλλο τρόπο από τους λεκέδες. Για παράδειγμα, οι λεπτές σπειροχαίτες αρέσουν Treponema pallidum , ο αιτιολογικός παράγοντας της σύφιλης, μπορεί να παρατηρηθεί καλύτερα χρησιμοποιώντας ένα μικροσκόπιο σκοτεινού πεδίου (Εικόνα 2.15).

Ελέγξτε την κατανόησή σας

Κλινική εστίαση

Μέρος 2ο

Οι λοιμώξεις των πληγών όπως η Cindy's μπορούν να προκληθούν από πολλούς διαφορετικούς τύπους βακτηρίων, μερικά από τα οποία μπορούν να εξαπλωθούν γρήγορα με σοβαρές επιπλοκές. Ο εντοπισμός της συγκεκριμένης αιτίας είναι πολύ σημαντικός για την επιλογή ενός φαρμάκου που μπορεί να σκοτώσει ή να σταματήσει την ανάπτυξη των βακτηρίων.

Αφού τηλεφώνησε σε έναν τοπικό γιατρό για την περίπτωση της Σίντι, η νοσοκόμα του στρατοπέδου στέλνει το δείγμα από το τραύμα στο πλησιέστερο ιατρικό εργαστήριο. Δυστυχώς, καθώς ο καταυλισμός βρίσκεται σε απομακρυσμένη περιοχή, το πλησιέστερο εργαστήριο είναι μικρό και ανεπαρκώς εξοπλισμένο. Ένα πιο σύγχρονο εργαστήριο πιθανότατα θα χρησιμοποιούσε άλλες μεθόδους για την καλλιέργεια, την ανάπτυξη και την αναγνώριση των βακτηρίων, αλλά σε αυτήν την περίπτωση, ο τεχνικός αποφασίζει να φτιάξει μια υγρή βάση από το δείγμα και να το δει κάτω από ένα μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου. Σε μια υγρή βάση, μια μικρή σταγόνα νερού προστίθεται στη διαφάνεια και μια ολίσθηση κάλυψης τοποθετείται πάνω από το δείγμα για να το κρατήσει στη θέση του πριν τοποθετηθεί κάτω από τον αντικειμενικό φακό.

Κάτω από το μικροσκόπιο φωτεινού πεδίου, ο τεχνικός μετά βίας μπορεί να δει τα κύτταρα των βακτηρίων επειδή είναι σχεδόν διαφανή στο φωτεινό φόντο. Για να αυξήσει την αντίθεση, ο τεχνικός εισάγει ένα αδιαφανές φως στοπ πάνω από το φωτιστικό. Η προκύπτουσα εικόνα σκοτεινού πεδίου δείχνει ξεκάθαρα ότι τα κύτταρα των βακτηρίων είναι σφαιρικά και ομαδοποιημένα σε συστάδες, όπως τα σταφύλια.

  • Γιατί είναι σημαντικό να αναγνωρίζουμε το σχήμα και τα πρότυπα ανάπτυξης των κυττάρων σε ένα δείγμα;
  • Ποιοι άλλοι τύποι μικροσκοπίας θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν αποτελεσματικά για την προβολή αυτού του δείγματος;

Μεταβείτε στο επόμενο πλαίσιο Κλινικής εστίασης. Επιστρέψτε στο προηγούμενο πλαίσιο Κλινικής εστίασης.

Μικροσκόπια αντίθεσης φάσης

Τα μικροσκόπια αντίθεσης φάσης χρησιμοποιούν διάθλαση και παρεμβολές που προκαλούνται από δομές σε ένα δείγμα για να δημιουργήσουν εικόνες υψηλής αντίθεσης, υψηλής ανάλυσης χωρίς χρώση. Είναι ο παλαιότερος και απλούστερος τύπος μικροσκοπίου που δημιουργεί μια εικόνα αλλάζοντας τα μήκη κύματος των ακτίνων φωτός που διέρχονται από το δείγμα. Για τη δημιουργία διαδρομών αλλαγμένου μήκους κύματος, χρησιμοποιείται ένα δακτυλιοειδές στοπ στον συμπυκνωτή. Το δακτυλιοειδές στοπ παράγει έναν κοίλο κώνο φωτός που εστιάζεται στο δείγμα πριν φτάσει στον αντικειμενικό φακό. Ο αντικειμενικός στόχος περιέχει μια πλάκα φάσης που περιέχει έναν δακτύλιο φάσης. Ως αποτέλεσμα, το φως που ταξιδεύει απευθείας από το φωτιστικό περνά μέσα από τον δακτύλιο φάσης ενώ το φως που διαθλάται ή ανακλάται από το δείγμα περνά μέσα από την πλάκα. Αυτό αναγκάζει τα κύματα που ταξιδεύουν μέσω του δακτυλίου να είναι περίπου το μισό του μήκους κύματος εκτός φάσης με αυτά που διέρχονται από την πλάκα. Επειδή τα κύματα έχουν κορυφές και κοιλότητες, μπορούν να αθροίζονται (αν βρίσκονται σε φάση μαζί) ή να ακυρώνουν το ένα το άλλο (αν είναι εκτός φάσης). Όταν τα μήκη κύματος είναι εκτός φάσης, οι κοιλότητες κυμάτων θα ακυρώσουν τις κορυφές κύματος, κάτι που ονομάζεται καταστροφική παρεμβολή. Οι δομές που διαθλούν το φως στη συνέχεια εμφανίζονται σκοτεινές σε ένα φωτεινό φόντο μόνο μη διαθλασμένου φωτός. Γενικότερα, οι δομές που διαφέρουν σε χαρακτηριστικά όπως ο δείκτης διάθλασης θα διαφέρουν σε επίπεδα σκοταδισμού (Εικόνα 2.16).

Επειδή αυξάνει την αντίθεση χωρίς να απαιτεί λεκέδες, η μικροσκοπία αντίθεσης φάσης χρησιμοποιείται συχνά για την παρατήρηση ζωντανών δειγμάτων. Ορισμένες δομές, όπως οργανίδια σε ευκαρυωτικά κύτταρα και ενδοσπόρια σε προκαρυωτικά κύτταρα, οραματίζονται ιδιαίτερα καλά με μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (Εικόνα 2.17).

Μικροσκόπια αντίθεσης διαφορικών παρεμβολών

Τα μικροσκόπια αντίθεσης διαφορικής παρεμβολής (DIC) (γνωστά και ως οπτικά Nomarski) είναι παρόμοια με τα μικροσκόπια αντίθεσης φάσης στο ότι χρησιμοποιούν μοτίβα παρεμβολής για να ενισχύσουν την αντίθεση μεταξύ διαφορετικών χαρακτηριστικών ενός δείγματος. Σε ένα μικροσκόπιο DIC, δημιουργούνται δύο δέσμες φωτός στις οποίες η κατεύθυνση της κίνησης του κύματος (πόλωση) διαφέρει. Μόλις οι δέσμες περάσουν είτε από το χώρο του δείγματος είτε από το χώρο χωρίς δείγμα, ανασυνδυάζονται και τα αποτελέσματα των δειγμάτων προκαλούν διαφορές στα μοτίβα παρεμβολής που δημιουργούνται από το συνδυασμό των δοκών. Αυτό οδηγεί σε εικόνες υψηλής αντίθεσης ζωντανών οργανισμών με τρισδιάστατη εμφάνιση. Αυτά τα μικροσκόπια είναι ιδιαίτερα χρήσιμα για τη διάκριση δομών εντός ζωντανών, μη χρωματισμένων δειγμάτων. (Εικόνα 2.18)

Ελέγξτε την κατανόησή σας

Μικροσκόπια φθορισμού

Ένα μικροσκόπιο φθορισμού χρησιμοποιεί φθορίζοντα χρωμοφόρα που ονομάζονται φθορόχρωμα, τα οποία είναι ικανά να απορροφούν ενέργεια από μια πηγή φωτός και στη συνέχεια να εκπέμπουν αυτήν την ενέργεια ως ορατό φως. Τα φθοριόχρωμα περιλαμβάνουν φυσικά φθορίζουσες ουσίες (όπως χλωροφύλλες) καθώς και φθορίζουσες κηλίδες που προστίθενται στο δείγμα για να δημιουργήσουν αντίθεση. Οι βαφές όπως το κόκκινο του Τέξας και το FITC είναι παραδείγματα φθοριοχρωμάτων. Άλλα παραδείγματα περιλαμβάνουν τις βαφές νουκλεϊκού οξέος 4',6'-διαμιδινο-2-φαινυλινδόλη (DAPI) και πορτοκαλί ακριδίνης.

Το μικροσκόπιο μεταδίδει ένα φως διέγερσης, γενικά μια μορφή EMR με μικρό μήκος κύματος, όπως υπεριώδες ή μπλε φως, προς το δείγμα τα χρωμοφόρα απορροφούν το φως διέγερσης και εκπέμπουν ορατό φως με μεγαλύτερα μήκη κύματος.Το φως διέγερσης στη συνέχεια φιλτράρεται (εν μέρει επειδή το υπεριώδες φως είναι επιβλαβές για τα μάτια) έτσι ώστε μόνο το ορατό φως να περνά μέσα από τον οφθαλμικό φακό. Αυτό δημιουργεί μια εικόνα του δείγματος σε φωτεινά χρώματα σε σκούρο φόντο.

Τα μικροσκόπια φθορισμού είναι ιδιαίτερα χρήσιμα στην κλινική μικροβιολογία. Μπορούν να χρησιμοποιηθούν για τον εντοπισμό παθογόνων, για την εύρεση συγκεκριμένων ειδών σε ένα περιβάλλον ή για την εύρεση των θέσεων συγκεκριμένων μορίων και δομών μέσα σε ένα κύτταρο. Έχουν επίσης αναπτυχθεί προσεγγίσεις για τη διάκριση των ζωντανών από τα νεκρά κύτταρα χρησιμοποιώντας μικροσκοπία φθορισμού με βάση το εάν αυτά προσλαμβάνουν συγκεκριμένα φθοροχρωματικά. Μερικές φορές, πολλαπλά φθοροχρωμικά χρησιμοποιούνται στο ίδιο δείγμα για να δείξουν διαφορετικές δομές ή χαρακτηριστικά.

Μία από τις πιο σημαντικές εφαρμογές της μικροσκοπίας φθορισμού είναι μια τεχνική που ονομάζεται ανοσοφθορισμός, η οποία χρησιμοποιείται για τον εντοπισμό ορισμένων μικροβίων που προκαλούν ασθένειες παρατηρώντας εάν τα αντισώματα συνδέονται με αυτά. (Τα αντισώματα είναι πρωτεϊνικά μόρια που παράγονται από το ανοσοποιητικό σύστημα που προσκολλώνται σε συγκεκριμένα παθογόνα για να τα σκοτώσουν ή να τα αναστέλλουν.) Υπάρχουν δύο προσεγγίσεις σε αυτή την τεχνική: άμεσος προσδιορισμός ανοσοφθορισμού (DFA) και έμμεσος προσδιορισμός ανοσοφθορισμού (IFA). Στο DFA, ειδικά αντισώματα (π.χ. αυτά που στοχεύουν τον ιό της λύσσας) χρωματίζονται με φθορόχρωμα. Εάν το δείγμα περιέχει το στοχευόμενο παθογόνο, μπορεί κανείς να παρατηρήσει τα αντισώματα που συνδέονται με το παθογόνο κάτω από το μικροσκόπιο φθορισμού. Αυτό ονομάζεται πρωτογενής χρώση αντισώματος επειδή τα χρωματισμένα αντισώματα προσκολλώνται απευθείας στο παθογόνο.

Στην IFA, τα δευτερεύοντα αντισώματα χρωματίζονται με ένα φθοριοχρωματικό αντί για πρωτογενή αντισώματα. Τα δευτερογενή αντισώματα δεν συνδέονται απευθείας με το παθογόνο, αλλά συνδέονται με τα πρωτογενή αντισώματα. Όταν τα μη χρωματισμένα πρωτογενή αντισώματα δεσμεύονται στο παθογόνο, τα φθορίζοντα δευτερεύοντα αντισώματα μπορούν να παρατηρηθούν ότι συνδέονται με τα πρωτεύοντα αντισώματα. Έτσι, τα δευτερεύοντα αντισώματα συνδέονται έμμεσα με το παθογόνο. Δεδομένου ότι πολλά δευτερεύοντα αντισώματα μπορούν συχνά να προσκολληθούν σε ένα πρωτεύον αντίσωμα, το IFA αυξάνει τον αριθμό των αντισωμάτων φθορισμού που συνδέονται με το δείγμα, καθιστώντας ευκολότερη την οπτικοποίηση των χαρακτηριστικών στο δείγμα (Εικόνα 2.19).

Ελέγξτε την κατανόησή σας

Συνεστιακά μικροσκόπια

Ενώ άλλες μορφές μικροσκοπίας φωτός δημιουργούν μια εικόνα που εστιάζεται στο μέγιστο σε μία μόνο απόσταση από τον παρατηρητή (το βάθος ή το επίπεδο z), ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο χρησιμοποιεί ένα λέιζερ για τη σάρωση πολλαπλών επιπέδων z διαδοχικά. Αυτό παράγει πολλές δισδιάστατες εικόνες υψηλής ανάλυσης σε διάφορα βάθη, οι οποίες μπορούν να κατασκευαστούν σε τρισδιάστατη εικόνα από έναν υπολογιστή. Όπως και με τα μικροσκόπια φθορισμού, οι φθορίζουσες κηλίδες χρησιμοποιούνται γενικά για την αύξηση της αντίθεσης και της ανάλυσης. Η ευκρίνεια της εικόνας ενισχύεται περαιτέρω από ένα στενό διάφραγμα που εξαλείφει κάθε φως που δεν είναι από το επίπεδο z. Τα ομοεστιακά μικροσκόπια είναι επομένως πολύ χρήσιμα για την εξέταση παχύρρευστων δειγμάτων όπως τα βιοφίλμ, τα οποία μπορούν να εξεταστούν ζωντανά και μη στερεωμένα (Εικόνα 2.20).

Σύνδεσμος στη Μάθηση

Εξερευνήστε μια περιστρεφόμενη τρισδιάστατη άποψη ενός βιοφίλμ όπως παρατηρείται κάτω από ένα ομοεστιακό μικροσκόπιο. Αφού πλοηγηθείτε στην ιστοσελίδα, κάντε κλικ στο κουμπί «αναπαραγωγή» για να ξεκινήσει το βίντεο.

Μικροσκόπια δύο φωτονίων

Ενώ τα αρχικά μικροσκόπια φθορισμού και ομοεστιακά μικροσκόπια επέτρεπαν καλύτερη απεικόνιση των μοναδικών χαρακτηριστικών στα δείγματα, εξακολουθούσαν να υπάρχουν προβλήματα που εμπόδιζαν τη βέλτιστη οπτικοποίηση. Η αποτελεσματική ευαισθησία της μικροσκοπίας φθορισμού κατά την προβολή παχύρρευστων δειγμάτων περιοριζόταν γενικά από τη λάμψη εκτός εστίασης, η οποία είχε ως αποτέλεσμα κακή ανάλυση. Αυτός ο περιορισμός μειώθηκε σημαντικά στο ομοεστιακό μικροσκόπιο μέσω της χρήσης μιας ομοεστιακής οπής για την απόρριψη του φθορισμού φόντου εκτός εστίασης με λεπτές (<1 μm), μη θολά οπτικά τμήματα. Ωστόσο, ακόμη και τα ομοεστιακά μικροσκόπια δεν είχαν την απαιτούμενη ανάλυση για την προβολή δειγμάτων παχύ ιστού. Αυτά τα προβλήματα επιλύθηκαν με την ανάπτυξη του μικροσκοπίου δύο φωτονίων, το οποίο χρησιμοποιεί μια τεχνική σάρωσης, φθοριόχρωμα και φως μεγάλου μήκους κύματος (όπως το υπέρυθρο) για την οπτικοποίηση δειγμάτων. Η χαμηλή ενέργεια που σχετίζεται με το φως μεγάλου μήκους κύματος σημαίνει ότι δύο φωτόνια πρέπει να προσκρούσουν σε μια τοποθεσία ταυτόχρονα για να διεγείρουν το φθόριο. Η χαμηλή ενέργεια του φωτός διέγερσης είναι λιγότερο επιζήμια για τα κύτταρα και το μεγάλο μήκος κύματος του φωτός διέγερσης διεισδύει πιο εύκολα βαθιά σε παχιά δείγματα. Αυτό καθιστά το μικροσκόπιο δύο φωτονίων χρήσιμο για την εξέταση των ζωντανών κυττάρων εντός άθικτων ιστών—φέτες εγκεφάλου, έμβρυα, ολόκληρα όργανα, ακόμη και ολόκληρα ζώα.

Επί του παρόντος, η χρήση μικροσκοπίων δύο φωτονίων περιορίζεται σε προηγμένα κλινικά και ερευνητικά εργαστήρια λόγω του υψηλού κόστους των οργάνων. Ένα μικροσκόπιο δύο φωτονίων κοστίζει συνήθως μεταξύ 300.000 και 500.000 $ και τα λέιζερ που χρησιμοποιούνται για να διεγείρουν τις βαφές που χρησιμοποιούνται στα δείγματα είναι επίσης πολύ ακριβά. Ωστόσο, καθώς η τεχνολογία βελτιώνεται, τα μικροσκόπια δύο φωτονίων μπορεί να γίνουν πιο εύκολα διαθέσιμα σε κλινικές εγκαταστάσεις.

Ελέγξτε την κατανόησή σας

Ηλεκτρονική Μικροσκοπία

Η μέγιστη θεωρητική ανάλυση των εικόνων που δημιουργούνται από τα μικροσκόπια φωτός περιορίζεται τελικά από τα μήκη κύματος του ορατού φωτός. Τα περισσότερα μικροσκόπια φωτός μπορούν να μεγεθύνουν μόνο 1000⨯ και μερικά μπορούν να μεγεθύνουν έως και 1500⨯, αλλά αυτό δεν αρχίζει να προσεγγίζει τη μεγεθυντική ισχύ ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου (EM), το οποίο χρησιμοποιεί δέσμες ηλεκτρονίων μικρού μήκους κύματος αντί για φως για να αυξήσει τη μεγέθυνση και την ανάλυση.

Τα ηλεκτρόνια, όπως η ηλεκτρομαγνητική ακτινοβολία, μπορούν να συμπεριφέρονται ως κύματα, αλλά με μήκη κύματος 0,005 nm, μπορούν να παράγουν πολύ καλύτερη ανάλυση από το ορατό φως. Ένα EM μπορεί να παράγει μια ευκρινή εικόνα που μεγεθύνεται έως και 100.000⨯. Έτσι, τα EM μπορούν να επιλύσουν υποκυτταρικές δομές καθώς και ορισμένες μοριακές δομές (π.χ. μονόκλωνα DNA), ωστόσο, η ηλεκτρονική μικροσκοπία δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε ζωντανό υλικό λόγω των μεθόδων που απαιτούνται για την προετοιμασία των δειγμάτων.

Υπάρχουν δύο βασικοί τύποι ΗΜ: το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης (TEM) και το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) (Εικόνα 2.21). Το TEM είναι κάπως ανάλογο με το μικροσκόπιο φωτός φωτεινού πεδίου όσον αφορά τον τρόπο λειτουργίας του. Ωστόσο, χρησιμοποιεί μια δέσμη ηλεκτρονίων από πάνω από το δείγμα που εστιάζεται χρησιμοποιώντας μαγνητικό φακό (και όχι γυάλινο φακό) και προβάλλεται μέσω του δείγματος σε έναν ανιχνευτή. Τα ηλεκτρόνια περνούν μέσα από το δείγμα και στη συνέχεια ο ανιχνευτής συλλαμβάνει την εικόνα (Εικόνα 2.22).

Για να περάσουν τα ηλεκτρόνια μέσα από το δείγμα σε ένα TEM, το δείγμα πρέπει να είναι εξαιρετικά λεπτό (πάχος 20–100 nm). Η εικόνα παράγεται λόγω της διαφορετικής αδιαφάνειας σε διάφορα μέρη του δείγματος. Αυτή η αδιαφάνεια μπορεί να βελτιωθεί με χρώση του δείγματος με υλικά όπως βαρέα μέταλλα, τα οποία έχουν πυκνότητα ηλεκτρονίων. Το TEM απαιτεί η δοκός και το δείγμα να βρίσκονται σε κενό και το δείγμα να είναι πολύ λεπτό και αφυδατωμένο. Τα συγκεκριμένα βήματα που απαιτούνται για την προετοιμασία ενός δείγματος για παρατήρηση υπό ένα ΗΜ συζητούνται λεπτομερώς στην επόμενη ενότητα.

Τα SEM σχηματίζουν εικόνες επιφανειών δειγμάτων, συνήθως από ηλεκτρόνια που αποσπώνται από τα δείγματα από μια δέσμη ηλεκτρονίων. Αυτό μπορεί να δημιουργήσει εξαιρετικά λεπτομερείς εικόνες με τρισδιάστατη εμφάνιση που εμφανίζονται σε μια οθόνη (Εικόνα 2.23). Συνήθως, τα δείγματα ξηραίνονται και προετοιμάζονται με σταθεροποιητικά που μειώνουν τα τεχνουργήματα, όπως η συρρίκνωση, που μπορεί να προκληθούν με ξήρανση, πριν επικαλυφθούν με ψεκασμό με ένα λεπτό στρώμα μετάλλου όπως ο χρυσός. Ενώ το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης απαιτεί πολύ λεπτές τομές και επιτρέπει σε κάποιον να δει εσωτερικές δομές όπως τα οργανίδια και το εσωτερικό των μεμβρανών, το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης μπορεί να χρησιμοποιηθεί για να δει τις επιφάνειες μεγαλύτερων αντικειμένων (όπως ένας κόκκος γύρης) καθώς και τις επιφάνειες πολύ μικρά δείγματα (Εικόνα 2.24). Ορισμένα EM μπορούν να μεγεθύνουν μια εικόνα έως και 2.000.000⨯. 1

Ελέγξτε την κατανόησή σας

  • Ποια είναι μερικά πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα της ηλεκτρονικής μικροσκοπίας, σε αντίθεση με τη μικροσκοπία φωτός, για την εξέταση μικροβιολογικών δειγμάτων;
  • Ποια είδη δειγμάτων εξετάζονται καλύτερα με το TEM; SEM;

Micro Συνδέσεις

Χρήση μικροσκοπίας για τη μελέτη βιοφίλμ

Ένα βιοφίλμ είναι μια πολύπλοκη κοινότητα ενός ή περισσότερων ειδών μικροοργανισμών, που τυπικά σχηματίζεται ως γλοιώδες επίχρισμα προσαρτημένο σε μια επιφάνεια λόγω της παραγωγής μιας εξωπολυμερικής ουσίας (EPS) που προσκολλάται σε μια επιφάνεια ή στη διεπιφάνεια μεταξύ των επιφανειών (π.χ. και νερό). Στη φύση, τα βιοφίλμ είναι άφθονα και συχνά καταλαμβάνουν πολύπλοκες θέσεις μέσα στα οικοσυστήματα (Εικόνα 2.25). Στην ιατρική, τα βιοφίλμ μπορούν να επικαλύψουν ιατρικές συσκευές και να υπάρχουν μέσα στο σώμα. Επειδή διαθέτουν μοναδικά χαρακτηριστικά, όπως αυξημένη αντίσταση στο ανοσοποιητικό σύστημα και στα αντιμικροβιακά φάρμακα, τα βιοφίλμ παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον τόσο για τους μικροβιολόγους όσο και για τους κλινικούς γιατρούς.

Επειδή τα βιοφίλμ είναι παχιά, δεν μπορούν να παρατηρηθούν πολύ καλά χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο φωτός, τεμαχίζοντας ένα βιοφίλμ για να δημιουργηθεί ένα λεπτότερο δείγμα, μπορεί να σκοτώσει ή να διαταράξει τη μικροβιακή κοινότητα. Η ομοεστιακή μικροσκοπία παρέχει πιο καθαρές εικόνες βιοφίλμ, επειδή μπορεί να εστιάσει σε ένα επίπεδο z τη φορά και να παράγει μια τρισδιάστατη εικόνα ενός παχύ δείγματος. Οι φθορίζουσες βαφές μπορεί να είναι χρήσιμες για τον εντοπισμό κυττάρων εντός της μήτρας. Επιπροσθέτως, μπορούν να χρησιμοποιηθούν τεχνικές όπως ο ανοσοφθορισμός και ο φθορισμός in situ υβριδισμός (FISH), στους οποίους χρησιμοποιούνται ανιχνευτές φθορισμού για τη σύνδεση με το DNA.

Η ηλεκτρονική μικροσκοπία μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την παρατήρηση βιοφίλμ, αλλά μόνο μετά την αφυδάτωση του δείγματος, η οποία παράγει ανεπιθύμητα τεχνουργήματα και παραμορφώνει το δείγμα. Εκτός από αυτές τις προσεγγίσεις, είναι δυνατό να παρακολουθούνται τα ρεύματα νερού μέσα από τα σχήματα (όπως κώνοι και μανιτάρια) των βιοφίλμ, χρησιμοποιώντας βίντεο της κίνησης των σφαιριδίων με επικάλυψη φθορισμού (Εικόνα 2.26).

Μικροσκοπία ανιχνευτή σάρωσης

Ένα μικροσκόπιο ανιχνευτή σάρωσης δεν χρησιμοποιεί φως ή ηλεκτρόνια, αλλά πολύ ευκρινείς ανιχνευτές που περνούν πάνω από την επιφάνεια του δείγματος και αλληλεπιδρούν απευθείας με αυτό. Αυτό παράγει πληροφορίες που μπορούν να συγκεντρωθούν σε εικόνες με μεγεθύνσεις έως και 100.000.000⨯. Τέτοιες μεγάλες μεγεθύνσεις μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την παρατήρηση μεμονωμένων ατόμων σε επιφάνειες. Μέχρι σήμερα, αυτές οι τεχνικές έχουν χρησιμοποιηθεί κυρίως για έρευνα παρά για διαγνωστικά.

Υπάρχουν δύο τύποι μικροσκοπίου ανιχνευτή σάρωσης: το μικροσκόπιο σάρωσης σήραγγας (STM) και το μικροσκόπιο ατομικής δύναμης (AFM). Ένα STM χρησιμοποιεί έναν ανιχνευτή που περνά ακριβώς πάνω από το δείγμα καθώς μια σταθερή τάση τάσης δημιουργεί τη δυνατότητα για ηλεκτρικό ρεύμα μεταξύ του ανιχνευτή και του δείγματος. Αυτό το ρεύμα συμβαίνει μέσω κβαντικής διοχέτευσης ηλεκτρονίων μεταξύ του ανιχνευτή και του δείγματος και η ένταση του ρεύματος εξαρτάται από την απόσταση μεταξύ του ανιχνευτή και του δείγματος. Ο αισθητήρας μετακινείται οριζόντια πάνω από την επιφάνεια και μετράται η ένταση του ρεύματος. Το μικροσκόπιο σάρωσης σήραγγας μπορεί να χαρτογραφήσει αποτελεσματικά τη δομή των επιφανειών σε ανάλυση στην οποία μπορούν να ανιχνευθούν μεμονωμένα άτομα.

Παρόμοια με ένα STM, τα AFM έχουν έναν λεπτό ανιχνευτή που περνά ακριβώς πάνω από το δείγμα. Ωστόσο, αντί να μετράει τις διακυμάνσεις του ρεύματος σε σταθερό ύψος πάνω από το δείγμα, ένα AFM καθορίζει ένα σταθερό ρεύμα και μετρά τις διακυμάνσεις στο ύψος του άκρου του ανιχνευτή καθώς περνά πάνω από το δείγμα. Καθώς το άκρο του ανιχνευτή περνά πάνω από το δείγμα, δυνάμεις μεταξύ των ατόμων (δυνάμεις van der Waals, τριχοειδείς δυνάμεις, χημικοί δεσμοί, ηλεκτροστατικές δυνάμεις και άλλα) το αναγκάζουν να κινηθεί πάνω και κάτω. Η εκτροπή του άκρου του ανιχνευτή προσδιορίζεται και μετριέται χρησιμοποιώντας τον νόμο της ελαστικότητας του Hooke, και αυτές οι πληροφορίες χρησιμοποιούνται για την κατασκευή εικόνων της επιφάνειας του δείγματος με ανάλυση σε ατομικό επίπεδο (Εικόνα 2.27).

Το σχήμα 2.28, το σχήμα 2.29 και το σχήμα 2.30 συνοψίζουν τις τεχνικές μικροσκοπίας για μικροσκόπια φωτός, ηλεκτρονικά μικροσκόπια και μικροσκόπια ανιχνευτή σάρωσης, αντίστοιχα.

Ελέγξτε την κατανόησή σας

  • Ποιο έχει μεγαλύτερη μεγέθυνση, ένα μικροσκόπιο φωτός ή ένα μικροσκόπιο ανιχνευτή σάρωσης;
  • Ονομάστε ένα πλεονέκτημα και έναν περιορισμό της μικροσκοπίας ανιχνευτή σάρωσης.

Υποσημειώσεις

    "Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης JEM-ARM200F", Η JEOL USA Inc, http://www.jeolusa.com/PRODUCTS/TransmissionElectronMicroscopes%28TEM%29/200kV/JEM-ARM200F/tabid/663/Default.aspx#195028-specifications. Πρόσβαση στις 28/8/2015.

Ως συνεργάτης της Amazon κερδίζουμε από αγορές που πληρούν τις προϋποθέσεις.

Θέλετε να αναφέρετε, να μοιραστείτε ή να τροποποιήσετε αυτό το βιβλίο; Αυτό το βιβλίο είναι Creative Commons Attribution License 4.0 και πρέπει να αποδώσετε OpenStax.

    Εάν αναδιανέμετε ολόκληρο ή μέρος αυτού του βιβλίου σε έντυπη μορφή, τότε πρέπει να συμπεριλάβετε σε κάθε φυσική σελίδα την ακόλουθη αναφορά:

  • Χρησιμοποιήστε τις παρακάτω πληροφορίες για να δημιουργήσετε μια αναφορά. Συνιστούμε να χρησιμοποιήσετε ένα εργαλείο αναφοράς όπως αυτό.
    • Συγγραφείς: Nina Parker, Mark Schneegurt, Anh-Hue Thi Tu, Philip Lister, Brian M. Forster
    • Εκδότης/ιστοσελίδα: OpenStax
    • Τίτλος βιβλίου: Μικροβιολογία
    • Ημερομηνία δημοσίευσης: 1 Νοεμβρίου 2016
    • Τοποθεσία: Χιούστον, Τέξας
    • URL βιβλίου: https://openstax.org/books/microbiology/pages/1-introduction
    • Διεύθυνση URL ενότητας: https://openstax.org/books/microbiology/pages/2-3-instruments-of-microscopy

    © 20 Αυγούστου 2020 OpenStax. Το περιεχόμενο σχολικών βιβλίων που παράγεται από το OpenStax έχει άδεια χρήσης με άδεια Creative Commons Attribution License 4.0. Το όνομα OpenStax, το λογότυπο OpenStax, τα εξώφυλλα βιβλίων OpenStax, το όνομα OpenStax CNX και το λογότυπο OpenStax CNX δεν υπόκεινται στην άδεια Creative Commons και δεν επιτρέπεται να αναπαραχθούν χωρίς την προηγούμενη και ρητή γραπτή συγκατάθεση του Πανεπιστημίου Rice.


    Μικροσκοπία ανάκλασης παρεμβολών στην κυτταρική βιολογία: μεθοδολογία και εφαρμογές

    Από την εισαγωγή της στην κυτταρική βιολογία από τον Curtis το 1964, η μικροσκοπία ανάκλασης παρεμβολής (IRM) έχει χρησιμοποιηθεί από έναν αυξανόμενο αριθμό ερευνητών για τη μελέτη των αλληλεπιδράσεων κυττάρου-υποστρώματος σε ζωντανά κύτταρα σε καλλιέργεια. Με τη χρήση αντιφλεγμονωδών αντικειμένων, μπορούν πλέον να ληφθούν εύκολα εικόνες IRM υψηλής αντίθεσης. Από τις διαφορετικές θεωρίες για το σχηματισμό εικόνας στο IRM που έχουν προταθεί, μπορεί να φανεί ότι ένα μοτίβο παρεμβολής μηδενικής τάξης δημιουργείται σε αριθμητικό διάφραγμα με υψηλό φωτισμό. Αυτό παρέχει πληροφορίες σχετικά με την εγγύτητα της επαφής μεταξύ κυττάρου και υποστρώματος, με ελάχιστη μόνο διαταραχή από αντανακλάσεις από την επιφάνεια του ραχιαίου κυττάρου. Επομένως, η σωστή χρήση των διαφραγμάτων φωτισμού είναι ζωτικής σημασίας. Ωστόσο, οι εικόνες IRM πρέπει να ερμηνεύονται με προσοχή, ειδικά κάτω από λεπτά κυτταροπλασματικά φύλλα. Η ποσοτική IRM είναι δυνατή μόνο με ένα μαθηματικό μοντέλο για πεπερασμένη συμβολομετρία διαφράγματος φωτισμού και με μια ανεξάρτητη μέτρηση του πάχους της κυψέλης για τιμές έως 1 micron. Το IRM έχει εφαρμοστεί ποιοτικά σε μεγάλο αριθμό τύπων κυττάρων και φαίνεται ότι υπάρχουν δύο γενικοί τύποι προσκόλλησης. Οι εστιακές επαφές είναι μικρές περιοχές της πλησιέστερης τοποθέτησης κυττάρου-υποστρώματος, πιθανώς άμεσης επαφής, που σχετίζονται με το περιφερικό άκρο των δεσμίδων νήματος ακτίνης. Είναι σταθερές δομές προσάρτησης που συγκρατούν το κύτταρο στη θέση του και στο σχήμα του. Οι στενές επαφές είναι ευρείες περιοχές μειωμένης απόστασης κυψέλης προς υπόστρωμα. Είναι πιο αδύναμες αλλά πολύ δυναμικές προσφύσεις που διατηρούν γρήγορες κινήσεις κυττάρων ή τμημάτων κυττάρων πάνω από το υπόστρωμα. Αν και ένας αριθμός ανεξάρτητων παρατηρήσεων υποδηλώνει ότι τα πρότυπα προσκόλλησης των κακοήθων μετασχηματισμένων κυττάρων διαφέρουν από αυτά των φυσιολογικών ομολόγων τους, δεν υπάρχει απλή συσχέτιση μεταξύ κακοήθειας in vivo και αλλοιωμένου σχηματισμού επαφής in vitro. Το πρότυπο προσκόλλησης φαίνεται να καθορίζεται από την κινητική κατάσταση των κυττάρων παρά από τον ιστό προέλευσής τους. Τέλος, το IRM μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για την ενίσχυση της αντίθεσης σε εικόνες σταθερών παρασκευασμάτων.

    Ειδοποιήσεις μέσω email

    Παρατίθεται από

    Νικητής του βραβείου JCS 2020: Tadayoshi Murakawa

    Συγχαρητήρια στον Tadayoshi Murakawa, ο οποίος κέρδισε το βραβείο JCS 2020 για την εργασία του με τίτλο &lsquoΈνα σωληνοειδές λυσοσωμικό δίκτυο που εξαρτάται από την αυτοφαγία συγχρονίζει την υποβαθμιστική δραστηριότητα που απαιτείται για την αναδιαμόρφωση των μυών&rsquo. Μάθετε περισσότερα για τον Tadayoshi και διαβάστε τη νικητήρια εργασία του.

    «Χαρακτηριστικά FocalPlane. Σειρά διαδικτυακών σεμιναρίων

    Είμαστε ενθουσιασμένοι που ανακοινώνουμε τη νέα σειρά διαδικτυακών σεμιναρίων «FocalPlane features&hellip». Καλύπτοντας όλες τις πτυχές της μικροσκοπίας, ελάτε μαζί μας την πρώτη Τρίτη κάθε μήνα για να μάθετε για την πιο πρόσφατη έρευνα και να λάβετε μέρος σε μια συνεδρία εικονικής δικτύωσης με τον ομιλητή στη συνέχεια.

    6 Ιουλίου
    Ομιλήτρια: Eva Nogales

    3 Αυγούστου
    Ομιλητής: Michael Dustin

    Γνωρίστε τους συντάκτες JCS

    Αν και οι προσωπικές συναντήσεις εξακολουθούν να βρίσκονται σε αναμονή, είμαστε πάντα στην ευχάριστη θέση να συζητήσουμε για την JCS και την Εταιρεία Βιολόγων. Οι συντάκτες μας είναι διαθέσιμοι, σχεδόν φυσικά, όλο τον Μάιο και τον Ιούνιο:

    Επιστήμονας κυττάρων για παρακολούθηση - Liang Ge

    Τώρα στον τέταρτο χρόνο λειτουργίας του δικού του εργαστηρίου, ο Liang Ge μας λέει για το ταξίδι του να γίνει PI στο Πανεπιστήμιο Tsinghua, συζητά την αυτοφαγία και το UPS και μοιράζεται τις καλύτερες συμβουλές που έλαβε σχετικά με την επιστήμη.

    Διαβάστε & Δημοσίευση συμφωνίας με το EIFL

    Είμαστε στην ευχάριστη θέση να ανακοινώσουμε ότι οι ερευνητές σε 30 χώρες της αναπτυσσόμενης και μεταβατικής οικονομίας μπορούν να επωφεληθούν από την άμεση και δωρεάν δημοσίευση Ανοιχτής Πρόσβασης στο Journal of Cell Science μετά από μια νέα συμφωνία με την Ηλεκτρονική Πληροφορία για Βιβλιοθήκες (EIFL).

    Τώρα έχουμε πάνω από 200 ιδρύματα σε περισσότερες από 20 χώρες και έξι κοινοπραξίες βιβλιοθηκών που συμμετέχουν στην πρωτοβουλία read & Publish. Μάθετε περισσότερα και δείτε την πλήρη λίστα των ιδρυμάτων που συμμετέχουν.


    Ο Godfrey Hounsfield και ο Allan Cormack αναπτύσσουν τον σαρωτή υπολογιστή αξονικής τομογραφίας (CAT). Με τη βοήθεια ενός υπολογιστή, η συσκευή συνδυάζει πολλές εικόνες ακτίνων Χ για να δημιουργήσει όψεις διατομής καθώς και τρισδιάστατες εικόνες εσωτερικών οργάνων και δομών.

    Ο John Venables και ο CJ Harland παρατηρούν μοτίβα οπισθοσκέδασης ηλεκτρονίων (EBSP) στο ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης. Το EBSP παρέχει ποσοτικές μικροδομικές πληροφορίες σχετικά με την κρυσταλλογραφική φύση των μετάλλων, των ορυκτών, των ημιαγωγών και των κεραμικών.


    Επισκόπηση ομιλίας

    Το μικροσκόπιο πόλωσης ανιχνεύει την αλληλεπίδραση των μορίων με το πολωμένο φως και είναι ιδιαίτερα καλό για την εξέταση δομών καλής τάξης που αποτελούνται από πολυμερή, όπως η μιτωτική άτρακτος. Αυτή η διάλεξη περιγράφει τα στοιχεία ενός μικροσκοπίου πόλωσης (π.χ. πολωτή, αναλυτή), τη διπλή διάθλαση και τον τρόπο εκμετάλλευσης για τη δημιουργία εικόνων, την προσαρμογή ενός μικροσκοπίου πόλωσης, παραδείγματα εικόνων και νέες μεθόδους όπως το LC-Polscope.

    Ερωτήσεις

    1. Σωστό ή Λάθος: Μια λάμπα βολφραμίου εκπέμπει πολωμένο φως.
    2. Ποια από τις παρακάτω προτάσεις ισχύει για τη μικροσκοπία πόλωσης;
      1. Ο πολωτής και ο αναλυτής είναι προσανατολισμένοι έτσι ώστε οι κατευθύνσεις μετάδοσής τους να είναι παράλληλες μεταξύ τους.
      2. Το επίπεδο πολωμένο φως μπορεί να χωριστεί σε δύο διαφορετικά κύματα διάδοσης που ταξιδεύουν με διαφορετικές ταχύτητες μέσα από ένα υλικό διπλής διάθλασης.
      3. Ο αντισταθμιστής τοποθετείται συνήθως μετά τον αναλυτή και πριν από τον προσοφθάλμιο/κάμερα.
      4. Ένας αντισταθμιστής κάνει όλα τα μέρη του δείγματος φωτεινότερα από το φόντο.
      1. Επειδή είναι μια από τις μεγαλύτερες δομές στο κύτταρο
      2. Επειδή οι μικροσωληνίσκοι είναι προσανατολισμένοι προς την ίδια κατεύθυνση και υπάρχει διαφορά δείκτη διάθλασης για το φως που ταξιδεύει παράλληλα σε σχέση με κάθετα στον άξονα της ατράκτου.
      3. Η τουμπουλίνη έχει μεγάλη τιμή δείκτη διάθλασης
      4. Ο άξονας μετατοπίζει το μήκος κύματος του φωτιστικού φωτός ελαφρώς προς το κόκκινο.
      1. Η πηγή φωτισμού πρέπει να είναι ένα μόνο μήκος κύματος πράσινου φωτός.
      2. Εάν ο αργός άξονας του μυός είναι ευθυγραμμισμένος με τον αργό άξονα της κόκκινης πλάκας, τότε ο μυς θα εμφανίζεται μπλε.
      3. Η κόκκινη πλάκα μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του γρήγορου και αργού άξονα μιας μυϊκής ίνας.
      4. Εάν ο αργός άξονας του μυός είναι ευθυγραμμισμένος με τον αργό άξονα της κόκκινης πλάκας, τότε ο μυς θα φαίνεται κίτρινος.

      Απαντήσεις

      1. Ψευδής.(Οι μοριακοί ταλαντωτές στο νήμα βολφραμίου είναι τυχαία προσανατολισμένοι και ως εκ τούτου εκπέμπουν φως σε όλες τις γωνίες.)
      2. σι
      3. σι
      4. Τέσσερα
      5. ντο

      Μικροσκοπία φωτός και βίντεο

      Μικροσκοπία φωτός και βίντεο, τρίτη έκδοση παρέχει ένα βήμα προς βήμα ταξίδι στη φιλοσοφία, την ψυχολογία και τη γεωμετρική και φυσική οπτική που εμπλέκεται στην ερμηνεία εικόνων που σχηματίζονται από μικροσκόπια φωτός. Το βιβλίο πραγματεύεται τις περιπλοκές που είναι απαραίτητες για τη δημιουργία μικροσκοπίων φωτός που επιτρέπουν σε κάποιον να οπτικοποιεί διαφανή δείγματα και, στη διαδικασία, να προσδιορίζει ποσοτικά διάφορες φυσικοχημικές ιδιότητες των δειγμάτων. Αυτή η ενημερωμένη έκδοση περιλαμβάνει τις πιο πρόσφατες εξελίξεις στη μικροσκοπία, διασφαλίζοντας ότι θα συνεχίσει να είναι ο πιο ολοκληρωμένος, εύχρηστος και ενημερωτικός οδηγός για τη μικροσκοπία φωτός. Με την παρουσίαση της γεωμετρικής οπτικής, βοηθά τον αναγνώστη να κατανοήσει το σχηματισμό εικόνας και την κίνηση του φωτός μέσα στο μικροσκόπιο.

      Μικροσκοπία φωτός και βίντεο, τρίτη έκδοση παρέχει ένα βήμα προς βήμα ταξίδι στη φιλοσοφία, την ψυχολογία και τη γεωμετρική και φυσική οπτική που εμπλέκεται στην ερμηνεία εικόνων που σχηματίζονται από μικροσκόπια φωτός. Το βιβλίο πραγματεύεται τις περιπλοκές που είναι απαραίτητες για τη δημιουργία μικροσκοπίων φωτός που επιτρέπουν σε κάποιον να οπτικοποιεί διαφανή δείγματα και, στη διαδικασία, να προσδιορίζει ποσοτικά διάφορες φυσικοχημικές ιδιότητες των δειγμάτων. Αυτή η ενημερωμένη έκδοση περιλαμβάνει τις πιο πρόσφατες εξελίξεις στη μικροσκοπία, διασφαλίζοντας ότι θα συνεχίσει να είναι ο πιο ολοκληρωμένος, εύχρηστος και ενημερωτικός οδηγός για τη μικροσκοπία φωτός. Με την παρουσίαση της γεωμετρικής οπτικής, βοηθά τον αναγνώστη να κατανοήσει το σχηματισμό εικόνας και την κίνηση του φωτός μέσα στο μικροσκόπιο.


      Εκπαίδευση στη Μικροσκοπία και στην Ψηφιακή Απεικόνιση

      Τις τελευταίες δεκαετίες, η μικροσκοπία φθορισμού έχει γίνει ένα ουσιαστικό εργαλείο για την εξέταση μιας μεγάλης ποικιλίας βιολογικών μορίων, μονοπατιών και δυναμικών σε ζωντανά κύτταρα, ιστούς και ολόκληρα ζώα. Σε αντίθεση με άλλες τεχνικές (όπως η ηλεκτρονική μικροσκοπία), η απεικόνιση φθορισμού είναι συμβατή με κύτταρα που διατηρούνται σε καλλιέργεια, γεγονός που επιτρέπει την ελάχιστα επεμβατική οπτική παρατήρηση γεγονότων που συμβαίνουν σε μεγάλο χρονικό διάστημα. Όσον αφορά τη χωρική ανάλυση, πολλές τεχνικές, όπως η τομογραφία εκπομπής ποζιτρονίων, η μαγνητική τομογραφία και η οπτική τομογραφία συνοχής μπορούν να δημιουργήσουν εικόνες ζώων και ανθρώπων σε αναλύσεις μεταξύ 10 εκατοστών και 10 μικρομέτρων, ενώ η ηλεκτρονική μικροσκοπία και οι τεχνικές ανιχνευτή σάρωσης διαθέτουν την υψηλότερη χωρική ανάλυση, συχνά προσεγγίζοντας τα μοριακά και ατομικά επίπεδα (βλ. Εικόνα 1). Ανάμεσα σε αυτά τα δύο άκρα στην ικανότητα επίλυσης βρίσκεται η οπτική μικροσκοπία. Εκτός από τα πλεονεκτήματα που προκύπτουν από τη δυνατότητα απεικόνισης ζωντανών κυττάρων, το πιο σημαντικό μειονέκτημα σε όλες τις μορφές μικροσκοπίας φθορισμού (συμπεριλαμβανομένου του ευρέως πεδίου, της σάρωσης με λέιζερ, του περιστρεφόμενου δίσκου, του πολυφωτονίου και της συνολικής εσωτερικής ανάκλασης) είναι τα όρια στη χωρική ανάλυση που αποσαφηνίστηκαν για πρώτη φορά. και περιγράφεται από τον Ernst Abbe στα τέλη του 1800.

      Επί του παρόντος, οι σύγχρονες και καθιερωμένες τεχνικές μικροσκοπίας φθορισμού μπορούν εύκολα να επιλύσουν μια ποικιλία χαρακτηριστικών σε απομονωμένα κύτταρα και ιστούς, όπως ο πυρήνας, τα μιτοχόνδρια, το σύμπλεγμα Golgi, ο κυτταροσκελετός και το ενδοπλασματικό δίκτυο. Διάφοροι τρόποι απεικόνισης στον φθορισμό χρησιμοποιούνται συχνά για τη δυναμική παρακολούθηση πρωτεϊνών και πεπτιδίων σήματος, καθώς και για την παρακολούθηση άλλων αλληλεπιδράσεων σε ζωντανά κύτταρα. Η περιορισμένη χωρική ανάλυση, ωστόσο, αποκλείει την ικανότητα επίλυσης σημαντικών δομών, συμπεριλαμβανομένων των συναπτικών κυστιδίων, των ριβοσωμάτων ή των μοριακών αλληλεπιδράσεων, τα οποία όλα έχουν εύρος μεγέθους χαρακτηριστικών που βρίσκονται κάτω από τα όρια ανίχνευσης στη μικροσκοπία φθορισμού. Το όριο περίθλασης στην οπτική μικροσκοπία διέπεται από το γεγονός ότι κατά την απεικόνιση μιας σημειακής πηγής φωτός, το όργανο παράγει ένα θολό και περίθλαση πεπερασμένου μεγέθους εστιακό σημείο στο επίπεδο εικόνας με διαστάσεις που διέπουν την ελάχιστη απόσταση στην οποία μπορούν να διακριθούν δύο σημεία . Στο πλάγιο (x, y) επίπεδο, το εστιακό σημείο παρουσιάζει προοδευτικά μειούμενους εξωτερικούς ομόκεντρους δακτυλίους και αναφέρεται ως Αέρινος δίσκος, ενώ στην αξονική διάσταση, το ελλειπτικό μοτίβο είναι γνωστό ως συνάρτηση διασποράς σημείου (PSF). Οι επίσημες εκφράσεις που παρουσιάζονται από τον Abbe για πλευρική και αξονική ανάλυση στο οπτικό μικροσκόπιο είναι:

      Ανάλυση x,y = λ / 2[η • sin(α)] (1) Ανάλυση z = 2λ / [η • sin(α)] 2 ( 2)

      όπου λ είναι το μήκος κύματος του φωτός (διέγερση σε φθορισμό), η αντιπροσωπεύει τον δείκτη διάθλασης του μέσου απεικόνισης και ο συνδυασμένος όρος η • sin(α) είναι γνωστός ως το αντικειμενικό αριθμητικό διάφραγμα ( ΝΑ ). Οι στόχοι που χρησιμοποιούνται συνήθως στη μικροσκοπία έχουν αριθμητικό διάφραγμα μικρότερο από 1,5, περιορίζοντας τον όρο α στις Εξισώσεις (1) και (2) σε λιγότερο από 70 μοίρες (αν και οι νέοι στόχοι υψηλής απόδοσης πλησιάζουν πολύ αυτό το όριο). Επομένως, το θεωρητικό όριο ανάλυσης στο μικρότερο πρακτικό μήκος κύματος διέγερσης (περίπου 400 νανόμετρα) είναι περίπου 150 νανόμετρα στην πλευρική διάσταση και πλησιάζει τα 400 νανόμετρα στην αξονική διάσταση όταν χρησιμοποιείται ένας αντικειμενικός φακός με αριθμητικό διάφραγμα 1,40. Σε πρακτικούς όρους για την απεικόνιση της ενισχυμένης πράσινης φθορίζουσας πρωτεΐνης (EGFP) σε ζωντανά κύτταρα, αυτές οι τιμές είναι περίπου 200 και 500 νανόμετρα, αντίστοιχα (βλ. Εικόνα 2(α)). Έτσι, οι δομές που βρίσκονται πιο κοντά από 200 νανόμετρα δεν μπορούν να διαχωριστούν στο πλευρικό επίπεδο χρησιμοποιώντας είτε ένα μικροσκόπιο ευρέως πεδίου είτε ομοεστιακό μικροσκόπιο φθορισμού.

      Το όριο περίθλασης Abbe (ή τουλάχιστον η αναγνώριση αυτού του ορίου) στάθηκε για σχεδόν έναν αιώνα προτού οι εφευρετικοί μικροσκόπιοι αρχίσουν να εξετάζουν πώς θα μπορούσαν να βελτιωθούν τα όργανα τους για να παρακάμψουν τα φυσικά εμπόδια προκειμένου να επιτύχουν υψηλότερη ανάλυση. Λόγω του γεγονότος ότι η αξονική ανάλυση είναι πολύ χαμηλότερη από την πλευρική ανάλυση (τουλάχιστον κατά δύο φορές), μεγάλο μέρος της εργασίας που διεξήχθη στο τελευταίο μέρος του εικοστού αιώνα αφορούσε βελτιώσεις στην απόδοση στην αξονική διάσταση. Οι ερευνητές ανακάλυψαν ότι τα συνεστιακά όργανα σάρωσης λέιζερ παρήγαγαν πολύ μέτριες αυξήσεις στην ανάλυση με κόστος σήματος προς θόρυβο και ότι άλλες σχετικές τεχνολογίες (συμπεριλαμβανομένων πολυφωτονίων, δομημένου φωτισμού και περιστρεφόμενου δίσκου) θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για οπτική τομή, αλλά χωρίς σημαντική βελτίωση σε αξονική ανάλυση. Μια σημαντική ιδέα που πρέπει να σημειωθεί, και ένα από τα πιο υποτιμημένα γεγονότα που σχετίζονται με την οπτική απεικόνιση στη βιολογία, είναι ότι η επιτυγχανόμενη ανάλυση μικροσκοπίου συχνά δεν φτάνει το φυσικό όριο που επιβάλλει η περίθλαση. Αυτό οφείλεται στο γεγονός ότι οι οπτικές ανομοιογένειες στο δείγμα μπορεί να παραμορφώσουν τη φάση της δέσμης διέγερσης, οδηγώντας σε έναν εστιακό όγκο που είναι σημαντικά μεγαλύτερος από το ιδανικό περιορισμένης περίθλασης. Επιπλέον, η ανάλυση μπορεί επίσης να διακυβευτεί από ακατάλληλη ευθυγράμμιση του μικροσκοπίου, τη χρήση ασυμβίβαστου λαδιού εμβάπτισης, καλυπτρίδες που έχουν πάχος εκτός του βέλτιστου εύρους και ακατάλληλα ρυθμισμένα κολάρα διόρθωσης.

      Μια άλλη σημαντική πτυχή του θεμελιώδους ορίου ανάλυσης στην οπτική μικροσκοπία εκδηλώνεται από την έκταση του μη εξαφανιζόμενου τμήματος της συνάρτησης οπτικής μεταφοράς οργάνου (OTF), το οποίο μπορεί να υπολογιστεί χρησιμοποιώντας τον μετασχηματισμό Fourier της συνάρτησης διασποράς σημείου. Το OTF καθορίζει τον βαθμό στον οποίο οι χωρικές συχνότητες που περιέχουν πληροφορίες για το δείγμα χάνονται, διατηρούνται, εξασθενούν ή μετατοπίζονται φάση κατά τη διάρκεια της απεικόνισης (Εικόνα 2(β)). Οι πληροφορίες χωρικής συχνότητας που χάνονται κατά τη διαδικασία απεικόνισης δεν μπορούν να ανακτηθούν, έτσι ώστε ένας από τους πρωταρχικούς στόχους για όλες τις μορφές μικροσκοπίας είναι να αποκτήσουν το υψηλότερο δυνατό εύρος συχνοτήτων από το δείγμα. Στην παραδοσιακή μικροσκοπία φθορισμού, η επικρατούσα απαίτηση για την επίτευξη αυτού του στόχου είναι να διασφαλιστεί ότι ο εκπεμπόμενος φθορισμός είναι γραμμικά ανάλογος με την τοπική ένταση του φωτισμού διέγερσης. Σε αντίθεση με την κατάσταση για το εκπεμπόμενο και ανακλώμενο φως, ωστόσο, η εκπομπή φθορισμού είναι ασυνάρτητη λόγω του μεγάλου φασματικού εύρους ζώνης και της στοχαστικής φύσης της ηλεκτρονικής χαλάρωσης για την παραγωγή δευτερογενών φωτονίων.

      Στις αρχές της δεκαετίας του 1990, όργανα με αντίθετους στόχους που αναπτύχθηκαν από τους Stefan Hell, Mats Gustafsson, David Agard και John Sedat (τεχνικές με το όνομα 4Pi και I 5 M ) μπόρεσαν να επιτύχουν βελτίωση στην αξονική ανάλυση σε περίπου 100 νανόμετρα χρησιμοποιώντας ομοεστιακές και ευρείες διαμορφώσεις , αντίστοιχα. Ωστόσο, παρόλο που αυτά τα όργανα ήταν σε θέση να παράγουν μια πενταπλάσια αύξηση στην αξονική ανάλυση, η πλευρική ανάλυση παρέμεινε μη βελτιωμένη. Αργότερα στη δεκαετία του 1990, η θεμελιωδώς νέα τεχνολογία μικροσκοπίου που πρωτοστάτησε ο Stefan Hell κατάφερε να ξεπεράσει το όριο περίθλασης πλευρικής ανάλυσης Abbe, το οποίο τελικά οδήγησε σε μια επανάσταση στη μικροσκοπία φθορισμού. Ως αποτέλεσμα, μια ευρεία γκάμα νέων και συναρπαστικών μεθοδολογιών εισήχθη πρόσφατα που τώρα ονομάζονται συλλογικά μικροσκοπία υπερανάλυσης και διαθέτουν τόσο πλευρική όσο και αξονική ανάλυση μετρούμενη σε δεκάδες νανόμετρα και ακόμη λιγότερο. Το κοινό νήμα σε όλες αυτές τις νέες τεχνικές είναι ότι είναι σε θέση να επιλύουν χαρακτηριστικά κάτω από το όριο περίθλασης ενεργοποιώντας και απενεργοποιώντας τα φθοροφόρα διαδοχικά στο χρόνο, έτσι ώστε τα σήματα να μπορούν να καταγράφονται διαδοχικά.

      Οι πιο σημαντικές πρόοδοι στην απεικόνιση υπερανάλυσης έχουν επιτευχθεί σε αυτό που ονομάζεται μικροσκοπία απομακρυσμένου πεδίου και περιλαμβάνουν είτε χωρική είτε χρονική ρύθμιση της μετάβασης μεταξύ δύο μοριακών καταστάσεων ενός φθοροφόρου (όπως η εναλλαγή μεταξύ μιας σκοτεινής και φωτεινής κατάστασης) ή με τη φυσική μείωση του μέγεθος της συνάρτησης διασποράς σημείου που χρησιμοποιείται στον φωτισμό διέγερσης. Μεταξύ των μεθόδων που βελτιώνουν την ανάλυση με τροποποίηση PSF, οι πιο σημαντικές τεχνικές αναφέρονται με τα ακρωνύμια STED (διεγερμένη εξάντληση εκπομπών από το εργαστήριο Stefan Hell) και SSIM (κορεσμένη δομημένη μικροσκοπία φωτισμού με πρωτοπόρο τον Mats Gustafsson). Τεχνικές που βασίζονται στην ανίχνευση και τον ακριβή εντοπισμό μεμονωμένων μορίων περιλαμβάνουν το PALM (φωτοενεργοποιημένη μικροσκοπία εντοπισμού που εισήχθη από τους Eric Betzig και Harald Hess) και STORM (στοχαστική οπτική μικροσκοπία ανασυγκρότησης που αναφέρθηκε για πρώτη φορά από τον Xiaowei Zhang). Όπως θα συζητηθεί, υπάρχουν πολλές παραλλαγές αυτών των τεχνικών, καθώς και προηγμένες μέθοδοι που μπορούν να συνδυάσουν ή ακόμα και να βελτιώσουν την απόδοση των υφιστάμενων σχημάτων απεικόνισης. Ακόμη πιο σημαντικό, νέες τεχνικές υπερανάλυσης εισάγονται με σχεδόν εκπληκτική ταχύτητα (σε σχέση με τις παραδοσιακές προόδους στη μικροσκοπία) και δεν είναι παράλογο να προτείνουμε ότι κάποια στιγμή στο εγγύς μέλλον, η ανάλυση ενός μόνο νανομέτρου μπορεί κάλλιστα να είναι εφικτή σε εμπορικά όργανα .

      Επιστροφή στην κορυφή ^ Οπτική μικροσκοπία κοντινού πεδίου

      Πριν συζητήσουμε εν συντομία την τεχνική υψηλής ανάλυσης της οπτικής μικροσκοπίας σάρωσης κοντινού πεδίου (NSOM), είναι σημαντικό να γίνει διάκριση μεταξύ των εννοιών του κοντινού πεδίου και του μακρινού πεδίου, οι οποίες έχουν «δανειστεί» από τη θεωρία της ηλεκτρομαγνητικής ακτινοβολίας που αναπτύχθηκε για την τεχνολογία κεραιών και εφαρμόζεται στη μικροσκοπία. Υπάρχουν δύο θεμελιώδεις διαφορές μεταξύ των εννοιών που αφορούν το μέγεθος της φωτισμένης περιοχής του δείγματος και την απόσταση διαχωρισμού μεταξύ της πηγής ακτινοβολίας και του δείγματος, αλλά το όριο μεταξύ των δύο περιοχών ορίζεται μόνο αόριστα. Στη μικροσκοπία κοντινού πεδίου, το δείγμα απεικονίζεται σε μια περιοχή που έχει ακτίνα πολύ μικρότερη από το μήκος κύματος του φωτισμού. Αντίθετα, η μικροσκοπία μακριού πεδίου τοποθετεί το δείγμα πολλές χιλιάδες μήκη κύματος μακριά από τον αντικειμενικό στόχο (συχνά ένα χιλιοστό ή περισσότερο) και περιορίζεται σε ανάλυση από τη διάθλαση των οπτικών μετώπων κύματος καθώς διέρχονται από το πίσω άνοιγμα του αντικειμενικού φακού. Τα περισσότερα συμβατικά μικροσκόπια, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που χρησιμοποιούνται για την απεικόνιση μεταδιδόμενου φωτός (φωτεινό πεδίο, DIC και αντίθεση φάσης), ο φθορισμός ευρέως πεδίου, ο ομοεστιακός και το πολυφωτόνιο θεωρούνται όργανα μακριού πεδίου, περιορισμένης περίθλασης.

      Τα μικροσκόπια κοντινού πεδίου παρακάμπτουν το φράγμα περίθλασης εκμεταλλευόμενοι τις μοναδικές ιδιότητες των παροδικών κυμάτων. Στην πράξη, το άνοιγμα του ανιχνευτή νανομεγέθους τοποθετείται δίπλα στο δείγμα σε απόσταση πολύ μικρότερη από το μήκος κύματος φωτισμού (γεννώντας τον όρο κοντινό πεδίο) για να ανιχνεύσει μη διαδιδόμενα κύματα φωτός που δημιουργούνται στην επιφάνεια. Η ανάλυση περιορίζεται μόνο από το φυσικό μέγεθος του διαφράγματος και όχι από το μήκος κύματος του φωτισμού φωτός, έτσι ώστε να μπορούν να επιτευχθούν πλευρικές και αξονικές αναλύσεις 20 νανόμετρων και 2 έως 5 νανόμετρων, αντίστοιχα. Η αντίθεση δημιουργείται από τον δείκτη διάθλασης, τη χημική δομή, την τοπική τάση ή τις ιδιότητες εκπομπής φθορισμού των ανιχνευτών που χρησιμοποιούνται για τη χρώση του δείγματος. Ωστόσο, ο χαρακτήρας παροδικού κύματος αυτής της τεχνικής απεικόνισης υποβιβάζει την εφαρμογή της μικροσκοπίας κοντινού πεδίου στη βιολογία στην εξέταση των επιφανειών των κυττάρων παρά στην ανίχνευση των πιο περίπλοκων και ενδιαφέροντων γεγονότων που συμβαίνουν μέσα στο κυτταρόπλασμα. Παρόμοιοι περιορισμοί ισχύουν για τις τεχνικές μικροσκοπίας ανιχνευτή σάρωσης (όπως η ατομική δύναμη).

      Επειδή δεν απαιτούν φθορισμό, οι τεχνικές μικροσκοπίας κοντινού πεδίου είναι πολλά υποσχόμενες για την απεικόνιση υλικών που δεν εκπέμπουν, όπως επιφάνειες ημιαγωγών ή λεπτές μεμβράνες με μηχανισμούς αντίθεσης που περιλαμβάνουν σκέδαση Raman, φασματοσκοπία, παρεμβολές, πολωμένο φως, απορρόφηση ή κάποιο άλλο είδος οπτικού σήματος. Έχουν επιτευχθεί αναλύσεις στην περιοχή μεταξύ 2 και 15 νανόμετρων, ανάλογα με την ποιότητα του άκρου και την καθορισμένη ένταση πεδίου. Ωστόσο, το δείγμα πρέπει να έχει αργά μεταβαλλόμενη τοπογραφία (χωρίς ξαφνικές κοιλάδες ή λόφους) προκειμένου να αποφευχθεί η σύγκρουση με τον ανιχνευτή και πιθανή ζημιά και στις δύο οντότητες. Ο Eric Betzig, συν-εφευρέτης του PALM, έλαβε την πρώτη εικόνα υπερανάλυσης ενός βιολογικού δείγματος το 1992 χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο σάρωσης κοντινού πεδίου. Τα τελευταία χρόνια, το NSOM έχει χρησιμοποιηθεί για τη διερεύνηση της οργάνωσης σε νανοκλίμακα αρκετών μεμβρανικών πρωτεϊνών, αλλά γενικά, αυτός ο τύπος προσέγγισης είναι δύσκολος και, όπως συζητήθηκε παραπάνω, δεν είναι κατάλληλος για ενδοκυτταρική απεικόνιση.

      Επιστροφή στην κορυφή ^ Βελτιώσεις αξονικής ανάλυσης: Μικροσκόπηση I 5 M και 4Pi

      Η παρεμβολή μεταξύ δύο ή περισσότερων πηγών φωτός διέγερσης μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή ενός περιοδικού σχεδίου φωτισμού στο επίπεδο δείγματος. Η αλληλεπίδραση αυτού του μοτίβου με τη λεπτομερή υποδομή ενός φθορίζοντος δείγματος παράγει εκπομπή που περιέχει πληροφορίες υψηλότερης ανάλυσης από αυτές που είναι διαθέσιμες με τη χρήση συμβατικών τεχνικών φωτισμού μικροσκοπίου. Εναλλακτικά, ένα παρόμοιο αποτέλεσμα ανάλυσης μπορεί να επιτευχθεί όταν η εκπομπή φθορισμού συγκεντρώνεται με διπλούς στόχους και συνδυάζεται για να παρεμποδίσει το επίπεδο εικόνας της κάμερας. Επομένως, στις περισσότερες περιπτώσεις, οι διαμορφώσεις μικροσκοπίου παρεμβολής συνδυάζουν δύο αντίθετους αντικειμενικούς φακούς που είναι τοποθετημένοι σε κάθε πλευρά του δείγματος (το οποίο βρίσκεται ανάμεσα σε λεπτές καλυπτρίδες, βλέπε Εικόνα 3(α)). Η χρήση δύο αντικειμένων αυξάνει το αριθμητικό διάφραγμα (επεκτείνει τη σταθερή γωνία του ανοίγματος) του μικροσκοπίου για να παράγει βελτιωμένη ανάλυση. Στην ιδανική περίπτωση, η χρήση δύο αντικειμενικών στόχων θα είχε ως αποτέλεσμα μια συνάρτηση διασποράς σημείου που είναι συμμετρική στις αξονικές και πλευρικές διαστάσεις. Παρόλο που τα ονόματα υποδηλώνουν τέλεια συμμετρία στη συνάρτηση διασποράς σημείου (μια πλήρης σφαίρα έχει σταθερή γωνία 4π), οι τεχνικές παρεμβολής και μικροσκοπίας 4Pi που συζητούνται παρακάτω προσεγγίζουν αλλά δεν φτάνουν ακριβώς αυτή τη γεωμετρία. Επιπλέον, επειδή η ποιότητα του σχεδίου παρεμβολής διαταράσσεται όταν ταξιδεύετε μέσα από παχείς ιστούς, αυτές οι τεχνικές γενικά περιορίζονται στη χρήση με λεπτά δείγματα, όπως προσκολλημένα κύτταρα.

      Η πρώτη σημαντική βελτίωση στην ανάλυση για μικροσκόπια περιορισμένης περίθλασης μακρινών πεδίων σημειώθηκε στα μέσα της δεκαετίας του 1990 με την εισαγωγή δύο τεχνικών γνωστών ως Παρεμβολή εικόνας και μικροσκοπία 4Pi. Και οι δύο αυτές μεθοδολογίες χρησιμοποιούν δύο αντιτιθέμενους υψηλούς αριθμητικούς στόχους διαφράγματος σε διαμορφώσεις συνεστιακού φθορισμού ευρέως πεδίου ή λέιζερ για να παρέχουν μεγάλη αύξηση (έως περίπου 100 νανόμετρα) στην αξονική ανάλυση (Εικόνα 3). Το μικροσκόπιο παρεμβολής εικόνας, που συχνά υποδηλώνεται με το ακρωνύμιο I n M , είναι μια τεχνική ευρέως πεδίου που χρησιμοποιεί τους αντιπαρατιθέμενους στόχους για την απεικόνιση του ίδιου επιπέδου δείγματος. Η απλούστερη έκδοση, I 2 M , συγκεντρώνει την εκπομπή φθορισμού και από τους δύο στόχους και ανασυνδυάζει τα σήματα σε μια κοινή διαδρομή φωτός στον ανιχνευτή. Λόγω του γεγονότος ότι η διαδρομή φωτός για κάθε δέσμη εκκίνησης είναι το ίδιο μήκος, η παρεμβολή των σημάτων παράγει ένα χαρακτηριστικό σχέδιο στο επίπεδο της εικόνας. Μια σειρά εικόνων που συγκεντρώνονται σε διαφορετικά εστιακά επίπεδα (σε βήματα περίπου 35 νανόμετρων) μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία μετά τη λήψη για την εξαγωγή των χωρικών πληροφοριών υψηλής ανάλυσης στην αξονική κατεύθυνση. Η πλευρική ανάλυση παραμένει αμετάβλητη.

      Σε μια τροποποίηση που θυμίζει μικροσκοπία φθορισμού στάσιμου κύματος (SWFM), η πιο προηγμένη τεχνική του I 3 M χρησιμοποιεί φωτισμό και από τους δύο στόχους για να παράγει μοτίβα διέγερσης που περιέχουν κόμβους και αντικόμβους στο εστιακό επίπεδο όπου οι δέσμες μπορούν να παρεμβαίνουν εποικοδομητικά. Λόγω του γεγονότος ότι το δείγμα φωτίζεται ομοιόμορφα σε ολόκληρο το οπτικό πεδίο, αλλά η διέγερση περιορίζεται στα αξονικά υποτμήματα, βελτιώνεται μόνο η αξονική ανάλυση. Ένας συνδυασμός των τεχνικών παρεμβολής εικόνας που περιγράφηκαν παραπάνω με την ονομασία I 5 M είναι ικανός να επιτύχει αξονικές αναλύσεις πάνω από τρεις φορές καλύτερες σε ομοεστιακές και επταπλάσιες καλύτερες σε λειτουργίες απεικόνισης ευρείας περιοχής. Επειδή όλες οι εικόνες συλλέγονται από ένα μεγάλο οπτικό πεδίο, η απόκτηση δεδομένων ανά καρέ είναι πολύ πιο γρήγορη από ό,τι είναι τυπικό των τεχνικών σάρωσης ομοεστιακών σημείων. Ωστόσο, για να διατηρηθεί η συχνότητα δειγματοληψίας που υπαγορεύεται από το κριτήριο Nyquist (δύο μετρήσεις ανά μονάδα ανάλυσης), οι αξονικές οπτικές τομές πρέπει να συλλαμβάνονται σε διαστήματα 35 έως 45 νανόμετρων. Έτσι, η συλλογή μιας στοίβας οπτικών τμημάτων μπορεί να απαιτήσει ακόμα αρκετά λεπτά. Οι μεγάλοι πλευρικοί λοβοί που παράγονται στη μικροσκοπία I 5 M (όπως φαίνεται στο Σχήμα 3(β)) έχουν περιορίσει τη χρήση της τεχνικής μόνο με σταθερά κύτταρα, επειδή το μέσο στήριξης υψηλού δείκτη διάθλασης είναι απαραίτητο για την απεικόνιση.

      Η τεχνική σχετικά υψηλής ανάλυσης της μικροσκοπίας 4Pi εκμεταλλεύεται επίσης αντίθετους στόχους, αλλά σε αντίθεση με το I 5 M, η σύγκλιση του φωτισμού διέγερσης λέιζερ παράγει μέτωπα κύματος που αθροίζονται συνεκτικά σε ένα κοινό εστιακό σημείο και όχι σε ολόκληρο το εστιακό επίπεδο. Σε ορισμένες εφαρμογές μικροσκοπίου 4Pi, τα σφαιρικά μέτωπα κύματος της εκπομπής φθορισμού αθροίζονται με συνοχή στον ανιχνευτή. Ως αποτέλεσμα, η εποικοδομητική παρεμβολή μετώπου κύματος αυξάνει την αξονική ανάλυση σε περίπου 100 νανόμετρα και δημιουργεί μια συνάρτηση διασποράς σημείου που είναι 1,5 φορές στενότερη από την ομοεστιακή μικροσκοπία στις πλευρικές διαστάσεις και επτά φορές χαμηλότερη στην αξονική διεύθυνση. Ωστόσο, λόγω του γεγονότος ότι το διευρυμένο μέτωπο κύματος δεν είναι ακόμα αρκετά σφαιρικό, το εστιακό σημείο εμφανίζει λοβούς στην αξονική διάσταση πάνω και κάτω από το εστιακό επίπεδο. Κατά συνέπεια, η μικροσκοπία 4Pi χρησιμοποιείται συχνά με διέγερση δύο φωτονίων, η οποία μειώνει το σήμα του λοβού λόγω του φαινομένου τετραγωνισμού (Εικόνα 3(γ)). Η μαθηματική αποσυνέλιξη των ακατέργαστων δεδομένων εικόνας είναι υποχρεωτική ή προαιρετική, ανάλογα με τη διαμόρφωση του μικροσκοπίου.

      Επιστροφή στην κορυφή ^ Η ιδέα RESOLFT

      Η θεωρητική βάση που είναι απαραίτητη για την επίτευξη ανάλυσης κάτω από το φράγμα περίθλασης, το οποίο στην πραγματικότητα αποτελείται από μια οικογένεια φυσικών εννοιών, προτάθηκε για πρώτη φορά από τον Stefan Hell και συνεργάζεται με την εισαγωγή της ιδέας των αναστρέψιμων κορεσμένων (ή εναλλάξιμων) μεταβάσεων οπτικού φθορισμού (RESOLFT). . Αυτό το σχήμα εστιάζει σε φθορίζοντες ανιχνευτές που μπορούν να εναλλάσσονται αναστρέψιμα μεταξύ μιας φθορίζουσας κατάστασης "ενεργοποίησης" και μιας σκοτεινής κατάστασης "απενεργοποίησης" (ή μεταξύ οποιωνδήποτε δύο καταστάσεων Α και Β). Η ακριβής φύση αυτών των καταστάσεων είναι μεταβλητή και μπορεί να είναι η βάση και η διεγερμένη μονήρη κατάσταση (S 0 και S 1) ενός φθοροφόρου όπως θα συζητηθεί παρακάτω για τη μικροσκοπία STED, τις καταστάσεις διεγερμένης μονής και σκοτεινής τριπλής που χρησιμοποιούνται στην εξάντληση της θεμελιώδους κατάστασης. GSD ) και μικροσκόπιο εξάντλησης βασικής κατάστασης-μεμονωμένης επιστροφής μορίου (GSDIM), ή τις φωτεινές και σκοτεινές καταστάσεις ενός αντιστρέψιμου φωτοεναλλάξιμου φθοροφόρου (όπως Cy5, φθορίζουσα πρωτεΐνη ανάφλεξης ή Dronpa). Αντίθετα, πολλές από τις φθορίζουσες πρωτεΐνες οπτικών επισημάνσεων, όπως οι Eos, Kaede, Dendra2 και PA-GFP, οι οποίες είναι σε θέση να φωτομετατρέπονται μόνιμα από το ένα εύρος ζώνης εκπομπής στο άλλο μέσω ομοιοπολικών μοριακών αλλοιώσεων στη ραχοκοκαλιά του πολυπεπτιδίου (και χρησιμεύουν ως θεμέλιο για τα πρώτα πειράματα PALM), δεν είναι κατάλληλοι ανιχνευτές για το RESOLFT επειδή οι αλλαγές στην κατάσταση φθορισμού δεν είναι αναστρέψιμες. Η ιδέα RESOLFT περιλαμβάνει επίσης καταστάσεις μεταγωγής ισομερισμού (όπως cis-trans) και άλλες οπτικά δισταθερές μεταβάσεις σε φθοροφόρα.

      Για οποιοδήποτε δεδομένο φθοροφόρο ή κατηγορία φθοριζόντων ανιχνευτών, ο αριθμός των εναλλασσόμενων καταστάσεων είναι αυστηρά περιορισμένος, επομένως δεν προκαλεί έκπληξη το γεγονός ότι πολλές από τις τεχνικές υπερανάλυσης RESOLFT και ενός μορίου που περιγράφονται παρακάτω βασίζονται σε παρόμοιους μηχανισμούς μεταγωγής φθοροφόρου. Προκειμένου να κατανοηθούν καλύτερα αυτές οι κοινές ιδιότητες, είναι χρήσιμη μια προσεκτική εξέταση των βασικών αρχών πίσω από τις ασυνάρτητα οδηγούμενες οπτικές μεταβάσεις. Όταν ένα μόριο φωτομεταβαίνει από τη μια κατάσταση στην άλλη, η πιθανότητα να παραμείνει το μόριο στην πρώτη κατάσταση μειώνεται εκθετικά με την αύξηση της έντασης του φωτός διέγερσης. Ο όρος ένταση κορεσμού χρησιμοποιείται για να ορίσει την ένταση φωτός στην οποία λαμβάνει χώρα η εναλλαγή μετάβασης (για παράδειγμα, όταν το 50 τοις εκατό των μορίων έχει μεταβεί από το σκοτάδι στο φωτεινό) και είναι αντιστρόφως ανάλογο με τους χρόνους ζωής των δύο καταστάσεων. Σε περιπτώσεις όπου η ένταση του φωτός διέγερσης υπερβαίνει την ένταση του κορεσμού, καθίσταται πολύ πιθανό ότι ένα από τα εισερχόμενα φωτόνια θα εκκινήσει τον φωτοδιακόπτη. Τα φθοροφόρα με μεγάλη διάρκεια ζωής στην αρχική και τελική κατάσταση μεταγωγής θα προσφέρουν μεγαλύτερο εύρος στην επιλογή των εντάσεων διέγερσης και συχνά παρουσιάζουν υψηλότερα επίπεδα κόπωσης (ένα μέτρο της ικανότητας επανειλημμένης φωτοδιακόπτη πριν καταστραφούν). Οι διάφοροι ανιχνευτές φθορισμού που χρησιμοποιούνται για τη μικροσκοπία υπερανάλυσης έχουν διάρκεια ζωής που διαφέρουν σημαντικά, όπως και η ένταση κορεσμού που απαιτείται για την επίκληση της φωτοεναλλαγής.

      Μεταξύ των διαφορών μεταξύ της έννοιας RESOLFT (που περιλαμβάνει τις σχετικές τεχνικές STED και GSD) και της μεθοδολογίας μονομορίου που χρησιμοποιείται από το PALM και το STORM είναι οι μηχανισμοί μεταγωγής και οι εντάσεις φωτός διέγερσης που απαιτούνται για τη φωτοδιακοπή των ανιχνευτών φθορισμού. Απαιτούνται εξαιρετικά υψηλές εντάσεις για την απενεργοποίηση της διεγερμένης μονής κατάστασης με STED (χρησιμοποιώντας αυτό που ονομάζεται λέιζερ εξάντλησης), αλλά η μετάβαση σε μια μετασταθερή τριπλέτα ή παρόμοια σκοτεινή κατάσταση (GSD) απαιτεί μια ένταση φωτός μεταξύ χιλίων και εκατομμυρίων φορές χαμηλότερη. Ομοίως, ακόμη χαμηλότερη ένταση διέγερσης είναι ικανή να εναλλάσσεται μεταξύ της μετασταθερής σκοτεινής και φωτεινής κατάστασης των φωτοεναλλασσόμενων φθοριζουσών πρωτεϊνών. Έτσι, οι τεχνικές εντοπισμού ενός μορίου μπορούν να φιλοξενήσουν λιγότερο ισχυρές πηγές φωτός ενώ παρέχουν πολύ μεγαλύτερα οπτικά πεδία. Προκειμένου να ληφθούν συντεταγμένες των μορίων με φωτοδιακοπή, συγκεκριμένες περιοχές του δείγματος είτε στοχεύονται με τον καθορισμό των περιοχών σάρωσης (STED, GSD, RESOLFT) είτε επιτρέπεται στα μεμονωμένα φθοροφόρα να ενεργοποιούνται και να απενεργοποιούνται στοχαστικά σε όλο το οπτικό πεδίο (PALM και STORM ). Οι διαφορετικοί παράγοντες που εμπλέκονται σε αυτές τις τεχνικές υπαγορεύουν πειραματικές παραμέτρους, όπως η ταχύτητα απεικόνισης, η πολυπλοκότητα του οργάνου και η ευαισθησία της ανίχνευσης.

      Στο Σχήμα 4 παρουσιάζονται αρκετές από τις πιο σημαντικές έννοιες που αφορούν την απεικόνιση υπερανάλυσης χρησιμοποιώντας τεχνικές RESOLFT. Ένα απλοποιημένο ενεργειακό διάγραμμα Jablonski (Εικόνα 4(α)) απεικονίζει τις πιθανές ηλεκτρονικές καταστάσεις γείωσης και διεγέρσεως που σχετίζονται με αναστρέψιμες οπτικές μεταβάσεις on-off, όπως η ισομέρεια cis - trans που σχετίζεται με φωτοεναλλάξιμες φθορίζουσες πρωτεΐνες (όπως απεικονίζεται στο σχήμα 4( γ) για τη φθορίζουσα πρωτεΐνη Kindling). Τα προφίλ λέιζερ εξάντλησης 1-5 στο Σχήμα 4(β) υπογραμμίζουν τη χωρική περιοχή στην οποία υπάρχει το φθοροφόρο στην κατάσταση Α (ή στην κατάσταση "ενεργό") σε περιοχές όπου το στάσιμο κύμα του φωτός εξάντλησης παρουσιάζει εντάσεις μεταξύ 10 (προφίλ 1) και 1000 (προφίλ 5) φορές την ένταση κορεσμού (όπως περιγράφεται στην Εξίσωση (3) ), και ένας κόμβος μηδέν στο xi . Καθώς η ένταση του λέιζερ εξάντλησης αυξάνεται, η περιοχή όπου το φθοροφόρο μπορεί να παραμείνει στην κατάσταση Α μειώνεται για να δημιουργήσει μια επακόλουθη αύξηση στην πλευρική ανάλυση. Μια τρισδιάστατη αναπαράσταση συρμάτινου πλαισίου (Εικόνα 4(δ)) των προφίλ λέιζερ εξάντλησης και διέγερσης απεικονίζει την τροποποίηση της συνάρτησης διασποράς σημείου με τεχνικές RESOLFT.

      Η στοχευμένη φωτοεναλλαγή του RESOLFT (όπως γενικεύεται για το STED και το GSD) εκτελείται ελέγχοντας χωρικά την κατανομή της έντασης του φωτός λέιζερ εξάντλησης έτσι ώστε μόνο ένας περιορισμένος αριθμός μορίων μπορεί να ενεργοποιηθεί ενώ η πλειονότητα των άλλων παραμένει σε κατάσταση απενεργοποίησης. Έτσι, όταν επιλέγεται ένα συγκεκριμένο μήκος κύματος με καθορισμένη ένταση (που είναι πολύ υψηλότερη από την ένταση κορεσμού) για να απενεργοποιηθεί το φθοροφόρο, η εφαρμογή αυτού του φωτός με χωρικά διαμορφωμένο τρόπο χρησιμοποιείται για να περιοριστούν τα φθοροφόρα που παραμένουν σε κατάσταση ενεργοποίησης σε απότομη καθορισμένη περιοχή. Η ανάλυση (πλήρες πλάτος στο μισό μέγιστο FWHM ) για τη συνάρτηση διασποράς σημείου που χρησιμοποιεί αυτές τις τεχνικές ορίζεται επομένως από την ακόλουθη εξίσωση:

      όπου λ είναι το μήκος κύματος του φωτός διέγερσης και ο συνδυασμένος όρος η • sin(α) είναι το αντικειμενικό αριθμητικό άνοιγμα, όπως περιγράφεται παραπάνω για τον κλασικό τύπο Abbe ( Εξίσωση (1) ). Η μεταβλητή a είναι μια παράμετρος που λαμβάνει υπόψη το σχήμα της χωρικά διαμορφωμένης δέσμης λέιζερ εξάντλησης, η οποία συχνά εκδηλώνεται με τη μορφή ενός σχήματος γραμμής ή ενός "ντόνατ" που έχει έναν κεντρικό μηδενικό κόμβο (βλ. Εικόνα 4(β)). Κάτω από την τετραγωνική ρίζα, I max είναι η μέγιστη ένταση του λέιζερ εξάντλησης και I s είναι η ένταση κορεσμού για το φθοροφόρο που απεικονίζεται. Σε περιπτώσεις όπου το I max ισούται με μηδέν, η εξίσωση (3) μειώνεται στο όριο περίθλασης Abbe. Αντίθετα, όταν το I max είναι πολύ μεγαλύτερο από την ένταση κορεσμού φθοροφόρου (στην πραγματικότητα, η τιμή της τετραγωνικής ρίζας αυξάνεται), η συνάρτηση διασποράς σημείου γίνεται πολύ στενή και επιτυγχάνεται υπερδιάκριση. Για παράδειγμα, όταν το μέγιστο / I s ισούται με 100, η ​​βελτίωση στην ανάλυση είναι περίπου δεκαπλάσια. Έτσι, σε συμφωνία με τη θεωρία, η διακριτική ικανότητα υποδιάθλασης κάτω από τις οριακές κλίμακες Abbe με την τετραγωνική ρίζα της έντασης του φωτός να εξαντλεί τη θεμελιώδη κατάσταση. Η ανάλυση όλων των μεθόδων που βασίζονται στη στοχευμένη ανάγνωση των ανιχνευτών φθορισμού, συμπεριλαμβανομένων των RESOLFT, STED, GSD και SSIM, διέπεται από την Εξίσωση (3) ανεξάρτητα από τον μηχανισμό εναλλαγής φθοροφόρου ή τις γεωμετρικές παραμέτρους χωρικής διαμόρφωσης (ντόνατ ή γραμμή) που υπαγορεύονται από τη διαμόρφωση του μικροσκοπίου.

      Οι τεχνικές RESOLFT απαιτούν τη σάρωση του δείγματος με μηδενικό κόμβο στο πεδίο λέιζερ εξάντλησης, αλλά όχι απαραίτητα με χρήση μίας δέσμης ή μηδενικής περιοχής που περιορίζεται γεωμετρικά σε ένα σημείο. Πολλαπλές σκοτεινές γραμμές ή μηδενικά μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν σε συνδυασμό με έναν συμβατικό ανιχνευτή ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής με συστοιχία περιοχής (CCD), υπό την προϋπόθεση ότι τα μηδενικά ή οι σκοτεινές γραμμές απέχουν περισσότερο από την ελάχιστη απόσταση που απαιτείται από το όριο ανάλυσης περίθλασης. Η σάρωση μόνο με σκοτεινές γραμμές αυξάνει την ανάλυση σε μία μόνο πλευρική κατεύθυνση, αλλά η επαναλαμβανόμενη σάρωση μετά την περιστροφή του μοτίβου που ακολουθείται από μαθηματική αποσυνέλιξη μπορεί να παρέχει ανάλυση υπο-περιθλάσεως κατά μήκος του πλευρικού άξονα. Η βασική απαίτηση για τη σάρωση του δείγματος είναι ο λόγος για τον οποίο οι μεταβάσεις RESOLFT (A/B ή on/off) πρέπει να είναι αναστρέψιμες. Τα μόρια σε μια κατάσταση πρέπει να μπορούν να επιστρέψουν στην άλλη τους κατάσταση όταν σαρώνονται από τον κόμβο μηδέν. Σημειώστε ότι η κορεσμένη εξάντληση των μορίων στη διεγερμένη κατάσταση χρησιμοποιώντας ένα εστιακό σημείο μηδενικού κόμβου παράγει μια συνάρτηση εξάπλωσης σημείου υπερανάλυσης που δεν περιορίζεται από το μήκος κύματος αλλά μόνο από την ένταση του λέιζερ εξάντλησης.

      Ένα άλλο ελκυστικό χαρακτηριστικό της ιδέας RESOLFT είναι ότι ο απλούστερος μηχανισμός για την πραγματοποίηση μιας κορεσμένης οπτικής μετάβασης είναι η έντονη διέγερση του φθοροφόρου σε κάτι που μπορεί να θεωρηθεί «αντίστροφη» εφαρμογή της προσέγγισης. Σε αυτή την περίπτωση, η βασική κατάσταση ( S 0 ) εξαντλείται και το φθοροφόρο αναμένεται να παραμείνει σε μεγάλο βαθμό στη φθορίζουσα κατάσταση ( S 1 ). Οι ίδιες αρχές RESOLFT που συζητήθηκαν παραπάνω εξακολουθούν να ισχύουν, εκτός από το ότι η αντίστροφη κατάσταση είναι πλέον φθορίζουσα έτσι ώστε να δημιουργούνται πολύ καθορισμένες σκοτεινές περιοχές που περιβάλλονται από έντονα φθορίζουσες περιοχές. Το αποτέλεσμα είναι μια "αρνητική" εικόνα των λεπτομερειών του δείγματος, η οποία μπορεί στη συνέχεια να αναστραφεί για να δημιουργήσει την τελική εικόνα μέσω μαθηματικής επεξεργασίας μετά την απόκτηση. Οι σκοτεινές περιοχές μπορεί να είναι είτε γραμμές που δημιουργούνται από μοτίβα παρεμβολής είτε τρισδιάστατα ντόνατ. Στην περίπτωση των ντόνατ, το αποτέλεσμα θα ήταν σκοτεινοί τρισδιάστατοι όγκοι που περιορίζονται από τοιχώματα έντονου φθορισμού. Η μικροσκοπία κορεσμένου δομημένου φωτισμού ( SSIM ) και διέγερσης κορεσμένου σχεδίου ( SPEM ) χρησιμοποιούν αυτήν την προσέγγιση με γεωμετρίες σε σχήμα γραμμής για την επίτευξη εικόνων υπερανάλυσης. Ο πρωταρχικός περιορισμός της τεχνικής αντίστροφου RESOLFT είναι οι υποχρεωτικοί υπολογισμοί και η υψηλή αναλογία σήματος προς θόρυβο που απαιτούνται για να ληφθεί η τελική εικόνα.

      Στο Σχήμα 5 παρουσιάζονται εικόνες υψηλής ανάλυσης σφαιριδίων φθορισμού 50 νανομέτρων μαζί με προφίλ έντασης που δημιουργούνται από ένα ομοιόμορφο στρώμα φθορίζουσας χρωστικής που φωτίζεται από μια δέσμη Gaussian διαμορφωμένη με μοτίβο γραμμής σε κορεσμένο δομημένο μικροσκόπιο φωτισμού. Στη μικροσκοπία ευρέως πεδίου τα φθορίζοντα σφαιρίδια παρουσιάζουν κακή ανάλυση (Εικόνα 5(α)) και εμφανίζονται ως θολή μάζα. Το μαθηματικό φιλτράρισμα της εικόνας ευρέως πεδίου (Εικόνα 5(β)) προκαλεί ελάχιστη βελτίωση, αλλά ο γραμμικός δομημένος φωτισμός (Εικόνα 5(γ)) αποδίδει υψηλότερη ανάλυση. Η πιο εντυπωσιακή αύξηση στην πλευρική ανάλυση επιτυγχάνεται με το SSIM (Εικόνα 5(δ)) χρησιμοποιώντας τρεις αρμονικές τάξεις (Εικόνες 5(ε) και (στ)) κατά την επεξεργασία εικόνας. Τα προφίλ έντασης μέσω εικόνων του λεπτού στρώματος της φθορίζουσας βαφής με περίοδο διαμόρφωσης 2,5 μικρομέτρων φαίνονται στο Σχήμα 5(ε) σε υψηλή (κόκκινη καμπύλη) και χαμηλή (κίτρινη καμπύλη) μέγιστες ενεργειακές πυκνότητες. Η κάτω καμπύλη ακολουθεί πιστά το ημιτονοειδές μοτίβο φωτισμού επειδή η μέγιστη ενεργειακή πυκνότητα βρίσκεται κάτω από το όριο κορεσμού. Στην κορυφαία καμπύλη, η υψηλότερη ενέργεια παλμού προκαλεί φθορισμό για κορεσμό κοντά στις κορυφές. Οι μετασχηματισμοί Fourier (Εικόνα 5(στ)) που αντιστοιχούν στα μοτίβα φωτισμού στο Σχήμα 5(ε) παρουσιάζουν αρκετές αρμονικές που παράγονται από τη μη γραμμικότητα της έντασης κορεσμού φωτισμού (κόκκινη καμπύλη), ενώ μόνο η χαμηλότερη αρμονική είναι ανιχνεύσιμη στο χαμηλότερο ενεργειακό μοτίβο (κίτρινη καμπύλη).

      Η έντονη διέγερση που απαιτείται για πολλές από τις τεχνικές RESOLFT διακυβεύεται από το γεγονός ότι οι υψηλές εντάσεις λέιζερ προκαλούν συχνά υπερβολικούς ρυθμούς φωτολεύκανσης, έτσι ώστε τα φθοροφόρα πρέπει να επιλέγονται προσεκτικά. Επομένως, αν και η οικογένεια των μεθόδων RESOLFT δεν υπόκειται στο παραδοσιακό φράγμα περίθλασης, η εξάρτηση της έντασης του λέιζερ από το κέρδος ανάλυσης εγκαθιστά ένα άλλο φράγμα που διέπεται από την ισχύ λέιζερ που μπορεί να ανεχτεί το φθοροφόρο. Η καλύτερη λύση για αυτό το δίλημμα είναι να αφαιρέσετε την ανάγκη για ισχυρές εντάσεις εφαρμόζοντας μοριακές μεταβάσεις που συμβαίνουν με τις δυνάμεις λέιζερ χαμηλής εξάντλησης. Πολλοί δισταθεροί φθορίζοντες ανιχνευτές πληρούν αυτό το κριτήριο και μπορούν να εναλλάσσονται οπτικά μεταξύ φθορίζουσας και μη φθορίζουσας κατάστασης μέσω μηχανισμών χαμηλής ενέργειας όπως ο φωτοεπαγόμενος ισομερισμός cis - trans (Εικόνα 4(γ)). Σε περιπτώσεις όπου και οι δύο καταστάσεις είναι σταθερές, η οπτική μετάβαση εμπρός και πίσω μεταξύ των καταστάσεων μπορεί να ολοκληρωθεί σε αυθαίρετες ή πολύ μεγάλες χρονικές κλίμακες, επιτρέποντας στον φωτισμό να απλώνεται έγκαιρα και μειώνοντας την απαιτούμενη ένταση (καθώς και φωτολεύκανση τεχνουργήματα) κατά πολλές τάξεις μεγέθους. Μια τέτοια στρατηγική επέτρεψε την παραλληλοποίηση των μεθόδων RESOLFT για να επιτραπεί η χρήση τους σε απεικόνιση ευρείας περιοχής μεγάλης περιοχής. Σημειώστε ότι όπως περιγράφηκε παραπάνω, μία από τις κύριες ιδέες πίσω από το RESOLFT είναι ότι η απεικόνιση υπερανάλυσης δεν απαιτεί απαραίτητα εξαιρετικά υψηλές εντάσεις φωτός.

      Επιστροφή στην κορυφή ^ Superresolution από την PSF Engineering

      Οι τεχνικές μηχανικής διασποράς σημείου που έχουν σχεδιαστεί για να παρακάμπτουν το φράγμα περίθλασης βασίζονται όλες σε μια χρονική διαδοχική ανάγνωση της φωτοεναλλαγής ανιχνευτών φθορισμού. Η πρώτη τεχνική που εφαρμόστηκε με επιτυχία στη βιολογική απεικόνιση υπερανάλυσης σταθερών κυττάρων ήταν η μέθοδος RESOLFT που ονομάζεται διεγερμένη εξάντληση εκπομπών (STED). Όπως συζητήθηκε παραπάνω, το STED χρησιμοποιεί χωρικά διαμορφωμένες και κορεσμένες μεταβάσεις μεταξύ δύο μοριακών καταστάσεων για να δημιουργήσει βελτιώσεις στη συνάρτηση διασποράς σημείου. Στη μικροσκοπία STED, το δείγμα φωτίζεται από δύο συγχρονισμένες υπερταχείς συγγραμμικές πηγές που αποτελούνται από έναν παλμό λέιζερ διέγερσης που ακολουθείται από έναν παλμό λέιζερ εξάντλησης μετατοπισμένου με κόκκινο χρώμα που αναφέρεται ως δέσμη STED (βλ. Εικόνα 6). Γενικά, το πλάτος του παλμού λέιζερ διέγερσης είναι μικρότερης διάρκειας από αυτό του παλμού STED (αν και και τα δύο είναι συνήθως στην περιοχή από 10 έως 300 picosecond). Τα παλμικά λέιζερ εκμεταλλεύονται τις χρονικές κλίμακες για μοριακή χαλάρωση και παρεμβολή συνεκτικού φωτός για να παράγουν ακτινικά συμμετρικές ζώνες εξάντλησης. Τα φθοροφόρα που βρίσκονται στην περιοχή μηδέν κόμβου της δέσμης STED αφήνονται να φθορίζουν κατά την έκθεση στη δέσμη διέγερσης, ενώ εκείνα τα φθοροφόρα που εκτίθενται στη δέσμη STED μεταφέρονται πίσω στη γη (μη φθορίζουσα) κατάστασή τους μέσω διεγερμένης εκπομπής (Εικόνα 6 (σι)). Η μη γραμμική εξάντληση (ακολουθώντας μια εκθετική καμπύλη) της διεγερμένης κατάστασης φθορισμού από τη δέσμη STED αποτελεί τη βάση για την απεικόνιση σε αναλύσεις που είναι κάτω από το φράγμα περίθλασης.

      Το STED εκμεταλλεύεται την ιδέα RESOLFT τροποποιώντας σημαντικά το σχήμα της συνάρτησης εξάπλωσης σημείου διέγερσης χειραγωγώντας τη φάση, το πλάτος του παλμού και την ένταση των λέιζερ διέγερσης και εξάντλησης. Αν και και τα δύο λέιζερ παραμένουν περιορισμένα σε περίθλαση καθώς οι ακτίνες τους περνούν μέσα από το οπτικό συρμό μικροσκοπίου, ο παλμός STED τροποποιείται από έναν διαμορφωτή φάσης για να διαθέτει έναν κόμβο μηδενικής έντασης στο κέντρο της εστίασης με εκθετικά αυξανόμενη ένταση προς την περιφέρεια. Αυτή η διαμόρφωση δημιουργεί μια δέσμη σε σχήμα ντόνατ που περιβάλλει το κεντρικό σημείο εστίασης (και τη λειτουργία διασποράς σημείου) του λέιζερ διέγερσης. Μόνο στο ακριβές κέντρο εστίασης (τον κόμβο) η ένταση της δέσμης STED είναι ίση με μηδέν (Εικόνα 6(β)). Το μήκος κύματος και η διάρκεια του παλμού δέσμης STED επιλέγονται έτσι ώστε να συμπίπτουν με τη μέγιστη εκπομπή και την ένταση κορεσμού, αντίστοιχα, του φθοροφόρου υπό διερεύνηση. Η απενεργοποίηση των φθοροφόρων λαμβάνει χώρα σε όλο τον εστιακό όγκο εκτός από το κέντρο της εστίασης. Στις δυνάμεις λέιζερ υψηλής εξάντλησης που χρησιμοποιούνται για το STED (συχνά υπερβαίνουν τα 250 μεγαβάτ ανά τετραγωνικό εκατοστό), τα φθοροφόρα σχεδόν ακαριαία οδηγούνται στη βασική κατάσταση μέσω διεγερμένης εκπομπής. Η ουσιαστική μείωση της ισχύος του λέιζερ (όπως συζητείται παρακάτω) επιτρέπει το σχηματισμό μιας μη φθορίζουσας κατάστασης μέσω ορισμένων άλλων μηχανισμών, συμπεριλαμβανομένης της οδήγησης των φθοροφόρων σε μια μετασταθερή τριπλέτα κατάσταση, του σχηματισμού καταστάσεων μεταφοράς φορτίου ή της φωτοεναλλαγής.

      Μια τυπική διαμόρφωση οπτικού συρμού STED παρουσιάζεται στο Σχήμα 6(α) που δείχνει την πλάκα φάσης, τα λέιζερ διέγερσης και εξάντλησης (κόκκινες και πράσινες δέσμες, αντίστοιχα), τα διχρωματικά κάτοπτρα, τον σωληνωτό φακό και τον αντικειμενικό φακό. Εμφανίζεται επίσης ένα τρισδιάστατο σχέδιο που δείχνει τα προφίλ δέσμης STED στο επίπεδο δείγματος. Η διέγερση και η εξάντληση επιτυγχάνονται με συγχρονισμένους παλμούς λέιζερ που εστιάζονται από τον αντικειμενικό στόχο στο επίπεδο του δείγματος. Η εκπομπή φθορισμού καταγράφεται σε έναν ανιχνευτή φωτοπολλαπλασιαστή (δεν φαίνεται). Τα εστιακά σημεία που παράγονται από τα λέιζερ STED και εξάντλησης προσομοιώνονται ως πράσινα και κόκκινα σχέδια, αντίστοιχα, στο Σχήμα 6(β). Το πράσινο σημείο διέγερσης λέιζερ τοποθετείται πάνω στο κόκκινο προφίλ λέιζερ εξάντλησης STED για να μειώσει δραματικά το μέγεθος της αποτελεσματικής συνάρτησης διασποράς σημείου. Σύγκριση εικόνων ευρέως πεδίου (Εικόνα 6(γ)) και STED (Εικόνα 6(δ)) μικροσωληνίσκων που χρωματίστηκαν με Alexa Fluor 594 καταδεικνύουν την αυξημένη χωρική ανάλυση που παρέχεται από τη μεθοδολογία μηχανικής συνάρτησης διασποράς σημείου.

      Το πεδίο κύματος λέιζερ εξάντλησης σε σχήμα ντόνατς στο STED περιορίζει αποτελεσματικά τη συνάρτηση διασποράς σημείου του λέιζερ διέγερσης για να αυξήσει την ανάλυση πέρα ​​από το όριο περίθλασης, το οποίο στις καλύτερες περιπτώσεις μπορεί να προσεγγίσει τα 20 νανόμετρα στην πλευρική διάσταση. Η όξυνση του εστιακού σημείου μέσω της μηχανικής λειτουργίας σημειακής εξάπλωσης είναι επομένως ισοδύναμη με την επέκταση της ζώνης διέλευσης χωρικής συχνότητας του μικροσκοπίου. Προκειμένου να ληφθεί μια πλήρης εικόνα, το κεντρικό μηδέν που παράγεται από τα λέιζερ STED σαρώνεται με ράστερ σε όλο το δείγμα, παρόμοια με τη δράση ενός ομοεστιακού μικροσκοπίου. Μεταξύ των πλεονεκτημάτων της μικροσκοπίας STED είναι ότι η αποτελεσματική αύξηση της ανάλυσης υπαγορεύεται πλήρως από την πειραματική διαμόρφωση και τις δυνάμεις λέιζερ που εφαρμόζονται στο δείγμα. Επιπλέον, η εικόνα καταγράφεται καθώς η δέσμη σαρώνει κατά μήκος του δείγματος και δεν απαιτεί πρόσθετη επεξεργασία και οι χρόνοι λήψης εικόνας μπορούν να πλησιάσουν την ταχύτητα οποιουδήποτε ομοεστιακού μικροσκοπίου σάρωσης λέιζερ. Η αποτελεσματική αύξηση της ανάλυσης με το STED είναι ανάλογη με την ισχύ του λέιζερ εξάντλησης, αλλά μπορεί να γίνει προβληματική σε εξαιρετικά υψηλές δυνάμεις λέιζερ που είναι πιθανό να οδηγήσουν σε ταχεία φωτολεύκανση και καταστροφή του καθετήρα. Ανεξάρτητα, ένα ευρύ φάσμα φθοροφόρων έχει χρησιμοποιηθεί με επιτυχία με το STED (βλ. Πίνακα 1), συμπεριλαμβανομένων των φθοριζουσών πρωτεϊνών, των χρωστικών ATTO, των Alexa Fluors, του DyLights και πολλών άλλων συνθετικών.

      Προηγμένες εκδόσεις του STED έχουν εφαρμοστεί για την αντιμετώπιση βελτιώσεων στην αξονική ανάλυση για τρισδιάστατη απεικόνιση υπερανάλυσης συνόλων. Με τη σύζευξη δύο λέιζερ εξάντλησης STED με μια αντίθετη αντικειμενική διαμόρφωση τύπου 4Pi, ο Stefan Hell και οι συνεργάτες του κατάφεραν να δημιουργήσουν σημαντικά βελτιωμένη ανάλυση τόσο στην πλευρική όσο και στην αξονική διάσταση. Η τεχνική έχει ονομαστεί iso-STED λόγω του γεγονότος ότι αποδίδει μια συντονίσιμη, σχεδόν ισοτροπική (σφαιρική) συνάρτηση διασποράς σημείου με ανάλυση που πλησιάζει τα 40 νανόμετρα κατά μήκος των αξόνων. Ένα τέτοιο συμμετρικό εστιακό σημείο θα πρέπει να αποδειχθεί ευεργετικό για τη λήψη οπτικών τμημάτων υψηλής ανάλυσης από βαθιά μέσα σε βιολογικά κύτταρα και ιστούς. Η σύνθετη διαμόρφωση οργάνων αποτελείται από διπλά λέιζερ STED που συνδυάζονται και αποστέλλονται και στους δύο στόχους χρησιμοποιώντας έναν διαχωριστή δέσμης. Η ψηφιακή επεξεργασία εικόνας μπορεί επιπλέον να χρησιμοποιηθεί για τη μείωση της επίδρασης των πλευρικών λοβών και άλλων τεχνουργημάτων που θέτουν σε κίνδυνο τη λειτουργία εξάπλωσης σημείου.Ένα πιο συμπαγές και απλούστερο όργανο STED που βασίζεται σε πηγή λέιζερ υπερσυνέχειας έχει σχεδιαστεί για τρισδιάστατη απεικόνιση χρησιμοποιώντας έναν μόνο φακό για τη συλλογή οπτικών τμημάτων σε πλευρική ανάλυση 45 νανόμετρων και αξονική ανάλυση περίπου 100 νανόμετρα.

      Ιδιότητες επιλεγμένων ανιχνευτών φθορισμού για μικροσκοπία STED


      Φθοριοφόρο Πρώην λ
      (nm)
      Πλάτος παλμού
      (picoseconds)
      STED λ
      (nm)
      Πλάτος παλμού
      (picoseconds)
      Ανάλυση
      (πλευρικά nm)
      Συνθετικές Βαφές
      ΑΤΤΟ 425 440 130 532 1000 70-80
      ΑΤΤΟ 565 532 90 640 90 30-40
      ΑΤΤΟ 663 635 100 750 200 40
      Alexa Fluor 594 570 90 700 90 60
      DyLight 594 570 90 700 90 60
      RH 414 554 0.25 745 13 30
      Φθορίζουσες πρωτεΐνες
      EGFP 490 100 575 200 70
      Κιτρίνη 490 100 598 300 50
      ΕΥΦΠ 490 100 598 300 70

      Τραπέζι 1

      Οι ίδιες αρχές RESOLFT που περιγράφονται παραπάνω για τη μικροσκοπία STED ισχύουν και για τη μικροσκοπία εξάντλησης θεμελιώδους κατάστασης (GSD), όπου ο ανιχνευτής φθορισμού φωτοδιαβιβάζεται επίσης σε κατάσταση απενεργοποίησης χρησιμοποιώντας ένα λέιζερ που διαθέτει έναν κεντρικό μηδενικό κόμβο. Στο GSD, ο μηχανισμός φωτοεναλλαγής περιλαμβάνει την παροδική τοποθέτηση του φθοροφόρου σε μια μετασταθερή σκοτεινή τριπλή κατάσταση (Τ 1). Οι ηλεκτρονικές μεταβάσεις σε μετασταθερά επίπεδα ενέργειας τυπικά «απαγορεύονται» από τους κανόνες επιλογής ηλεκτρικού διπόλου λόγω της απαίτησης ενός περιστροφικού περιστροφής, πράγμα που σημαίνει ότι συμβαίνουν μόνο με πολύ χαμηλή πιθανότητα. Ανεξάρτητα, η κατάσταση τριπλής μπορεί να συμπληρωθεί διεγείροντας επαναλαμβανόμενα το φθοροφόρο στην πρώτη διεγερμένη μονήρη κατάσταση (S 1 ) για να αυξηθεί η πιθανότητα μιας μη ακτινοβολούμενης διασταύρωσης από το S 1 στο T 1 . Τα ηλεκτρόνια παραμένουν σε μετασταθερή κατάσταση για σχετικά μεγάλες διάρκειες, οι οποίες μπορεί να κυμαίνονται από μικροδευτερόλεπτα έως χιλιοστά του δευτερολέπτου. Η ισχύς λέιζερ εξάντλησης που απαιτείται για να οδηγηθούν τα φθοροφόρα στην κατάσταση τριπλής (συνήθως αρκετά κιλοβάτ ανά εκατοστό στο τετράγωνο) είναι σημαντικά μικρότερη από αυτή που απαιτείται για τη μικροσκοπία STED.

      Μεταξύ των μεγαλύτερων προκλήσεων για την εφαρμογή της μικροσκοπίας GSD είναι η επιλογή κατάλληλων ανιχνευτών φθορισμού λόγω της πιθανής εμπλοκής φθοριζόντων σκοτεινών καταστάσεων στη φωτολεύκανση. Επιπλέον, εκείνα τα φθοροφόρα που μπορούν να οδηγηθούν αποτελεσματικά στην τριπλή κατάσταση πρέπει να μπορούν να ανακάμψουν μετά την αφαίρεση του λέιζερ εξάντλησης. Η ανάκτηση φθορισμού είναι κρίσιμης σημασίας επειδή η GSD βασίζεται στη σάρωση του δείγματος με τρόπο παρόμοιο με την ομοεστιακή και τη μικροσκοπία STED. Εν ολίγοις, τα φθοροφόρα που παγιδεύονται στην τριπλή κατάσταση πρέπει να μπορούν να χαλαρώσουν στη βασική κατάσταση πριν η δέσμη εξάντλησης μετακινηθεί στην επόμενη χωρική θέση. Έτσι, στο μικροσκόπιο GSD πρέπει να υπάρχει μια λεπτή ισορροπία μεταξύ του χρόνου οπτικού ραφιού, του ρυθμού διέλευσης μεταξύ των συστημάτων και της δραστηριότητας φωτολεύκανσης. Ο αριθμός των πιθανών φθοροφόρων και οι επιδείξεις απεικόνισης GSD έχουν περιοριστεί, αλλά θεωρητικά υπάρχουν πολλοί φθορίζοντες ανιχνευτές που θα μπορούσαν να απεικονιστούν με επιτυχία χρησιμοποιώντας αυτήν την τεχνική.

      Παρόμοια με το STED, το λέιζερ εξάντλησης στο μικροσκόπιο GSD διαμορφώνεται με μια ελικοειδή ράμπα φάσης σε ένα κυκλικά πολωμένο μέτωπο κύματος για να δημιουργήσει μια γεωμετρία που μοιάζει με ντόνατ με μηδενικό κόμβο στο κέντρο. Η σάρωση ράστερ του δείγματος με υπερτιθέμενα λέιζερ (διέγερση και εξάντληση) δημιουργεί εικόνες με ανάλυση υπο-διάθλασης. Σημειώστε ότι υπάρχει πιθανότητα τα φθοροφόρα να τοποθετηθούν σε άλλες σκοτεινές καταστάσεις (εκτός από τη μετασταθερή τριπλέτα) χρησιμοποιώντας μικροσκοπία GSD, αλλά η τεχνική θα εξακολουθεί να παράγει εικόνες εξαιρετικής υψηλής ανάλυσης, υπό την προϋπόθεση ότι τα φθοροφόρα είναι τελικά σε θέση να επιστρέψουν στη βασική κατάσταση. Η ικανότητα εκμετάλλευσης του κορεσμού της τριπλής κατάστασης με GSD χρησιμοποιώντας πολύ χαμηλότερες δυνάμεις λέιζερ εξάντλησης πηγάζει από τη διάρκεια ζωής του χιλιοστού του δευτερολέπτου της σκοτεινής κατάστασης. Επιπλέον, τα χαμηλά επίπεδα φωτός που χρησιμοποιούνται από το μικροσκόπιο GSD διευκολύνουν τη χρήση ψηφιακών φωτογραφικών μηχανών όταν η απεικόνιση διεξάγεται με μια παραλληλισμένη διάταξη μηδενικής έντασης. Η τοποθέτηση οπτικών ραφιών στην τριπλή κατάσταση έχει αποδειχθεί σε κοινούς συνθετικούς ανιχνευτές, όπως βαφές ATTO, ροδαμίνη, καρβοκυανίνες, Alexa Fluors, BODIPY και φλουορεσκεΐνη. Μεταξύ των μέσων απεικόνισης που βρέθηκε ότι είναι χρήσιμα για το GSD είναι η πολυβινυλική αλκοόλη, οι υδατικοί διαλύτες και αρκετές εμπορικά διαθέσιμες συνθέσεις μέσων στερέωσης.

      Στο σχήμα 7 απεικονίζονται οι αποτελεσματικές συναρτήσεις σημειακής εξάπλωσης (Εικόνα 7(α)), οι πυκνότητες πληθυσμού των ηλεκτρονικών διεγερμένων καταστάσεων (Εικόνα 7(β)) και οι τυπικές εικόνες (Εικόνες 7(γ) έως 7(στ)) για μικροσκοπία ευρέως πεδίου και GSD. Καθώς η ισχύς του λέιζερ εξάντλησης αυξάνεται στη λειτουργία GSD από ένα σε 100 milliwatts (Εικόνα 7(α)), η αποτελεσματική συνάρτηση διασποράς σημείου μειώνεται σε πλήρες πλάτος στο μισό το μέγιστο των 90 νανόμετρων, 33 νανομέτρων και 12 νανόμετρων, αντίστοιχα. Η πληθυσμιακή πιθανότητα της θεμελιώδους κατάστασης (S 0, κόκκινη καμπύλη) έναντι της πρώτης διεγερμένης μονής κατάστασης (S 1, πράσινη καμπύλη) και της απαγορευμένης τριπλής κατάστασης (T 1, μπλε καμπύλη) ως συνάρτηση της έντασης διέγερσης λέιζερ για ένα παραδοσιακό φθοροφόρο (φλουορεσκεΐνη) παρουσιάζεται στο Σχήμα 7(β). Σημειώστε τη δραματική αύξηση του πληθυσμού της τριπλής κατάστασης καθώς αυξάνεται η ισχύς του λέιζερ. Οι εικόνες φθοριζόντων σφαιριδίων σε φθορισμό ευρέως πεδίου (Εικόνα 7(γ)) και με GSD (Εικόνα 7(δ)) καταδεικνύουν τη δραματική βελτίωση στην ανάλυση, όπως και οι εικόνες μικροσωληνίσκων (Εικόνα 7(ε), ευρύ πεδίο και Εικόνα 7(στ) , GSD) επισημασμένο με ένα συνθετικό φθοροφόρο.

      Στις τεχνικές μη γραμμικού δομημένου φωτισμού που ονομάζονται μικροσκοπία διέγερσης κορεσμένου σχεδίου (SPEM) και μικροσκοπία κορεσμένου δομημένου φωτισμού (SSIM), η θεμελιώδης κατάσταση (S 0) εξαντλείται από κορεσμένη διέγερση (στην κατάσταση S 1) μέσω ενός σχήματος αντίστροφου RESOLFT που επιτρέπει στον φθορισμό που δημιουργείται από αυτή τη μετάβαση να καταγραφεί σε έναν ανιχνευτή διάταξης περιοχής. Αυτές οι τεχνικές εκτελούνται χρησιμοποιώντας μια συστοιχία πλέγματος με μέγιστα και ελάχιστα έντασης σε σχήμα γραμμής αντί της τυπικής διαμόρφωσης φάσης σε σχήμα ντόνατ που χρησιμοποιείται από το STED και το GSD. Η κορεσμένη διέγερση παράγει στενές σκοτεινές περιοχές σε σχήμα γραμμής στους μηδενικούς κόμβους που περιβάλλονται από υψηλά επίπεδα σήματος φθορισμού για να δημιουργήσουν ένα «αρνητικό» αποτύπωμα των χαρακτηριστικών που απεικονίζονται. Έτσι, στο SPEM και στο SSIM, είναι η κατάσταση εκτός λειτουργίας ενός φθορίζοντος καθετήρα (και όχι η κατάσταση ενεργοποίησης) που περιορίζεται από τον κόμβο μηδενικής διαμόρφωσης φάσης. Οι γραμμές πλέγματος περιστρέφονται πολλές φορές για τη δημιουργία δεδομένων για μια μεμονωμένη εικόνα, η οποία ανακτάται μαθηματικά κατά την επεξεργασία μετά την απόκτηση.

      Στο SSIM και το SPEM, ο δομημένος φωτισμός παράγεται από δύο ισχυρές παρεμβαλλόμενες δέσμες φωτός από ένα μόνο λέιζερ που σχηματίζουν ένα μοτίβο πλέγματος στάσιμου κύματος που προβάλλεται στις πλευρικές διαστάσεις του δείγματος. Μόνο οι πρώτες τάξεις περίθλασης (+1 και -1) χρησιμοποιούνται για τη δημιουργία του σχεδίου παρεμβολής και η μηδενική τάξη από την πηγή λέιζερ μπλοκάρεται με ένα σταμάτημα δέσμης. Οι περισσότεροι από τους εκτεθειμένους ανιχνευτές φθορισμού εντός του δείγματος κορεσθούν λόγω της έκθεσης στον έντονο φωτισμό, αφήνοντας μόνο στενούς σκοτεινούς όγκους σχήματος γραμμής (μηδενικούς κόμβους) με περίοδο περίπου 200 νανόμετρων στις άκρες του σχεδίου παρεμβολής. Καθώς η ενέργεια διέγερσης αυξάνεται, τα τοιχώματα που περιβάλλουν τους κόμβους γίνονται πολύ μεγαλύτερα, μειώνοντας έτσι το μέγεθος της συνάρτησης διασποράς σημείου. Η μεθοδολογία εφαρμόζεται σε μικροσκόπια ευρέως πεδίου, χωρίς σάρωση, μεταβάλλοντας τη φάση του σχεδίου για να καταστήσει ορατές κατά τα άλλα μη επιλύσιμες πληροφορίες υπερανάλυσης με τη μορφή αρμονικών συχνοτήτων και θεμελιωδών κροσσών moiré. Λόγω του γεγονότος ότι η ανάλυση βελτιώνεται μόνο στην κατεύθυνση κάθετη προς τους γραμμοειδείς μηδενικούς κόμβους, το σχέδιο πρέπει να μετατοπιστεί σε πολλές κατευθύνσεις για να καλύψει μεγάλο αριθμό γωνιών στο εστιακό επίπεδο.

      Οι τεχνικές μη γραμμικού δομημένου φωτισμού είναι παρόμοιες με τη μικροσκοπία STED καθώς ο χρόνος διεξαγωγής των μετρήσεων είναι θεωρητικά ανεξάρτητος από την πυκνότητα επισήμανσης και η φωτοσταθερότητα των ανιχνευτών φθορισμού υπαγορεύει την απόδοση. Ο μηχανισμός με τον οποίο αυξάνεται η ανάλυση στο SSIM και το SPEM περιγράφεται με βάση τα στοιχεία Fourier και τις χωρικές συχνότητες. Ωστόσο, παρόμοια με τις άλλες τεχνικές μηχανικής λειτουργίας σημειακής εξάπλωσης των STED και GSD που περιγράφονται παραπάνω, η μη γραμμική δομημένη μικροσκοπία φωτισμού εκμεταλλεύεται τον κορεσμό σταθερής κατάστασης όπου οι πληροφορίες υψηλής ανάλυσης λαμβάνονται μόνο αφού το σύστημα έχει φτάσει σε συνθήκες κορεσμού φθοροφόρου. Επιπλέον, η χωρική ανάλυση κλιμακώνεται με το επίπεδο κορεσμού για τη δημιουργία εικόνων με πλευρική ανάλυση κοντά στα 50 νανόμετρα υπό βέλτιστες συνθήκες σήματος προς θόρυβο και χαμηλής φωτολεύκανσης. Λόγω του χρόνου που απαιτείται για την περιστροφή του προβαλλόμενου σχεδίου πλέγματος, το δείγμα πρέπει να είναι ακίνητο για σχετικά μεγάλες χρονικές περιόδους, αλλά τα φθοροφόρα που είναι κατάλληλα για SSIM και SPEM δεν απαιτούν εξειδικευμένες ιδιότητες φωτοεναλλαγής.

      Επιστροφή στην κορυφή ^ Μικροσκοπία δομημένου φωτισμού υπερανάλυσης

      Σε παραδοσιακές εφαρμογές μικροσκοπίου δομημένου φωτισμού (π.χ. το ZEISS ApoTome), ένα πλέγμα που δημιουργείται με εξάτμιση μετάλλου στην επιφάνεια ενός γυάλινου παραθύρου οπτικής ποιότητας εισάγεται στο επίπεδο διαφράγματος πεδίου στη διαδρομή φωτισμού ενός μικροσκοπίου φθορισμού και προβάλλεται στο δείγμα. Η προβαλλόμενη εικόνα πλέγματος μεταφράζεται πάνω από το δείγμα χρησιμοποιώντας μια επίπεδη-παράλληλη γυάλινη πλάκα που έχει κλίση εμπρός και πίσω στη φωτεινή διαδρομή. Τουλάχιστον τρεις ακατέργαστες εικόνες του δείγματος αποκτώνται με τη δομή του πλέγματος υπερτιθέμενη σε διαφορετικές θέσεις. Αυτές οι εικόνες επεξεργάζονται στη συνέχεια σε πραγματικό χρόνο χρησιμοποιώντας το λογισμικό μικροσκοπίου για τη δημιουργία ενός οπτικού τμήματος. Η βασική αρχή είναι ότι το προβαλλόμενο πλέγμα γίνεται ορατό στο εστιακό επίπεδο ως αποτέλεσμα των χαρακτηριστικών του δείγματος που διεγείρονται από το δομημένο φως. Σε περιοχές όπου δεν φτάνει φως στο δείγμα (στην πραγματικότητα, οι σκοτεινές γραμμές πλέγματος), δεν δημιουργείται φθορισμός. Το λογισμικό προσδιορίζει την αντίθεση πλέγματος ως συνάρτηση της θέσης και αφαιρεί τις πληροφορίες εικόνας εκτός εστίασης πριν από τη συγκρότηση των τριών εικόνων σε ένα τελικό οπτικό τμήμα με πλευρική και αξονική ανάλυση παρόμοια με τη συνεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ.

      Η πλευρική ανάλυση μπορεί να αυξηθεί πάνω από το κλασικό όριο Abbe κατά δύο (περίπου 100 έως 120 νανόμετρα) σε δομημένο φωτισμό χωρίς να απορρίπτεται κανένα φως εκπομπής χρησιμοποιώντας χωρικά δομημένο φωτισμό που δημιουργείται από λέιζερ σε συνδυασμό με μικροσκόπιο φθορισμού ευρέως πεδίου σε αυτό που ονομάζεται υπερανάλυση (S ) SIM . Παρόμοια με την τεχνική μη γραμμικής υπερανάλυσης του SSIM που περιγράφεται παραπάνω, τα γραμμικά δομημένα μέτωπα φωτός SR-SIM καθιστούν κανονικά απρόσιτες πληροφορίες υψηλής ανάλυσης διαθέσιμες με τη μορφή κροσσών που περιέχουν αρμονικές συχνότητες από το δείγμα που δεν είναι διαθέσιμες σε συμβατικά μικροσκοπία φθορισμού. Έτσι, εάν δύο λεπτά μοτίβα υπερτίθενται με πολλαπλασιαστικό τρόπο, θα εμφανιστεί ένα μοτίβο beat (moiré κρόσσια) στο προϊόν τους. Σε αυτή την περίπτωση, ένα από τα μοτίβα είναι η χωρική κατανομή φθοροφόρου στο δείγμα και το άλλο είναι η δομημένη ένταση φωτός διέγερσης. Όπως περιγράφεται λεπτομερέστερα παρακάτω, συλλέγοντας ένα σύνολο εικόνων με το μοτίβο πλέγματος περιστρεφόμενο κατά 360 μοίρες στον πλευρικό χώρο, οι πληροφορίες υψηλής ανάλυσης μπορούν να ανακτηθούν από το δείγμα μετά την ολοκλήρωση της επεξεργασίας μετά την απόκτηση.

      Η έννοια της βελτίωσης της ανάλυσης με χρήση δομημένου φωτισμού υψηλής ανάλυσης παρουσιάζεται σχηματικά στο Σχήμα 8. Δύο μοτίβα γραμμών παρουσιάζονται επάλληλα (πολλαπλασιασμένα) στο Σχήμα 8(α) για να δημιουργήσουν κρόσσια που εμφανίζονται ως σχεδόν κάθετες ρίγες στην περιοχή επικάλυψης . Εάν η δομή του δείγματος προβάλλεται σε αμοιβαίο χώρο (στην πραγματικότητα, ο μετασχηματισμός Fourier), όπως παρουσιάζεται από έναν κύκλο με ακτίνα 2NA/λ στο Σχήμα 8(β), οι πληροφορίες χαμηλής ανάλυσης βρίσκονται κοντά στην αρχή, ενώ η υψηλότερη Οι πληροφορίες ανάλυσης διανέμονται προς τα έξω πλησιάζοντας τα όρια του κύκλου (προσεγγίζοντας το όριο περίθλασης περίπου 200 νανόμετρα). Επομένως, ο κύκλος στο Σχήμα 8(β) υποδηλώνει την παρατηρήσιμη περιοχή του αμοιβαίου χώρου που ορίζει τις λεπτομέρειες του δείγματος που είναι διαθέσιμες με ένα συμβατικό μικροσκόπιο φθορισμού περιορισμένης περίθλασης. Ο δομημένος φωτισμός δεν αλλάζει αυτήν την φυσικά παρατηρήσιμη περιοχή, ωστόσο, μεταφέρει νέες πληροφορίες στην περιοχή από υψηλότερες χωρικές συχνότητες που κανονικά θα αποκλείονταν.

      Στο απλούστερο παράδειγμα, μια δομή φωτισμού που αποτελείται από ένα ημιτονοειδές μοτίβο λωρίδας δημιουργεί έναν μετασχηματισμό Fourier που έχει μόνο τρία μη μηδενικά σημεία (βλ. Εικόνα 8(γ)). Το ένα σημείο βρίσκεται στην αρχή και τα άλλα δύο μετατοπίζονται από την αρχή σε μια κατεύθυνση που ορίζεται από τον προσανατολισμό του σχεδίου πλέγματος και από μια απόσταση ανάλογη με την αντίστροφη απόσταση των γραμμών του πλέγματος. Όταν το δείγμα φωτίζεται από δομημένο φως που δημιουργείται από το μοτίβο του πλέγματος, θα εμφανιστούν κρόσσια moiré που αντιπροσωπεύουν πληροφορίες που έχουν αλλάξει θέση στον αμοιβαίο χώρο. Εκτός από τις κανονικές πληροφορίες δειγμάτων περιορισμένης περίθλασης, η παρατηρήσιμη περιοχή περιέχει τώρα νέες πληροφορίες υψηλής συχνότητας που προέρχονται από τις δύο περιοχές μετατόπισης, όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 8(δ). Οι περιοχές των κύκλων μετατόπισης στο Σχήμα 8(δ) που βρίσκονται εκτός του κεντρικού κύκλου αντιπροσωπεύουν νέες πληροφορίες που δεν είναι προσβάσιμες με ένα συμβατικό μικροσκόπιο. Εάν παράγεται μια ακολουθία τέτοιων εικόνων με διαφορετικό προσανατολισμό και φάση πλέγματος (Εικόνα 8(ε)), οι πληροφορίες μπορούν να ανακτηθούν από μια περιοχή διπλάσιο από το μέγεθος της συνήθως παρατηρήσιμης περιοχής για να αυξηθεί η πλευρική ανάλυση κατά δύο φορές.

      Όσον αφορά τη διαμόρφωση του οργάνου, τα λέιζερ είναι ίσως η πιο κατάλληλη επιλογή για φωτισμό SR-SIM, υπό την προϋπόθεση ότι το φως είναι χωρικά ανακατεμένο και γραμμικά πολωμένο. Ο προσανατολισμός των γραμμών του πλέγματος πρέπει να είναι παράλληλος με το αζιμούθιο του διανύσματος πόλωσης του φωτισμού διέγερσης και όλες οι τάξεις περίθλασης εκτός από την πρώτη (+1 και -1) πρέπει να είναι μπλοκαρισμένες. Περίπου το 80 τοις εκατό του φωτός συνήθως διαθλάται στις πρώτες τάξεις για να παραχθεί ένα σχέδιο υψηλής αντίθεσης με περιοδικότητα περίπου 200 νανόμετρα. Το βάθος διαμόρφωσης του σχεδίου λωρίδας που προβάλλεται στο δείγμα πρέπει να κυμαίνεται μεταξύ 70 και 90 τοις εκατό και η σχάρα είναι τοποθετημένη σε μια περιστρεφόμενη, κλειστή συσκευή μετάφρασης βρόχου. Θα πρέπει να είναι διαθέσιμα διάφορα μεγέθη σχάρας για να ταιριάζουν με πολλαπλές πηγές διέγερσης γραμμής λέιζερ. Ορισμένα εμπορικά όργανα μπορούν να επιλέξουν τρεις ή πέντε περιστροφές πλέγματος (120 μοιρών ή 72 μοιρών) για να βελτιστοποιήσουν είτε την ταχύτητα απεικόνισης είτε την ανάλυση, αντίστοιχα. Μετά την απόκτηση, οι πολλαπλές υποεικόνες για κάθε προσανατολισμό πλέγματος και μετατόπιση υποβάλλονται σε επεξεργασία μέσω ενός αριθμού βημάτων λογισμικού για τη δημιουργία της τελικής εικόνας. Σε λειτουργία βελτιστοποιημένης ταχύτητας, ένα εμπορικό όργανο SR-SIM θα πρέπει να μπορεί να απεικονίζει ζωντανά κύτταρα δομών που δεν έχουν σημαντική κίνηση, όπως η ακτίνη, τα μιτωτικά χρωμοσώματα, τα μιτοχόνδρια και η συσκευή Golgi.

      Η αρχική έκδοση του μικροσκοπίου δομημένου φωτισμού υψηλής ανάλυσης βελτιώνει την πλευρική ανάλυση σε περίπου 100 νανόμετρα και ήταν ο πρόδρομος για συνεχείς εξελίξεις που σχεδιάστηκαν να αυξάνουν και την αξονική ανάλυση. Η τρισδιάστατη SR-SIM χρησιμοποιεί τρεις δέσμες που δημιουργούνται από το πλέγμα περίθλασης για να σχηματίσει ένα τρισδιάστατο σχέδιο παρεμβολής στο εστιακό επίπεδο. Με τη συλλογή δομημένων εικόνων φωτισμού από πολλαπλά εστιακά επίπεδα, η επεξεργασία εικόνας των δεδομένων διατηρεί την πλευρική ανάλυση των 100 νανομέτρων, αλλά επεκτείνει την αξονική ανάλυση σε περίπου 300 νανόμετρα (σχεδόν διπλάσια από την ομοεστιακή μικροσκοπία σάρωσης λέιζερ). Η αξονική ανάλυση μπορεί να βελτιωθεί περαιτέρω χρησιμοποιώντας έναν συνδυασμό SIM με I 5 M χρησιμοποιώντας δύο αντίθετους στόχους για τη μεγιστοποίηση της συγκέντρωσης της εκπομπής φθορισμού σε μεγαλύτερη γωνία. Η διαμόρφωση που προκύπτει θα πρέπει να είναι ικανή να αποδίδει ανάλυση 100 νανομέτρων κατά μήκος όλων των αξόνων.

      Επιστροφή στην κορυφή ^ Μικροσκόπιο εντοπισμού ενός μορίου

      Οι τεχνικές υπερανάλυσης των 4Pi, I n M, STED, GSD, SSIM και δομημένου φωτισμού έχουν σχεδιαστεί για να απεικονίζουν ένα σύνολο φθοροφόρων κατανεμημένων σε όλο το δείγμα. Αν και αυτές οι μέθοδοι διαθέτουν διαφορετικές αναλύσεις, όλες διεγείρουν πολλαπλά φθοροφόρα μέσα στα όρια της τροποποιημένης συνάρτησης διασποράς σημείου που παρέχεται από τη συγκεκριμένη διαμόρφωση του οργάνου. Αντίθετα, οι τεχνικές ενός μορίου της φωτοενεργοποιημένης μικροσκοπίας εντοπισμού (PALM), της στοχαστικής οπτικής μικροσκοπίας ανασυγκρότησης (STORM) και της μικροσκοπίας εντοπισμού φωτοενεργοποίησης φθορισμού (FPALM) διαφέρουν θεμελιωδώς στο ότι απεικονίζουν αραιά υποσύνολα που περιέχουν μεμονωμένα μόρια που υπερβαίνουν τα χωριστά μόρια. το όριο ανάλυσης Abbe. Η βασική αρχή που διέπει αυτές τις τεχνικές είναι ότι η θέση ενός μεμονωμένου μορίου μπορεί να εντοπιστεί με ακρίβεια αρκετών νανομέτρων (ή καλύτερη) εάν μπορούν να συγκεντρωθούν αρκετά φωτόνια και υπάρχει έλλειψη πρόσθετων (παρομοίως εκπεμπόμενων) μορίων εντός εύρους περίπου 200 νανόμετρα. Μεταξύ των πιο επιθυμητών χαρακτηριστικών του PALM, του STORM και της σχετικής μεθοδολογίας είναι ότι οι τεχνικές δεν απαιτούν τροποποίηση των οπτικών χαρακτηριστικών ενός τυπικού ανεστραμμένου μικροσκοπίου και μπορούν να εφαρμοστούν με οποιοδήποτε εμπορικό όργανο που είναι ικανό να εκτελέσει απεικόνιση ενός μορίου.

      Στο Σχήμα 9 απεικονίζονται τα βήματα που εμπλέκονται στον εντοπισμό μεμονωμένων μορίων με υψηλή ακρίβεια, προσαρμόζοντας τη συνάρτηση διασποράς σημείου σε μια συνάρτηση Gauss. Στο Σχήμα 9(α), η συνάρτηση διασποράς σημείου ενός μικροσκοπίου φθορισμού ευρέως πεδίου υπερτίθεται σε μια αναπαράσταση καλωδιακού πλαισίου της διάταξης εικονοστοιχείων από μια ψηφιακή φωτογραφική μηχανή τόσο σε δύο (επάνω αριστερά) όσο και σε τρισδιάστατα διαγράμματα. Η συνάρτηση διασποράς σημείου με εικονοστοιχεία ενός μεμονωμένου φθοροφόρου όπως απεικονίζεται με ένα EMCCD φαίνεται στο επάνω αριστερό μέρος του Σχήματος 9(β) και μοντελοποιείται από μια τρισδιάστατη συνάρτηση Gauss, με την ένταση για κάθε εικονοστοιχείο να αντιστοιχίζεται με χρώμα σε ένα χωρικό θέση στο πλέγμα απεικόνισης (Εικόνα 9(γ)). Σε περιπτώσεις όπου δύο θέσεις ενός μορίου επικαλύπτονται λόγω εκπομπής από φθοροφόρους με απόσταση διαχωρισμού μικρότερη από το όριο περίθλασης, το κέντρο για κάθε φθοροφόρο μπορεί να εντοπιστεί χωριστά αφαιρώντας τη συνάρτηση διασποράς σημείου του ενός φθοροφόρου από το άλλο (αφού εισέλθει σε σκοτεινή κατάσταση ή είναι φωτολευκασμένο) λόγω της στρατηγικής χρονικής χαρτογράφησης για τη δημιουργία εικόνων PALM.

      Για πυκνά επισημασμένα δείγματα (όπως συνηθίζεται για τις βιολογικές δομές που έχουν επισημανθεί με φθορίζουσες πρωτεΐνες ή ανοσοφθορισμό σε συνδυασμό με συνθετικές βαφές), η ακρίβεια εντοπισμού δεν μεταφράζεται άμεσα σε εικόνες υπερανάλυσης λόγω του γεγονότος ότι οι επικαλυπτόμενες εικόνες φθοροφόρων που εκπέμπουν ταυτόχρονα εμποδίζουν τον ακριβή εντοπισμό τους. Για να παρακάμψουν τη «συνολική φύση» σχεδόν όλων των βιολογικών δειγμάτων με φθορίζουσες ετικέτες, το PALM και το STORM έχουν σχεδιαστεί για να προσδιορίζουν τον ακριβή εντοπισμό μεμονωμένων εκπομπών ενός μορίου ενεργοποιώντας διαδοχικά τον φθορισμό σε περιορισμένα υποσύνολα των μορίων πριν επιχειρήσουν να προσδιορίσουν συντεταγμένες. Σε αντίθεση με το STED και το GSD, όπου η επακριβώς καθορισμένη συνάρτηση διασποράς σημείου που δημιουργείται από υπερτιθέμενα λέιζερ σαρώνεται σε όλο το δείγμα για να διεγείρει όλα τα μόρια εντός του εστιακού όγκου, οι τεχνικές ενός μορίου βασίζονται στη στοχαστική φωτοεναλλαγή όπου τα περισσότερα μόρια παραμένουν σκοτεινά. Κατά τη διέγερση με ένα λέιζερ ενεργοποίησης σε χαμηλή ισχύ, ένα μικρό ποσοστό των μορίων ενεργοποιείται στοχαστικά, απεικονίζεται, εντοπίζεται και στη συνέχεια φωτολευκαίνεται για να αφαιρεθεί από το σύνολο (βλ. Εικόνα 9). Η επανάληψη αυτής της διαδικασίας για πολλούς κύκλους είναι η δημιουργική ιδέα πίσω από τη μικροσκοπία εντοπισμού ενός μορίου που επιτρέπει την ανακατασκευή μιας εικόνας υπερανάλυσης.

      Η έννοια της αναγνώρισης και εντοπισμού μεμονωμένων μορίων περιγράφηκε για πρώτη φορά από τον Werner Heisenberg τη δεκαετία του 1930 και υποστηρίχθηκε επίσημα με μια σταθερή μαθηματική βάση κατά τη διάρκεια των δεκαετιών του 1980 και του 1990 από διάφορες ομάδες. Βασικά, σε ένα πλευρικό πεδίο δείγματος που περιέχει εκπομπούς ενός μορίου, το κεντρικό τμήμα κάθε σημείου περιορισμένης περίθλασης που καταγράφεται σε επίπεδο εικόνας ψηφιακής φωτογραφικής μηχανής αντιστοιχεί στη θέση ενός μορίου και μπορεί να εντοπιστεί με υψηλή νανομετρική ακρίβεια συλλέγοντας επαρκή αριθμό φωτονίων . Οι μέθοδοι για τον προσδιορισμό του κέντρου εντοπισμού βασίζονται σε μια στατιστική προσαρμογή καμπύλης της μετρούμενης κατανομής φωτονίων σε μια συνάρτηση Gauss. Ο απώτερος στόχος είναι να προσδιοριστεί το κέντρο ή η μέση τιμή της κατανομής φωτονίων ( μ = x 0 , y 0 ) και η αβεβαιότητά της, το τυπικό σφάλμα του μέσου όρου, σ, σύμφωνα με την εξίσωση:

      όπου N είναι ο αριθμός των φωτονίων που συγκεντρώθηκαν, a είναι το μέγεθος pixel του ανιχνευτή απεικόνισης, b είναι η τυπική απόκλιση του φόντου (που περιλαμβάνει την εκπομπή φθορισμού φόντου σε συνδυασμό με το θόρυβο του ανιχνευτή) και si είναι η τυπική απόκλιση ή πλάτος της κατανομής (στην κατεύθυνση i ). Ο δείκτης i αναφέρεται είτε στην κατεύθυνση x είτε στην κατεύθυνση y. Ο πρώτος όρος κάτω από την τετραγωνική ρίζα στη δεξιά πλευρά της εξίσωσης (4) αναφέρεται στο θόρυβο των φωτονίων, ενώ ο δεύτερος όρος περιλαμβάνει την επίδραση του πεπερασμένου μεγέθους pixel του ανιχνευτή. Ο τελευταίος όρος λαμβάνει υπόψη την επίδραση του θορύβου περιβάλλοντος. Με την εφαρμογή αυτών των απλών τεχνικών, μπορεί να επιτευχθεί ακρίβεια εντοπισμού περίπου 10 νανόμετρων με κατανομή φωτονίων περίπου 1000 φωτονίων όταν ο θόρυβος του φόντου είναι αμελητέος. Η επέκταση αυτής της γνώσης οδήγησε σε πλήθος έξυπνων πειραμάτων που μελετούν απομονωμένες δομές που χωρίζονται με λιγότερο από το όριο περίθλασης, όπως οι επισημασμένοι μοριακοί κινητήρες. Μια σημαντική τεχνολογική εξέλιξη για την υποστήριξη της υπερανάλυσης που βασίζεται σε ανιχνευτή είναι η ευρεία διαθεσιμότητα και η ευκολία χρήσης των συστημάτων κάμερας συζευγμένων συσκευών πολλαπλασιασμού φορτίου (EMCCD), τα οποία έχουν ευαισθησία ενός φωτονίου.

      Όπως περιγράφεται από την Εξίσωση (3), το κλειδί για αποτελέσματα υψηλής ακρίβειας για μοριακό εντοπισμό στην απεικόνιση υπερανάλυσης ενός μορίου είναι η ελαχιστοποίηση του θορύβου του περιβάλλοντος και η μεγιστοποίηση της παραγωγής φωτονίων από τον ανιχνευτή φθορισμού, μια εργασία που περιγράφεται ευκολότερα από ό,τι επιτυγχάνεται. Στην καλύτερη περίπτωση, εάν 10.000 φωτόνια μπορούν να συλλεχθούν απουσία φόντου προτού το φθοροφόρο λευκαντικό ή απενεργοποιηθεί, το κέντρο εντοπισμού μπορεί να προσδιοριστεί με ακρίβεια περίπου 1 έως 2 νανόμετρα. Αντίθετα, εάν συγκεντρωθούν μόνο 400 φωτόνια, η ακρίβεια εντοπισμού πέφτει σε περίπου 20 νανόμετρα ή χειρότερα. Το υπόβαθρο στα δείγματα υπερανάλυσης προκύπτει από φυσικό ή επαγόμενο από αντιδραστήριο αυτοφθορισμό (από σταθεροποιητικά ή χημικά επιμόλυνσης), καθώς και από υπολειπόμενο φθορισμό των περιβαλλόντων ανιχνευτών που έχουν εισέλθει στη σκοτεινή κατάσταση. Έτσι, για τεχνικές απεικόνισης υπερανάλυσης ενός μορίου που βασίζονται σε ανιχνευτή, όπως το PALM, τα φθορίζοντα μόρια θα πρέπει να εμφανίζουν υψηλό λόγο αντίθεσης (ή δυναμικό εύρος), ο οποίος ορίζεται ως ο λόγος φθορισμού πριν και μετά τη φωτοενεργοποίηση. Η μεταβλητότητα των αναλογιών αντίθεσης στις φθορίζουσες πρωτεΐνες και στα συνθετικά φθοροφόρα οφείλεται σε διαφορές στην αυθόρμητη φωτομετατροπή τους απουσία ελεγχόμενης ενεργοποίησης.

      Η απεικόνιση ενός μορίου αποδείχθηκε αρχικά το 1989, πρώτα σε κρυογονικές θερμοκρασίες και αργότερα σε θερμοκρασία δωματίου χρησιμοποιώντας οπτικό μικροσκόπιο σάρωσης κοντινού πεδίου. Από τότε, η μεθοδολογία έχει εξελιχθεί σε μια τυπική τεχνική μικροσκοπίας ευρέως πεδίου. Η προηγούμενη γνώση ότι η εικόνα περιορισμένης περίθλασης ενός μορίου προέρχεται από μία μόνο πηγή επιτρέπει την εκτίμηση της θέσης (κέντρου) αυτού του μορίου με ακρίβεια πολύ μεγαλύτερη από αυτή του ορίου περίθλασης. Μια πρώιμη εφαρμογή της ιδέας παρουσιάστηκε με μια τεχνική γνωστή ως απεικόνιση φθορισμού με ακρίβεια ενός νανομέτρου (FIONA) που εντοπίζει και παρακολουθεί εκπομπούς ενός μορίου βρίσκοντας το κέντρο της συνάρτησης σημειακής εξάπλωσης περιορισμένης περίθλασης. Το FIONA χρησιμοποιήθηκε για την επιτυχή επίδειξη του μεγέθους βήματος σε νανόμετρα με εξαιρετικά υψηλή ακρίβεια των κινητήρων μυοσίνης καθώς μεταφράζουν το μήκος των νημάτων ακτίνης. Μια άλλη επίδειξη που ονομάζεται μικροσκοπία φθορισμού πολλαπλών απλών μορίων με εντοπισμό νανομέτρων (NALMS) χρησιμοποιεί φωτολεύκανση για την επιλεκτική αφαίρεση μεμονωμένων μορίων προκειμένου να μετρήσει τις αποστάσεις μεταξύ πανομοιότυπων ανιχνευτών φθορισμού που επικαλύπτονται σε ένα σημείο περιορισμένης περίθλασης.

      Έχουν επίσης αναφερθεί αρκετές άλλες τεχνικές ενός μορίου με ενδιαφέροντα ακρωνύμια. Μια τεχνική γνωστή ως απεικόνιση υψηλής ανάλυσης ενός μορίου με φωτολεύκανση (SHRImP) σχετίζεται με το FIONA και χρησιμοποιεί φωτολεύκανση δύο ή περισσότερων πανομοιότυπων φθοροφόρων σε κοντινή απόσταση για να προσδιορίσει διαδοχικά τη θέση τους χρησιμοποιώντας τεχνικές εντοπισμού ενός μορίου ξεκινώντας από το τελευταίο φθοροφόρο που έχει ξεθωριασμένος. Παρομοίως, μια δίχρωμη έκδοση του FIONA που χρησιμοποιεί καταπιστευτικούς δείκτες για τη μέτρηση της καταχώρησης μεταξύ δύο καναλιών ανίχνευσης έχει εισαχθεί με την ονομασία εντοπισμός μεμονωμένων μορίων υψηλής ανάλυσης (SHREC). Η εφαρμογή συνεχούς ειδικής ή μη δέσμευσης διαχύσιμων ανιχνευτών φθορισμού σε σταθερό βιολογικό στόχο που ακολουθείται από φωτολεύκανση για απεικόνιση υψηλής ανάλυσης ονομάστηκε συσσώρευση σημείου για απεικόνιση σε τοπογραφία νανοκλίμακας (PAINT). Άλλες έρευνες επικεντρώθηκαν στη χρήση μεμονωμένων κβαντικών κουκκίδων για μελέτες εντοπισμού με βάση τη στοχαστική είσοδο τους σε σκοτεινές καταστάσεις, ενώ ο διαχωρισμός και ο εντοπισμός μεμονωμένων φθοροφόρων που διαφέρουν στα φασματικά τους προφίλ ήταν ο στόχος πολλών πειραμάτων που σχεδιάστηκαν για την απομόνωση μεμονωμένων μορίων σε υψηλή ανάλυση.

      Στο Σχήμα 10 παρουσιάζονται διάφορα παραδείγματα εικόνων υπερανάλυσης που δημιουργούνται χρησιμοποιώντας PALM σε συνδυασμό με τις φθορίζουσες πρωτεΐνες, το διαδοχικό διμερές Eos (tdEos) και το μονομερές Eos έκδοση 2 (mEos2). Τα σχήματα 10(α) έως 10(γ) δείχνουν tdEos συγχωνευμένα σε ένα σύντομο σήμα στόχευσης μιτοχονδρίων σε ολική εσωτερική ανάκλαση ευρέως πεδίου (Εικόνα 10(α)) καθώς και την περιοχή σε πλαίσιο στο Σχήμα 10(α) διευρυμένη στο μέγεθος του PALM εικόνα (Εικόνα 10(β)), και την αντίστοιχη εικόνα PALM υπερανάλυσης (Εικόνα 10(γ)). Ομοίως, εικόνες tdEos συγχωνευμένων με βινκουλίνη αποτυπώνονται σε εστιακές συμφύσεις σε ευρύ πεδίο (Εικόνα 10(δ)), διευρυμένες (Εικόνα 10(ε)) και PALM (Εικόνα 10(στ)). Σημειώστε τη λεπτομερή δομή της εστιακής πρόσφυσης στην εικόνα υπερανάλυσης PALM. Μια σύντηξη του mEos2 με την ανθρώπινη κυτοκερατίνη παρουσιάζεται σε ευρύ πεδίο (Εικόνα 10(g)), διευρυμένο (Εικόνα 10(η)) και PALM (Εικόνα 10(i)) για να απεικονίσει τη δραματική αύξηση στην ανάλυση που παρέχεται από την απεικόνιση PALM. Σε όλες τις περιπτώσεις, τα χαρακτηριστικά που κυμαίνονται σε μέγεθος από 30 έως 50 νανόμετρα επιλύονται με υψηλή ακρίβεια εντοπισμού.

      Το κύριο μειονέκτημα των τεχνικών ενός μορίου που περιγράφηκαν παραπάνω είναι ότι είναι χρήσιμες μόνο όταν οι φθορίζοντες ανιχνευτές είναι καλά απομονωμένοι μεταξύ τους, συνήθως σε πυκνότητες κάπου μεταξύ 10 και 100 μορίων ανά τετραγωνικό μικρόμετρο. Μια τόσο μεγάλη διαμοριακή απόσταση διασφαλίζει ότι η κεντροειδής κατανομή κάθε ανιχνευτή μπορεί να προσαρμοστεί με ακρίβεια. Ωστόσο, καμία από αυτές τις μεθόδους δεν καθορίζει έναν ξεχωριστό μοριακό μηχανισμό που να επιτρέπει τη διαδοχική ανάγνωση ατόμων από ένα μεγάλο σύνολο φθοροφόρων, και μόνο όταν εφαρμόστηκε η φωτομετατροπή (ή η φωτομετατροπή) μεταξύ δύο διακριτών καταστάσεων εκπομπής στην απεικόνιση PALM και STORM, η στοχαστική υπερδιάκριση η μικροσκοπία έγινε πραγματικότητα. Αυτές οι τεχνικές αποδεικνύουν ότι η απεικόνιση ενός μορίου μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη πυκνών συγκεντρώσεων φθοριζόντων ανιχνευτών (στην περιοχή των 100.000 ανά τετραγωνικό μικρόμετρο), ενώ εξακολουθεί να επιτυγχάνεται ανάλυση μετρούμενη σε δεκάδες νανόμετρα. Έτσι, με τις φθορίζουσες πρωτεΐνες οπτικής επισήμανσης ή τις χρωστικές καρβοκυανίνης με δυνατότητα φωτοεναλλαγής, χρησιμοποιείται ένα λέιζερ ενεργοποίησης που εφαρμόζεται σε χαμηλή ισχύ για την ενεργοποίηση της αλλαγής εκπομπής, έτσι ώστε οποιοδήποτε συγκεκριμένο μόριο έχει μικρή πιθανότητα φωτοενεργοποίησης, αλλά η πλειοψηφία του πληθυσμού παραμένει στην αρχική ( σκοτεινή ή φυσική) κατάσταση εκπομπής.

      Στο PALM, το STORM και τις σχετικές τεχνικές εντοπισμού ενός μορίου, η ενεργοποιημένη κατάσταση των μορίων με δυνατότητα φωτοεναλλαγής πρέπει να οδηγεί στη διαδοχική εκπομπή επαρκών φωτονίων για να επιτραπεί ο ακριβής εντοπισμός προτού οι ανιχνευτές επανέλθουν σε σκοτεινή κατάσταση ή απενεργοποιηθούν με φωτολεύκανση. Η διασφάλιση ότι τα αραιά ενεργοποιημένα μόρια απέχουν περισσότερο από το όριο Abbe είναι κρίσιμη για να καταστεί δυνατή η παράλληλη εγγραφή πολλών ατόμων, καθένα από τα οποία έχει ξεχωριστές συντεταγμένες που παράγουν μοναδικά σημεία περίθλασης στον ανιχνευτή διάταξης περιοχής μιας ψηφιακής κάμερας. Όπως περιγράφηκε παραπάνω, τα κεντροειδή που προέρχονται από εικόνες αυτών των μεμονωμένων μορίων αποδίδουν μοριακές συντεταγμένες με ακρίβεια με βάση τον αριθμό των εκπεμπόμενων φωτονίων. Μόλις εξακριβωθούν οι μοριακές θέσεις, οι συντεταγμένες καταχωρούνται ως σημάδι στην πλευρική διάσταση και η διαδικασία επαναλαμβάνεται. Λόγω του γεγονότος ότι ο αριθμός των εκπεμπόμενων φωτονίων ποικίλλει για κάθε μόριο, μπορεί να καθοριστεί ένα ελάχιστο όριο φωτεινότητας (για παράδειγμα, τα μόρια που εκπέμπουν περισσότερα από 25 φωτόνια) για να επιτευχθεί η επιθυμητή ανάλυση.

      Οι παραλλαγές του PALM και του STORM περιλαμβάνουν μια τεχνική γνωστή ως PALM με ανεξάρτητη απόκτηση λειτουργίας (PALMIRA) όπου η κάμερα λειτουργεί σε υψηλή ταχύτητα χωρίς συγχρονισμό με το λέιζερ ενεργοποίησης ή τους κύκλους απενεργοποίησης-ενεργοποίησης-απενεργοποίησης των ανιχνευτών φθορισμού. Το PALMIRA απαιτεί τη χρήση αντιστρεπτά εναλλάξιμων φθοροφόρων, αλλά επιταχύνει δραματικά τις ταχύτητες λήψης εικόνας (περίπου 100 φορές). Μια άλλη μέθοδος που αναφέρεται ως εξάντληση βασικής κατάστασης με επιστροφή ενός μορίου (GSDIM) συμπληρώνει τη σκοτεινή κατάσταση ενός συνθετικού φθοροφόρου οδηγώντας το σε μετασταθερή τριπλή κατάσταση (παρόμοια με το μικροσκόπιο GSD), ακολουθούμενη από παρακολούθηση των εκπομπών καθώς επιστρέφουν στοχαστικά στο έδαφος κατάσταση. Έχει προκύψει ένας αριθμός παρόμοιων τεχνικών που εκμεταλλεύονται αυτό και τα σχετικά φαινόμενα, συμπεριλαμβανομένης της μικροσκοπίας αναλαμπής και πολλών άλλων παραγώγων που υποδηλώνονται με μια φαινομενικά ατελείωτη ροή νέων ακρωνύμιων. Το πιο σημαντικό δυναμικό που προσφέρουν αυτές οι νέες μέθοδοι είναι ότι μπορούν να δημιουργήσουν εικόνες υπερανάλυσης χρησιμοποιώντας τυπικούς συνθετικούς φθορίζοντες ανιχνευτές, όπως φλουορεσκεΐνη, Alexa Fluor 488, ATTO 650, Cy5 και πολλές παρόμοιες χρωστικές, παρουσία σαρωτών οξυγόνου και αλειφατικών θειολών.

      Αν και οι τεχνικές υπερανάλυσης ενός μορίου έχουν αποδειχθεί εξαιρετικά ακριβείς ως προς την ικανότητά τους να εντοπίζουν τους ανιχνευτές φθορισμού στις πλευρικές διαστάσεις, η επίτευξη παρόμοιας ανάλυσης στην αξονική διάσταση έχει αποδειχθεί πιο δύσκολη. Η τρισδιάστατη έκδοση του STORM ( 3D-STORM ) προσαρμόζει έναν κυλινδρικό φακό για να παραμορφώνει τη συνάρτηση σημειακής εξάπλωσης του φθορισμού ενός μορίου στην πλευρική κατεύθυνση ανάλογα με τη θέση του κατά μήκος του άξονα z. Το Biplane (BP) FPALM χρησιμοποιεί μια διαμόρφωση απεικόνισης διπλού επιπέδου για την προβολή μιας εικόνας του ίδιου μορίου σε δύο διαφορετικά εστιακά επίπεδα. Μια τεχνική με το όνομα double-helix point-spread function (DH-PSF) σχεδιάζει τη λειτουργία σημειακής εξάπλωσης του μικροσκοπίου σε δύο λοβούς, οι οποίοι περιστρέφονται σε σχέση με την εικόνα ανάλογα με την αξονική τους θέση. Τέλος, το συμβολομετρικό PALM (iPALM) συλλέγει φως από μεμονωμένους εκπομπούς χρησιμοποιώντας διπλούς αντικειμενικούς αντικειμενικούς σκοπούς, ανασυνδυάζει την εκπομπή και χρησιμοποιεί παρεμβολή των φωτονίων με βάση τη θέση τους στο εστιακό επίπεδο για να προσδιορίσει την αξονική θέση. Παρόλο που οι περισσότερες από αυτές τις τεχνικές που έχουν σχεδιαστεί για την αύξηση της αξονικής ανάλυσης υπολείπονται της απόδοσής τους στις πλευρικές διαστάσεις, το iPALM είναι στην πραγματικότητα ικανό να αποδώσει αξονική ανάλυση συγκρίσιμη ή καλύτερη από το PALM στην πλευρική διάσταση.

      Οι τεχνικές μοριακού εντοπισμού υψηλής πυκνότητας βρίσκονται ακόμη σε αρχικό στάδιο, καθώς νέα παραδείγματα αναπτύσσονται και αναφέρονται σε τακτική βάση, ωστόσο, πολλές από τις έννοιες που συζητήθηκαν παραπάνω υπόσχονται να γίνουν τελικά καθημερινά εργαλεία στην κυτταρική βιολογία και σε συναφείς κλάδους. Σε αυτό το σημείο, πολλά από τα δημοσιευμένα παραδείγματα μεθοδολογίας υπερανάλυσης συνόλου και ενός μορίου αφορούν κυρίως την απόδειξη αρχής ή την εισαγωγή νέων ανιχνευτών φθορισμού. Τα ευνοημένα μόρια στόχοι σε αυτές τις έρευνες είναι η ακτίνη και οι μικροσωληνίσκοι, τα οποία είναι εξαιρετικά τεστ ανάλυσης, καθώς διαθέτουν διακριτές, καλά χαρακτηρισμένες κυτταρικές δομές και τυπικά έχουν πολυάριθμα νήματα με διάμετρο 25 νανόμετρα ή μικρότερη και βρίσκονται σε διάφορες αποστάσεις το ένα από το άλλο. Παραδείγματα δίχρωμης απεικόνισης και απεικόνισης ζωντανών κυττάρων αναφέρονται πολύ πιο σπάνια, αλλά όλες οι μέθοδοι που περιγράφονται εδώ πιθανότατα θα γίνουν πιο εκλεπτυσμένες και επομένως χρήσιμες για τη διερεύνηση ενός ευρέος φάσματος βιολογικών φαινομένων.

      Το ευρύ φάσμα των τεχνικών υπερανάλυσης που διατίθενται σήμερα μεταφέρει την οπτική απεικόνιση βιολογικών δειγμάτων στο βασίλειο που παραδοσιακά κρατά η ηλεκτρονική μικροσκοπία, αλλά απαιτείται κάποια προσοχή κατά την ερμηνεία των δομών και των μοριακών κατανομών που παρατηρούνται. Η κύρια έμφαση πρέπει να είναι η διασφάλιση ότι οι τεχνικές αποδίδουν όπως διαφημίζονται και δεν δημιουργούν νέα τεχνουργήματα που πρέπει να ερμηνεύονται και να αμβλύνονται. Στις περισσότερες περιπτώσεις, οι τεχνικές, το λογισμικό και τα όργανα που περιγράφονται στις παραπάνω παραγράφους έχουν αναπτυχθεί από λίγους μόνο λαμπρούς και δημιουργικούς επιστήμονες, επομένως υπάρχει αρκετός χώρος για επέκταση αυτού του εμβρυϊκού πεδίου. Για πολλά από τα όργανα υπερανάλυσης, τα εξαρτήματα διατίθενται στο εμπόριο ή μπορούν να κατασκευαστούν εύκολα, πράγμα που ουσιαστικά συνοψίζεται σε ζήτημα κόστους. Στην περίπτωση του PALM και άλλων τεχνικών μοριακού εντοπισμού, τα όργανα ήταν διαθέσιμα εδώ και αρκετό καιρό με τη μορφή εμπορικών συστημάτων TIRF, αλλά οι κατασκευαστές διαθέτουν ήδη συστήματα με το κλειδί στο χέρι στην προσφορά. Ομοίως, οι τεχνικές συνόλου STED, δομημένος φωτισμός και 4Pi είναι εμπορικά διαθέσιμες και πρόσθετα όργανα θα εμφανιστούν τα επόμενα χρόνια. Αυτά τα γεγονότα θα πρέπει να είναι ένα όφελος για τους βιολόγους κυττάρων που δεν είναι σε θέση να δημιουργήσουν τα δικά τους όργανα ή/και λογισμικό προγράμματος, αλλά θέλουν να διεξάγουν πειράματα σε υψηλή ανάλυση.

      Συνεισφέροντες Συγγραφείς

      Mats G. L. Gustafsson, Eric Betzig και Harald F. Hess - Howard Hughes Medical Institute, Janelia Farm Research Campus, Ashburn, Βιρτζίνια, 20147.

      George H. Patterson - Biophotonics Section, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 20892.

      Jennifer Lippincott-Schwartz - Πρόγραμμα κυτταρικής βιολογίας και μεταβολισμού, Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 20892.

      Michael W. Davidson - National High Magnetic Field Laboratory, 1800 East Paul Dirac Dr., The Florida State University, Tallahassee, Florida, 32310.


      Απαλή Απεικόνιση

      Η χρονική και χρονική απεικόνιση φθορισμού ζωντανών κυττάρων προσφέρει πληροφορίες για την ενδοκυτταρική και μοριακή δυναμική, τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων, την κινητικότητα των κυττάρων και πολλές άλλες πτυχές. Στην περίπτωση των καρκινικών κυττάρων, αυτό μπορεί, για παράδειγμα, να οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση της αντοχής στα φάρμακα για την ανάπτυξη νέων θεραπειών. Ωστόσο, το φως μπορεί να αντιδράσει με ενδοκυτταρικά μόρια ή φθοροφόρα για να παράγει ελεύθερες ρίζες και η μακροχρόνια απεικόνιση των κυττάρων μπορεί να οδηγήσει σε φωτοτοξικότητα.

      Η γρήγορη, απαλή απεικόνιση καταγράφει δυναμικές διαδικασίες, αλλά και μειώνει την έκθεση στο φως. Για μακροχρόνια απεικόνιση ζωντανών κυττάρων, για ώρες, ημέρες ή ακόμη και εβδομάδες, είναι επιτακτική ανάγκη η πλατφόρμα απεικόνισης να έχει τη δυνατότητα να συλλαμβάνει πληροφορίες διατηρώντας παράλληλα την κυτταρική ομοιόσταση και τη σταθερότητα του συστήματος.


      Εφαρμογές μικροσκοπίου φθορισμού

      Η μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιείται ευρέως στη διαγνωστική μικροβιολογία και στη μικροβιακή οικολογία (για την απαρίθμηση βακτηρίων σε φυσικά περιβάλλοντα).

      Δείγμα χρωματισμένο με φθορισμό αντισώματος που δείχνει πολλά, Τοξόπλασμα sp. ταχυζωίτης
      (Πίστωση εικόνας: CDC)