Πληροφορίες

Τι ποσοστό ματίσματος RNA συμβαίνει κατά τη διάρκεια της μεταγραφής;

Τι ποσοστό ματίσματος RNA συμβαίνει κατά τη διάρκεια της μεταγραφής;


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Το μάτισμα μπορεί να συμβεί είτε κατά τη διάρκεια της μεταγραφής είτε αμέσως μετά.

Διαβάζω για την αλληλουχία RNA μονοκυττάρου και σύμφωνα με αυτό το άρθρο, παρατήρησαν ότι το 15-25% των αναγνώσεων περιείχε μη ματισμένες ιντρονικές αλληλουχίες.

Τώρα υποθέτοντας ότι η πλειονότητα των αναγνώσεων από την ακολουθία RNA θα προέρχεται από RNA που έχει ολοκληρωθεί η μεταγραφή…

Υποδηλώνει αυτό ότι το 75-85% όλων των γονιδίων ματίζονται κατά τη διάρκεια της μεταγραφής; Με άλλα λόγια, το 80% των γονιδίων μας είναι πλήρως ώριμα (ματισμένα) αμέσως μετά τη μεταγραφή;


Δεν νομίζω ότι θα είναι δυνατό να δώσουμε μια οριστική απάντηση σε αυτό το ερώτημα, γιατί α) είναι θέμα ενεργητικής έρευνας και β) το ποσοστό / το ποσοστό των μεταγραφών που είναι πλήρως συνδεδεμένα συν-μεταγραφικά δεν είναι σχεδόν σίγουρα σταθερό, αλλά θα εξαρτώνται από πολλούς παράγοντες και ρυθμιστικούς μηχανισμούς.

Μια άλλη σημαντική λεπτομέρεια είναι ότι αυτή η ανάλυση / χαρτί βασίζεται στον προσδιορισμό αλληλουχίας mRNA, ο οποίος χρησιμοποιεί εκκινητές ολιγο-dT για να εμπλουτίσει πολυαδενυλιωμένα μόρια mRNA. Ωστόσο, οι εκκινητές ολιγο-dT μπορούν επίσης να συνδεθούν σε τμήματα του Α στο εσωτερικό των μορίων RNA (αυτή η διαδικασία ονομάζεται εσωτερική εκκίνηση) και δεδομένου ότι τέτοιες εκτάσεις είναι πιο συνηθισμένες στα ιντρόνια σε σύγκριση με τα εξόνια, αυτό μπορεί να συμβάλει στην αφθονία των ιντρονικών αναγνώσεων στα δεδομένα αλληλουχίας mRNA (Δεν έχω καλή βιβλιογραφική πηγή για τη συγκεκριμένη περίπτωση, αλλά είναι σίγουρα γνωστό "θέμα").

Ίσως μερικές από αυτές τις κριτικές να είναι επίσης χρήσιμες (δεν είμαι σίγουρος αν όλες είναι δωρεάν διαθέσιμες):


Ο James Crick (συνιδρυτής της δευτερογενούς δομής του DNA) πρότεινε ότι το DNA είναι ένα μόριο αποθήκευσης πληροφοριών ικανό να αναπαραχθεί. Περαιτέρω, πρότεινε ότι οι πληροφορίες που μεταδόθηκαν έπρεπε να «διαβαστούν» από ένα κατασκευαστικό σώμα μέσα στο κύτταρο που ενώνει τα αμινοξέα σε μια συγκεκριμένη αλληλουχία συνθέτοντας τελικά μια πρωτεΐνη. Αυτό έγινε γνωστό ως το κεντρικό δόγμα της μοριακής βιολογίας.

Το Κεντρικό Δόγμα της Μοριακής Βιολογίας

Το κεντρικό δόγμα της μοριακής βιολογίας προτείνει ότι το DNA χρησιμεύει ως πρότυπο για την άμεση σύνθεση ενός μορίου αγγελιαφόρου RNA (mRNA), σε μια διαδικασία γνωστή ως μεταγραφή. Δεύτερον, το mRNA «διαβάζεται» σε ένα ριβόσωμα με RNA μεταφοράς (tRNAs), τα οποία συνεργάζονται για να συναρμολογήσουν μια συγκεκριμένη αλυσίδα αμινοξέων, τα οποία συγκεντρώνονται συλλογικά για να δημιουργήσουν μια πρωτεΐνη. Αυτή η διαδικασία είναι γνωστή ως μετάφραση.


Τι συμβαίνει με τη γονιδιακή μεταγραφή κατά τη διάρκεια της βλάβης του DNA;

Μεταγραφές από το γονίδιο ASCC3 βρίσκονται σε δύο διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα. Το μακρύ ισόμορφο mRNA (αριστερά) είναι κυρίως κυτταροπλασματικό, ενώ το βραχύ μη κωδικοποιητικό RNA (ncRNA, δεξιά) βρίσκεται στον πυρήνα του κυττάρου (μπλε). Πίστωση: Ινστιτούτο Φράνσις Κρικ

Είναι γνωστό ότι όταν το DNA ενός κυττάρου καταστραφεί, το κύτταρο ανταποκρίνεται ενεργοποιώντας συγκεκριμένα γονίδια που βοηθούν στην προστασία της ακεραιότητας του γονιδιώματός του. Αλλά λιγότερο καλά μελετημένο είναι το γεγονός ότι το κύτταρο στην πραγματικότητα κλείνει τη συντριπτική πλειοψηφία των άλλων γονιδίων του.

Για πρώτη φορά, επιστήμονες στο Ινστιτούτο Francis Crick ανέλυσαν αυτό το φαινόμενο σε μοριακό επίπεδο. Διαπίστωσαν ότι η μεταγραφή όλων των γονιδίων επιβραδύνεται γρήγορα και δραματικά ως απόκριση στη βλάβη του DNA. Ανακάλυψαν επίσης ένα παράδειγμα γονιδίου όπου μεταγράφηκε μια πιο σύντομη μη κωδικοποιητική έκδοση λόγω αυτής της επιβράδυνσης και μέσω του λεγόμενου εναλλακτικού ματίσματος. Αυτό το μη κωδικοποιητικό RNA βοηθά στη συνέχεια το κύτταρο να επιβιώσει από τη βλάβη του DNA.

Η σημασία του εναλλακτικού ματίσματος παραμένει θέμα συζήτησης, ενώ προηγουμένως εικαζόταν ότι η διαδικασία συμβάλλει στη δημιουργία μεγάλης πολυπλοκότητας στη λειτουργία πρωτεϊνών από περιορισμένο αριθμό γονιδίων, ορισμένοι ερευνητές επέμειναν πρόσφατα ότι το εναλλακτικό μάτισμα δεν μπορεί να είναι σημαντικό καθώς η πρωτεομική ανάλυση έχει δείξει ότι τα περισσότερα Τα γονίδια έχουν μόνο μία μορφή πρωτεΐνης, υπονοώντας ότι τα περισσότερα εναλλακτικά μεταγραφήματα γονιδίων δεν έχουν κάποια λειτουργία.

Το λειτουργικό παράδειγμα εναλλακτικής ματίσματος που περιγράφουν οι επιστήμονες του Crick είναι ένα γονίδιο που ονομάζεται ASCC3. Το ASCC3 συνήθως κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη, αλλά όταν υπάρχει βλάβη στο DNA και η μεταγραφή γονιδίων επιβραδύνεται, ένα πολύ μικρότερο μόριο RNA μεταγράφεται από το ίδιο γονίδιο. Είναι αξιοσημείωτο ότι αυτή η μορφή δεν κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη, επομένως είναι γνωστή ως μη κωδικοποιητικό RNA. Οι ερευνητές ανακάλυψαν ότι στην πραγματικότητα, αυτό το εναλλακτικό μη κωδικοποιητικό RNA είναι ένα σταθερό αντίγραφο που βρίσκεται στον πυρήνα του κυττάρου και παίζει ρόλο στην εξουδετέρωση της αρχικής πρωτεΐνης που κωδικοποιείται από το ίδιο γονίδιο.

Ο Jesper Svejstrup, ο οποίος ηγήθηκε της εργασίας, λέει: "Μπορεί να υπάρχουν πολλά άλλα γονίδια όπως αυτό, γνωρίζουμε σίγουρα ότι υπάρχουν πολλά γονίδια που φαίνεται να συμπεριφέρονται παρόμοια στην απόκριση βλάβης του DNA. Τέτοιες εναλλακτικές μη κωδικοποιητικές μεταγραφές RNA μπορεί επίσης να είναι αυξημένες Πράγματι, πολλά, πολλά γονίδια στο γονιδίωμα εκφράζουν σύντομες μορφές RNA που σχεδόν πάντα αγνοούνται επειδή δεν έχει νόημα να κωδικοποιούν πρωτεΐνες.

«Τώρα που γνωρίζουμε ότι Τόσο ένα κωδικοποιητικό πρωτεϊνών όσο και ένα εναλλακτικό μη κωδικοποιητικό αλλά λειτουργικά σημαντικό RNA μπορούν να εκφραστούν από το ίδιο γονίδιο, οι ερευνητές θα αρχίσουν να αναζητούν λειτουργίες για τα σύντομα και δυνητικά μη κωδικοποιητικά μεταγραφήματα RNA τους σε οποιοδήποτε φυσιολογικό σύστημα. Η εργασία μας δείχνει επίσης την πιθανή φυσιολογική συνάφεια και συνάφεια με την ασθένεια τέτοιων μη μελετημένων μεταγραφών."

Η εργασία, η UV-Irradiation Induces a Noncoding RNA που αντιτίθεται λειτουργικά στην πρωτεΐνη που κωδικοποιείται από το ίδιο γονίδιο, δημοσιεύεται στο Κύτταρο.


Αποτελέσματα και συζήτηση

Περιγραφή μοντέλου υψηλού επιπέδου

Το Σχήμα 1 παρουσιάζει μια σχηματική απεικόνιση του BRIE (βλ. ενότητα «Μέθοδοι» για ακριβείς ορισμούς και λεπτομέρειες της διαδικασίας εκτίμησης). Το κάτω μέρος του σχήματος αντιπροσωπεύει την τυπική προσέγγιση μοντέλου μείγματος για την εκτίμηση ισομορφών που εισήχθη στο MISO [8] και στα μανικετόκουμπα [7], όπου οι αναγνώσεις σχετίζονται με μια λανθάνουσα, πολυωνυμικά κατανεμημένη μεταβλητή ταυτότητας ισομορφής (βλ. ενότητα «Μέθοδοι» για αυτο- περιείχε ανασκόπηση μειγμάτων μοντέλων ισομορφών). Αυτή η ενότητα λαμβάνει ως είσοδο τα δεδομένα scRNA-seq (ευθυγραμμισμένες αναγνώσεις) και σχηματίζει την πιθανότητα του Bayesian μοντέλου μας. Στις μεταβλητές πολυωνυμικής ταυτότητας εκχωρείται ένα πληροφοριακό προηγούμενο με τη μορφή ενός μοντέλου παλινδρόμησης (πάνω μισό του Σχ. 1), όπου η προηγούμενη πιθανότητα αναλογιών συμπερίληψης υποχωρεί έναντι των χαρακτηριστικών που προέρχονται από ακολουθία. Είναι σημαντικό ότι οι παράμετροι παλινδρόμησης μοιράζονται σε όλα τα γονίδια και μπορούν να μάθουν σε πολλαπλά μεμονωμένα κύτταρα, ρυθμίζοντας έτσι την εργασία και επιτρέποντας ισχυρές προβλέψεις ενόψει της πολύ χαμηλής κάλυψης. Στην ενότητα «Μέθοδοι» και στο συμπληρωματικό υλικό, δίνουμε λεπτομέρειες για τα χαρακτηριστικά που χρησιμοποιούνται. Ενώ η κατηγορία των μοντέλων παλινδρόμησης που χρησιμοποιούμε είναι διαφορετική από τα νευρωνικά δίκτυα του [11], εξακολουθούν να παρέχουν έναν εξαιρετικά ακριβή εποπτευόμενο προγνωστικό μάθησης για τη συναρμογή σε μαζικά σύνολα δεδομένων RNA-seq. Πρόσθετο αρχείο 1: Το σχήμα S1 δείχνει ότι η προσέγγιση παλινδρόμησης Bayes του BRIE μπορεί να επιτύχει ένα Pearson R άνω του 0,8 σε σετ δοκιμών, επικυρώνοντας την επιλογή του μοντέλου μας στο BRIE.

Μια γελοιογραφία της μεθόδου BRIE για την εκτίμηση ισομορφών. Το BRIE συνδυάζει μια πιθανότητα που υπολογίζεται από δεδομένα RNA-seq (κάτω μέρος) και μια ενημερωτική προηγούμενη διανομή που διδάχτηκε από 735 χαρακτηριστικά που προέρχονται από ακολουθία (μπλουζα)

Αυτή η αρχιτεκτονική επιτρέπει στο BRIE να ανταλλάσσει δύο εργασίες ταυτόχρονα: ελλείψει δεδομένων (γονίδια εγκατάλειψης), το ενημερωτικό προηγούμενο παρέχει έναν τρόπο απόδοσης δεδομένων που λείπουν, ενώ για τα υψηλά καλυμμένα γονίδια κυριαρχεί ο όρος πιθανότητας, επιστρέφοντας ένα μοντέλο μείγματος ποσοτικοποίηση. Για ενδιάμεσα επίπεδα κάλυψης, το BRIE χρησιμοποιεί το θεώρημα του Bayes για να ανταλλάξει τον καταλογισμό και την ποσοτικοποίηση.

Συγκριτική αξιολόγηση BRIE σε προσομοιωμένα δεδομένα

Για να αξιολογήσουμε τη βελτίωση στην ποσοτικοποίηση ισομορφών που παρέχεται από το ενημερωτικό προηγούμενο του BRIE, προσομοιώσαμε αναγνώσεις RNA-seq για 11.478 ανθρώπινα συμβάντα παράλειψης εξονίων και ένα συσχετισμένο χαρακτηριστικό για να μάθουμε το προηγούμενο (βλ. λεπτομέρειες στην ενότητα "Μέθοδοι" και στο πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S2 ). Καθώς μας ενδιαφέρει να ποσοτικοποιήσουμε τα αποτελέσματα ενός ενημερωτικού προηγουμένου, συγκρίνουμε το BRIE με παρόμοιες μεθόδους που αναπτύχθηκαν για μαζικό RNA-seq: MISO v0.5.3 [8], μια από τις πρώτες και ακόμη πολύ ευρέως χρησιμοποιούμενες πιθανολογικές μεθόδους, και DICE-seq v0.2.6 [9], μια τροποποίηση του MISO με χρήση ενημερωτικών προτεραιοτήτων (για πολλαπλά χρονικά σημεία). Για πληρότητα, συγκρίνουμε επίσης με το Kallisto [12], το οποίο προτάθηκε πρόσφατα ως ένα από τα πιο αποτελεσματικά υπολογιστικά και ισχυρά εργαλεία ποσοτικοποίησης. Για να προσομοιώσουμε την επίδραση της παλινδρόμησης πριν, εισαγάγαμε μια βοηθητική μεταβλητή με συσχέτιση 0,8 με τους επιθυμητούς λόγους συμπερίληψης (η τιμή συσχέτισης επιλέχθηκε για να ταιριάζει με την εμπειρική απόδοση της παλινδρόμησης του BRIE πριν από τα μαζικά δεδομένα RNA-seq στο Πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S1 ). Εξετάζουμε επίσης την περίπτωση που η βοηθητική μεταβλητή του BRIE δεν συσχετίζεται με τον λόγο συμπερίληψης (που συμβολίζεται ως BRIE.Null) ως στοιχείο ελέγχου. Χάρη στο ενημερωτικό προηγούμενο, το BRIE μπορεί επίσης να παράσχει έναν καταλογισμό για μεταγραφές εγκατάλειψης (βλ. παρακάτω), τις οποίες άλλες μέθοδοι δεν μπορούν να διατηρήσουν δίκαιη την προσομοίωση, δεν συμπεριλάβαμε αποτελέσματα για τα γονίδια που εγκατέλειψαν το σχολείο.

Στην προσομοίωση, ορίσαμε διαφορετικά επίπεδα κάλυψης με RPK (αναγνώσεις ανά κιλοβάση) που κυμαίνονται από 25 έως 400. Το σχήμα 2 δείχνει ξεκάθαρα ότι ένα ενημερωτικό προηγούμενο μπορεί να επιφέρει πολύ σημαντικές βελτιώσεις απόδοσης σε χαμηλή κάλυψη. Στο χαμηλότερο επίπεδο RPK, το BRIE επιτυγχάνει κέρδος σχεδόν 20% σε σχέση μεταξύ εκτιμήσεων και βασικής αλήθειας. Επιπλέον, αυτό το επίπεδο ακρίβειας διατηρείται ουσιαστικά από το BRIE σε όλες τις τιμές κάλυψης. Είναι ενδιαφέρον ότι το BRIE.Null μπορεί ακόμα να επιτύχει συγκρίσιμη ακρίβεια με τις άλλες μεθόδους σε όλες τις τιμές κάλυψης. Ως εκ τούτου, ακόμη και όταν δεν ήταν δυνατή η αποτελεσματική εκμάθηση ενός ενημερωτικού προηγούμενου, τα αποτελέσματα του BRIE δεν θα ήταν χειρότερα από τη χρήση μιας προηγμένης μεθόδου μαζικού RNA-seq.

Το BRIE βελτιώνει τις εκτιμήσεις ισομορφών χρησιμοποιώντας ένα ενημερωτικό προηγούμενο σε προσομοιωμένα δεδομένα. α, β Σε πολύ χαμηλή κάλυψη RPK =25, μια γραφική παράσταση διασποράς μεταξύ των εκτιμήσεων των αναλογιών συμπερίληψης εξονίων από το BRIE και της αλήθειας της προσομοίωσης. ένα Το BRIE.Null χρησιμοποιεί πέντε τυχαία ομοιόμορφα κατανεμημένα χαρακτηριστικά για να μάθει το προηγούμενο. σι Το BRIE χρησιμοποιεί ένα συσχετισμένο χαρακτηριστικό με το Pearson R=0,8 στην αλήθεια για να μάθουμε ένα ενημερωτικό προηγούμενο. ντο του Pearson R μεταξύ αλήθειας και εκτίμησης από BRIE, BRIE.Null και τρεις άλλες μεθόδους για διαφορετικές καλύψεις. RPK αναγνώσεις ανά κιλοβάση

Καταλογισμός εγκατάλειψης στην προσομοίωση

Το ενημερωτικό προηγούμενο που μάθαινε το BRIE μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για να υπολογίσει τη χρήση ισομορφών όταν υπάρχει διακοπή, δηλ. όταν δεν ακολουθούνται αναγνώσεις για μια εκφρασμένη ισομορφή. Σε πειράματα scRNA-seq, οι εγκαταλείψεις εμφανίζονται ευρέως [5], αν και μερικές φορές είναι δύσκολο να εντοπιστούν με ακρίβεια, εκτός από τα RNA spike-in. Εδώ, θα μπορούσαμε να ορίσουμε χονδρικά το άνω όριο μετρώντας συμβάντα παράλειψης εξονίων που εκφράζονται σε μαζικά κύτταρα αλλά όχι σε ένα δεδομένο κύτταρο. Στο πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S3, βλέπουμε ότι μετά την κατάργηση των γεγονότων εγκατάλειψης, η συσχέτιση των επιπέδων έκφρασης μεταξύ ενός μεμονωμένου κελιού και κελιών όγκου είναι δραματικά υψηλότερη για αυτά τα συμβάντα ματίσματος.

Καθώς το BRIE μπορεί να μεταφέρει πληροφορίες από ένα γονίδιο υψηλής έκφρασης σε γονίδια χαμηλής έκφρασης σε πολλαπλά κύτταρα, ερευνήσαμε την απόδοση του BRIE στην απόδοση της χρήσης ισομορφής σε περίπτωση διακοπής. Επομένως, το προφίλ έκφρασης από μια μαζική βιβλιοθήκη RNA-seq και το προφίλ πιθανότητας εγκατάλειψης που εκτιμήθηκε από 96 βιβλιοθήκες scRNA-seq ανθρώπινων κυττάρων HCT116 [13] (βλ. Πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S4) χρησιμοποιήθηκαν για την προσομοίωση (βλ. λεπτομέρειες προσομοίωσης στην ενότητα «Μέθοδοι»). Πρόσθετο αρχείο 1: Το Σχήμα S5 δείχνει ότι το BRIE μπορεί να παράγει έναν καλό καταλογισμό της χρήσης ισομορφών απλώς λαμβάνοντας τον μέσο όρο της πληροφοριακής προηγούμενης γνώσης από τα χαρακτηριστικά αλληλουχίας των εκφραζόμενων γονιδίων (Pearson's R=0.6–0.7).

Το BRIE αποδίδει ισχυρές εκτιμήσεις ματίσματος σε πραγματικά δεδομένα

Για να αξιολογήσουμε την απόδοση του BRIE σε πραγματικά δεδομένα scRNA-seq, χρησιμοποιήσαμε 96 scRNA-seq βιβλιοθήκες από μεμονωμένα ανθρώπινα κύτταρα HCT116 από τη μελέτη αναφοράς scRNA-seq των Wu et al. [13] (ανατρέξτε στην ενότητα «Μέθοδοι» για λεπτομέρειες). Είναι σημαντικό ότι ένα μεγάλο σύνολο δεδομένων RNA-seq στις ίδιες συνθήκες ελήφθη επίσης από ένα εκατομμύριο κύτταρα. Για να εξερευνήσουμε καλύτερα την απόδοση σε πραγματικά δεδομένα, επεκτείναμε το σύνολο των ανταγωνιστικών μεθόδων για να συμπεριλάβουμε Μανικετόκουμπα v2.2.1 [7], RSEM v1.3.0 και την πρόσφατα προτεινόμενη μέθοδο ποσοτικοποίησης ενός κυττάρου Census (στο Monocle v2.2.0) που βασίζεται στα μανικετόκουμπα Fragments Per Kilobase per Million (FPKM) [14]. Το Σχήμα 3 δείχνει τα αποτελέσματα: Το BRIE ξεπερνά σαφώς όλες τις άλλες μεθόδους με μεγάλο περιθώριο, τόσο ως προς τη συσχέτιση μεταξύ εκτιμήσεων από διαφορετικά μεμονωμένα κελιά (Εικ. 3στ) όσο και ως προς τις συσχετίσεις μεταξύ εκτιμήσεων από μεμονωμένα μεμονωμένα κελιά και όγκου (Εικ. 3γ). Παραδείγματα διαγραμμάτων διασποράς και για τις δύο συγκρίσεις δίνονται στα Σχ. 3ε και β, δείχνοντας σαφώς πολύ συνεπείς προβλέψεις. Σημειωτέον, η απόδοση άλλων μεθόδων υποβαθμίστηκε έντονα από την αδυναμία χειρισμού των μεγάλων ποσοστών εγκατάλειψης (βλ. Εικ. 3a και d για DICE-seq, όπου πολλές εκτιμήσεις ματίσματος επικεντρώνονται γύρω από την μη πληροφοριακή τιμή προηγούμενης 0,5). Η υψηλή συσχέτιση μεταξύ χύδην και scRNA-seq προβλέψεων είναι ιδιαίτερα αξιοσημείωτη, καθώς η ανάλυση των δύο συνόλων δεδομένων δεν γίνεται με κοινό προηγούμενο. Παρόμοια επίπεδα συσχέτισης βρέθηκαν μεταξύ των εκτιμήσεων ματίσματος που λήφθηκαν από το BRIE σε μεμονωμένα κύτταρα και των εκτιμήσεων από τον όγκο RNA-seq που ελήφθη με άλλες μεθόδους (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S6).

Το BRIE βελτιώνει τις εκτιμήσεις ματίσματος χρησιμοποιώντας χαρακτηριστικά ακολουθίας. μετα Χριστον Η συσχέτιση του Pearson μεταξύ χύδην και μεμονωμένων κυττάρων στην αναλογία εγκλεισμού εξονίων ψ σε κύτταρα HCT116. Οικόπεδο διασποράς του ψ εκτιμήσεις από DICEseq (ένα) ή εκτιμάται από BRIE (σι). Διάγραμμα πλαισίου για όλες τις μεθόδους (ντο) σε 96 κελιά. δ–στ Η συσχέτιση του Pearson μεταξύ ζευγών μονοκυττάρων. Οικόπεδο διασποράς του ψ εκτιμήσεις από DICEseq (ρε) ή εκτιμάται από BRIE (μι). Διάγραμμα πλαισίου για όλες τις μεθόδους (φά) σε 4608 ζεύγη κελιών

Αυτά τα στατιστικά πλεονεκτήματα αντικατοπτρίζονται σε μια πιο αποτελεσματική και σίγουρη ποσοτικοποίηση: λαμβάνοντας υπόψη γονίδια με ποσοτική αβεβαιότητα μικρότερη από 0,3 (ένα όριο που υιοθετήθηκε, π.χ. στο [15] για επιλογή για ανάλυση κατάντη), Πρόσθετο αρχείο 1: Το σχήμα S7 δείχνει ότι το BRIE διατήρησε το 10,9 % από 11.478 γονίδια κατά μέσο όρο από κάθε μεμονωμένο κύτταρο, σε σύγκριση με 3,1 % και 5,6 % για το MISO και το DICE-seq, αντίστοιχα.

Το BRIE δίνει υψηλότερη ευαισθησία στις αναλύσεις διαφορικού ματίσματος

Το BRIE μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για ανίχνευση διαφορικού ματίσματος σε διαφορετικά σύνολα δεδομένων. Για να γίνει αυτό, υπολογίζουμε την αναλογία αποδείξεων (παράγοντας Bayes, BF) μεταξύ ενός μοντέλου όπου τα δύο σύνολα δεδομένων αντιμετωπίζονται ως αντίγραφα (μηδενική υπόθεση) και ενός εναλλακτικού μοντέλου όπου τα δύο σύνολα δεδομένων αντιμετωπίζονται ως ξεχωριστά. Χρησιμοποιούμε την προσέγγιση αναλογίας πυκνότητας Savage–Dickey και τη χαλαρώνουμε για να αποκτήσουμε πιο αξιόπιστες εκτιμήσεις (βλ. ενότητα «Μέθοδοι»). Παρατηρήστε ότι υπάρχουν διάφοροι τρόποι με τους οποίους θα μπορούσαν να πραγματοποιηθούν διαφορικές συγκρίσεις: θα μπορούσαμε να συγκρίνουμε ομάδες κελιών ή μεμονωμένα κελιά και θα μπορούσαμε να μοιραστούμε τη μάθηση του προηγούμενου σε όλες τις συνθήκες ή να μάθουμε ξεχωριστά. Όλες αυτές οι επιλογές υποστηρίζονται στο λογισμικό BRIE.

Για να αξιολογήσουμε την αποτελεσματικότητα αυτής της στρατηγικής, στραφήκαμε και πάλι σε μια μελέτη προσομοίωσης, διερευνώντας την ικανότητα του BRIE να ανιχνεύει διαφορικό μάτισμα καθώς ποικίλλουμε την κάλυψη και την έκταση του διαφορικού αποτελέσματος (βλ. ενότητα «Μέθοδοι» για λεπτομέρειες της προσομοίωσης). Αυτή η συγκριτική αξιολόγηση είναι σημαντική, καθώς το ενημερωτικό προηγούμενο μπορεί να αναμένεται να εμποδίσει τη διαφορική ποσοτικοποίηση. Στην πράξη, βλέπουμε ότι, για σημαντικά μεγέθη εφέ (Δ ψ=0,6), μπορούμε να ανιχνεύσουμε ένα σημαντικό κλάσμα διαφορικά ματισμένων γονιδίων ήδη στα 50 RPK, βελτιώνοντας περαιτέρω όταν το μέγεθος του εφέ είναι 0,8 (Επιπλέον αρχείο 1: Εικόνα S8a). Χρησιμοποιούμε επίσης την προσομοίωση για να διερευνήσουμε την επίδραση διαφορετικών μεγεθών βιβλιοθήκης στις διαφορικές συγκρίσεις μας. Αυτό το κάνουμε στερεώνοντας ένα από τα κελιά σύγκρισης σε επίπεδο RPK. Τα αποτελέσματα που εμφανίζονται στο πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S8b, c δείχνουν ότι το BRIE είναι ανθεκτικό σε ζητήματα κανονικοποίησης. Αυτό δεν προκαλεί έκπληξη, καθώς οι αλγόριθμοι σχετικής ποσοτικοποίησης συνδυάζουν συνήθως την κανονικοποίηση με την εκτίμηση (βλ. [14] για μια συζήτηση αυτού του θέματος στο πλαίσιο scRNA-seq).

Στη συνέχεια, ερευνήσαμε την αποτελεσματικότητα του BRIE για την ανίχνευση διαφορικού ματίσματος σε πραγματικά κύτταρα. Για να εκτιμήσουμε ένα επίπεδο διαφορικού ματίσματος υποβάθρου μεταξύ πανομοιότυπων κυττάρων, εξετάσαμε ξανά τις 20 βιβλιοθήκες HCT116 μονοκυττάρων από τους Wu et al. [13] και συνέκρινε όλα τα πιθανά ζεύγη κυττάρων. Το Σχήμα 4α δείχνει το κλάσμα των γονιδίων που ονομάζονται ως διαφορικά ματισμένα σε διαφορετικά κατώφλια BF σε αυτό το πείραμα ελέγχου. Όπως μπορούμε να δούμε, αυτός ο αριθμός είναι πάντα πολύ μικρός και περίπου 1 % στο κανονικά συνιστώμενο όριο BF =10. Αυτό το επίπεδο κλήσης παρασκηνίου θα μπορούσε εν μέρει να αποδοθεί στην εγγενή στοχαστικότητα ή σε υπολειπόμενη φυσιολογική μεταβλητότητα που δεν ελεγχόταν στο πείραμα, όπως η φάση του κυτταρικού κύκλου. Ως πρόσθετη σύγκριση, εξετάσαμε δύο μεθόδους μαζικού RNA-seq για διαφορικό μάτισμα, το MISO και το πρόσφατα προτεινόμενο rMATS [16]. Και οι δύο μέθοδοι θα μπορούσαν να καλέσουν μόνο έναν αμελητέο αριθμό γεγονότων, πολύ λιγότερο από τον αναμενόμενο αριθμό ψευδώς θετικών, επιβεβαιώνοντας ότι οι μαζικές μέθοδοι δεν είναι κατάλληλες για ανάλυση ματίσματος scRNA-seq.

Ανίχνευση διαφορικού ματίσματος μεταξύ κυττάρων. ένα Ποσοστό γεγονότων διαφορικής ματίσματος μεταξύ ανθρώπινων κυττάρων HCT116, που ανιχνεύθηκαν από τα MISO, rMATS, BRIE και τη λειτουργία του με κοινά βάρη (δηλ. BRIE.share) με διαφορετικά κατώφλια. Τα MISO και BRIE χρησιμοποιούν τον παράγοντα Bayes (BF) και το rMATS χρησιμοποιεί ψευδή ρυθμό ανακάλυψης (q αξία). σι Ποσοστό συμβάντων διαφορικής ματίσματος μεταξύ πρώιμων εμβρυϊκών κυττάρων ποντικού την ημέρα 6,5 ή την ημέρα 7,75. Το όριο είναι BF >10 για MISO και BRIE, και q<0,05 για rMATS. ο διαμάντι υποδεικνύει συγκεντρωτικές αναγνώσεις 20 κελιών σε κάθε ομάδα. ντο Ένα παράδειγμα συμβάντος παράλειψης εξονίων στο DNMT3B σε τρία κύτταρα ποντικού στις 6,5 ημέρες και τρία κύτταρα στις 7,75 ημέρες. ο αριστερό πάνελ είναι μια γραφική παράσταση sashimi της πυκνότητας ανάγνωσης και του αριθμού των αναγνώσεων διασταύρωσης. ο δεξιός πίνακας δείχνει την προηγούμενη κατανομή ως α μπλε καμπύλη και ένα ιστόγραμμα της οπίσθιας κατανομής στο μαύρος, και τα δύο έμαθε η BRIE. Για το ιστόγραμμα, το κόκκινη γραμμή είναι το μέσο και το διακεκομμένες γραμμές είναι το διάστημα εμπιστοσύνης 95%. BF παράγοντας Bayes

Στη συνέχεια εξετάσαμε ένα σύνολο δεδομένων scRNA-seq πρώιμης ανάπτυξης ποντικού [17] και συγκρίναμε τα μονοκύτταρα μεταγραφικά προφίλ από κύτταρα από έμβρυα ποντικού στις 6,5 και 7,75 ημέρες. Συγκρίναμε τόσο τα προφίλ μεμονωμένων κελιών στο ίδιο όσο και σε διαφορετικά χρονικά σημεία. Τα αποτελέσματα συνοψίζονται στο Σχ. 4β. Η σύγκριση μεμονωμένων κυττάρων στις 6,5 ημέρες έδωσε περίπου το 1 % των συμβάντων που ονομάζονται σημαντικά διαφορικά (BF ≥10) στις 6,5 ημέρες. Η σύγκριση αυτού του αποτελέσματος με την έρευνά μας για τα κύτταρα HCT116 υποδηλώνει ότι τα κύτταρα ποντικού στις 6,5 ημέρες εξακολουθούν να είναι σαν ένας ομοιογενής πληθυσμός, από την άποψη του ματίσματος.Το ποσοστό σχεδόν διπλασιάστηκε στις 7,75 ημέρες, υποδηλώνοντας ότι το διαφορικό μάτισμα γίνεται πιο διαδεδομένο σε αυτό το μεταγενέστερο στάδιο διαφοροποίησης. Ένα παρόμοιο κλάσμα συμβάντων παράλειψης εξονίων ονομάστηκε διαφορικά μεταξύ των κυττάρων στις 7,75 ημέρες και των κυττάρων στις 6,5 ημέρες. Για να ορίσουμε μια ομάδα γεγονότων παράβλεψης που σχετίζονται με τη διαφοροποίηση, θεωρήσαμε συμβάντα που ονομάσαμε διαφορικά σε τουλάχιστον 10 % των συγκρίσεων 7,75 έναντι 6,5. Τα προκύπτοντα 159 συμβάντα εμπλουτίστηκαν σε μεγάλο βαθμό για όρους γονιδιακής οντολογίας οργανιδίων και ενδοκυτταρικού μέρους (Π<0.01) (δείτε Πρόσθετο αρχείο 2: Πίνακες S1 και S2). Το Σχήμα 4γ δείχνει το παράδειγμα του DNMT3B, ενός ρυθμιστή της συντήρησης της μεθυλίωσης του DNA, ο οποίος είναι γνωστό ότι υφίσταται λειτουργικά σχετικό εναλλακτικό μάτισμα [18]. Το DNMT3B εμφάνισε διαφορικό μάτισμα μεταξύ 7,75 ημερών και 6,5 ημερών σε 153 από τις 400 συγκρίσεις μεταξύ μεμονωμένων μεμονωμένων κυττάρων, υπογραμμίζοντας ξεκάθαρα το ισχυρό διαφορικό αποτέλεσμα εγκλεισμού. Τέσσερα ακόμη παραδείγματα συμβάντων, τα οποία όλα δείχνουν διαφορικό μάτισμα σε περισσότερα από 100 ζεύγη συγκρίσεων, παρουσιάζονται στο πρόσθετο αρχείο 1: Εικόνα S9.

Συγκρίναμε επίσης απευθείας τις δύο ομάδες κυττάρων σε ένα μόνο τεστ (7,75 έναντι 6,5). Αυτό μπορεί εύκολα να επιτευχθεί με την υπόθεση μιας κοινής αναλογίας ματίσματος ψ σε όλα τα κύτταρα σε μια κατάσταση. Μαθηματικά, αυτό ισοδυναμεί με τον πολλαπλασιασμό των όρων πιθανότητας που σχετίζονται με κάθε κελί ή στην πράξη με τη συγκέντρωση των αναγνώσεων από διαφορετικά κελιά. Ενώ αυτό επιτυγχάνει υψηλότερη ισχύ (δείτε την κουκκίδα διαμαντιού στο Σχ. 4β), χάνει τη σημαντική ποσότητα της ετερογένειας από κύτταρο σε κύτταρο που τονίζεται από την ανάλυση ενός κυττάρου. Θα ήταν ενδιαφέρον να εξερευνήσουμε έναν πιο εκλεπτυσμένο τρόπο μερικής συγκέντρωσης εντός του ιεραρχικού μοντέλου [19] ή να συνδυάσουμε το BRIE με προσεγγίσεις ομαδοποίησης scRNA-seq που μπορούν να αναγνωρίσουν πιο ομοιογενείς ομάδες κυττάρων [2].


Τερματισμός μεταγραφής και πολυαδενυλίωση

Ο τερματισμός της μεταγραφής δεν είναι τόσο κατανοητός στους ευκαρυώτες όσο στους προκαρυωτικούς, αλλά γνωρίζουμε ότι ο τερματισμός συνδέεται με πολυαδενυλίωση του άκρου 3' του μεταγραφήματος.

Πολυαδενυλίωση

Θυμηθείτε ότι το CTD του RNA pol II είναι φωσφορυλιωμένο, πιστεύεται ότι η φωσφορυλίωση σε συγκεκριμένες θέσεις στο CTD στρατολογεί πρωτεΐνες που διασπούν το mRNA σε μια συγκεκριμένη αλληλουχία. Ενώ η RNA πολυμεράση II εξακολουθεί να μεταγράφεται, το προ-mRNA διασπάται από ένα σύμπλοκο πρωτεΐνης που περιέχει ενδονουκλεάση μεταξύ μιας συναινετικής αλληλουχίας AAUAAA και μιας αλληλουχίας πλούσιας σε GU. Αυτό απελευθερώνει το λειτουργικό mRNA από το υπόλοιπο της μεταγραφής, το οποίο εξακολουθεί να είναι συνδεδεμένο με την RNA Πολυμεράση. Ένα ένζυμο που ονομάζεται πολυ (Α) πολυμεράση (PAP) είναι μέρος του ίδιου συμπλέγματος πρωτεϊνών που διασπά το pre-mRNA και προσθέτει αμέσως μια σειρά από περίπου 200 νουκλεοτίδια Α, που ονομάζεται πολυ (Α) ουρά , στο 3' άκρο του μόλις διασπασμένου pre-mRNA. Η ουρά πολυ (Α) προστατεύει το mRNA από την αποικοδόμηση, βοηθά στην εξαγωγή του ώριμου mRNA στο κυτταρόπλασμα και εμπλέκεται στη δέσμευση πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην έναρξη της μετάφρασης. Όπως απεικονίζεται στο Σχήμα 3-15, παρόμοια με την προσθήκη του καλύμματος 5', η πολυαδενυλίωση εμφανίζεται επίσης στον πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων.

Λήξη

Μόλις απελευθερωθεί το mRNA, το RNA pol II συνεχίζει να μεταγράφει το DNA. Ο τερματισμός συμβαίνει όταν η αλληλεπίδραση RNA pol II με το εκμαγείο DNA εξασθενεί και η RNA πολυμεράση αποδεσμεύεται από το DNA. Δεν είναι σαφές πώς ακριβώς συμβαίνει αυτό, αλλά πιστεύεται ότι μια εξωνουκλεάση (που ονομάζεται Rat1) συνδέεται με το πρόσφατα διασπασμένο άκρο του RNA που προεξέχει από το RNA pol II. Η εξωνουκλεάση «μασάει» το RNA καθώς κινείται προς την RNA πολυμεράση. Αυτή η πρωτεΐνη μπορεί να προσεγγίσει το RNA pol II και να το κάνει να σταματήσει αυτή η παύση μπορεί να επιτρέψει σε μια άλλη πρωτεΐνη που έχει λειτουργία ελικάσης να δεσμεύσει και να ξετυλίξει την αλληλεπίδραση DNA/RNA που βρίσκεται κοντά στην ενεργό θέση της RNA πολυμεράσης. Αυτό μπορεί να προκαλέσει την πολύ αδύναμη αλληλεπίδραση της RNA πολυμεράσης με το εκμαγείο DNA και η πρωτεΐνη μπορεί να «πέσει» από το εκμαγείο, τερματίζοντας τη μεταγραφή (Εικόνα 3-15)

Εικόνα 3-15: Ένα μοντέλο τερματισμού σε ευκαρυώτες. (Α) Μια θέση διάσπασης αναγνωρίζεται στο mRNA και (Β) διασπάται από μια ενδονουκλεάση. Αυτό απελευθερώνει το mRNA. (Γ) Η εξωνουκλεάση Rat1 αρχίζει να διασπά το 5' άκρο του RNA που είναι ακόμα συνδεδεμένο με την RNA πολυμεράση II και η πολυμεράση Poly A (PAP) συνδέεται στο 3' άκρο του mRNA. (Δ) Ο Rat1 συνεχίζει να «μασάει» το RNA μέχρι να χτυπήσει φυσικά το RNA pol II και να αποσταθεροποιήσει την αλληλεπίδραση του pol II με το DNA και τελικά να «πέσει». Επιπλέον, το PAP προσθέτει πολλά νουκλεοτίδια αδενίνης στο 3' άκρο του απελευθερωμένου mRNA. Σημειώστε ότι σε αυτό το σημείο το mRNA έχει κάλυμμα 5', έχει ματιστεί και μόλις πολυαδενυλιωθεί, θα είναι έτοιμο για εξαγωγή από τον πυρήνα.


Το μάτισμα RNA αντιπροσωπεύει έναν μετα-μεταγραφικό μηχανισμό για τη δημιουργία πολλαπλών λειτουργικών RNA ή πρωτεϊνών από ένα μόνο αντίγραφο. Η εξέλιξη του ματίσματος RNA είναι ένα χαρακτηριστικό παράδειγμα της δαρβινικής συνάρτησης που ακολουθεί την έννοια της μορφής. Μια μετάλλαξη που οδηγεί σε ένα νέο mRNA (μορφή) που κωδικοποιεί μια νέα λειτουργική πρωτεΐνη (λειτουργία) είναι πιθανό να διατηρηθεί και με αυτόν τον τρόπο, το γονιδίωμα έχει σταδιακά εξελιχθεί ώστε να κωδικοποιεί γονίδια με πολλαπλές ισομορφές, δημιουργώντας έτσι ένα εξαιρετικά διαφορετικό μεταγραφικό . Οι πρόοδοι στις τεχνολογίες για τον χαρακτηρισμό πληθυσμών RNA έχουν οδηγήσει σε καλύτερη κατανόηση της επεξεργασίας RNA στην υγεία και τις ασθένειες. Στην καρδιά, το εναλλακτικό μάτισμα αναγνωρίζεται όλο και περισσότερο ως ένα σημαντικό στρώμα ρύθμισης γονιδίων μετά τη μεταγραφή. Επιπλέον, η πρόσφατη αναγνώριση αρκετών καρδιακών παραγόντων ματίσματος, όπως η πρωτεΐνη μοτίβου 20 που δεσμεύει το RNA και η SF3B1, όχι μόνο παρείχε σημαντική εικόνα για τους μηχανισμούς που διέπουν το εναλλακτικό μάτισμα, αλλά αποκάλυψε επίσης πώς αυτοί οι παράγοντες ματίσματος επηρεάζουν τις λειτουργικές ιδιότητες της καρδιάς. Εδώ, επανεξετάζουμε τις τρέχουσες γνώσεις μας σχετικά με το εναλλακτικό μάτισμα στην καρδιά, με ιδιαίτερη έμφαση στο μείζον και το ελάσσονα μάτισμα, τους παράγοντες που ελέγχουν το μάτισμα RNA και τον ρόλο του εναλλακτικού ματίσματος στην καρδιακή ανάπτυξη και νόσο.

Εισαγωγή

Το μάτισμα RNA, μια μετα-μεταγραφική διαδικασία που είναι απαραίτητη για να σχηματιστεί ένα ώριμο mRNA, ανακαλύφθηκε στα τέλη της δεκαετίας του 1970. 1 Έχουν οριστεί δύο διαφορετικοί τρόποι συναρμογής, δηλαδή το συστατικό μάτισμα και το εναλλακτικό μάτισμα. Το συστατικό μάτισμα είναι η διαδικασία αφαίρεσης ιντρονίων από το προ-mRNA και ένωσης των εξονίων για να σχηματιστεί ένα ώριμο mRNA. Το εναλλακτικό μάτισμα, από την άλλη πλευρά, είναι η διαδικασία όπου τα εξόνια μπορούν να συμπεριληφθούν ή να εξαιρεθούν σε διαφορετικούς συνδυασμούς για να δημιουργηθεί μια ποικιλόμορφη σειρά μεταγραφών mRNA από ένα μόνο προ-mRNA και επομένως χρησιμεύει ως διαδικασία για την αύξηση της ποικιλομορφίας του μεταγραφώματος. Ο εκτιμώμενος αριθμός εναλλακτικών γεγονότων ματίσματος στο ανθρώπινο μεταγραφικό έχει αυξηθεί απότομα τις τελευταίες δεκαετίες. Στη δεκαετία του 1980, θεωρήθηκε ότι περίπου το 5% των ανθρώπινων γονιδίων υποβλήθηκαν σε εναλλακτικό μάτισμα. 2 Το 2002, αυτός ο αριθμός είχε αυξηθεί στο 60%, 3 και τώρα, μετά την εφαρμογή των τεχνολογιών αλληλουχίας επόμενης γενιάς, γνωρίζουμε ότι η συντριπτική πλειονότητα, >95% των mRNAs, υποβάλλονται σε εναλλακτικό μάτισμα. 4 Ωστόσο, η λειτουργία ενός μεγάλου κλάσματος αυτών των ισομορφών ματίσματος μένει να διευκρινιστεί. Επιπλέον, αναμένεται ότι σε διαφορετικούς ιστούς ή σε ιστούς με διαφορετικές ασθένειες, μένουν ακόμη να εντοπιστούν νέες ισομορφές. 5

Η διαδικασία ματίσματος διατηρείται σε μεγάλο βαθμό κατά τη διάρκεια της εξέλιξης. Το μάτισμα είναι πιο διαδεδομένο στους πολυκύτταρους παρά στους μονοκύτταρους ευκαρυώτες λόγω του μικρότερου αριθμού γονιδίων που περιέχουν ιντρόνιο στα τελευταία. 6 Αργότερα στην εξέλιξη, το εναλλακτικό μάτισμα γίνεται πιο διαδεδομένο στα σπονδυλωτά παρά στα ασπόνδυλα. Είναι ενδιαφέρον ότι μόνο ένα γεγονός παράκαμψης εξονίων στην πρωτεΐνη δέσμευσης RNA (RBP), η πρωτεΐνη 1 που δεσμεύει την οδό πολυπυριμιδίνης έχει αποδειχθεί ότι κατευθύνει πολυάριθμες εναλλακτικές αλλαγές ματίσματος μεταξύ των ειδών, υποδεικνύοντας ότι ένα μόνο συμβάν μάτισης μπορεί να ενισχύσει την ποικιλομορφία μεταγραφομένων μεταξύ των ειδών. 7 Η πρόσφατη παρατήρηση ότι ο συνολικός αριθμός των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες δεν διαφέρει πολύ μεταξύ των ειδών, τροφοδότησε την υπόθεση ότι το εναλλακτικό μάτισμα συμβάλλει σε μεγάλο βαθμό στην ποικιλομορφία του οργανισμού. Και πράγματι, καθώς ανεβαίνουμε στο φυλογενετικό δέντρο, η πολυπλοκότητα εναλλακτικών ματίσματος αυξάνεται, με την υψηλότερη πολυπλοκότητα στα πρωτεύοντα. 8,9

Ο στόχος αυτής της ανασκόπησης είναι να δώσει μια ολοκληρωμένη επισκόπηση όλων των πτυχών του συστατικού και εναλλακτικού ματίσματος και των ρυθμιστών τους, καθώς και της σημασίας αυτών των διαφορετικών πτυχών στην ανθρώπινη ασθένεια, με έμφαση στην καρδιά. Επιπλέον, συζητάμε πιθανές θεραπευτικές παρεμβάσεις και προσπαθούμε να αποκαλύψουμε πιθανές μελλοντικές κατευθύνσεις έρευνας.

Major και Minor Spliceosome

Το μάτισμα RNA εκτελείται από το μάτισμα, ένα μεγάλο και δυναμικό σύμπλεγμα ριβονουκλεοπρωτεϊνών που αποτελείται από πρωτεΐνες και μικρά πυρηνικά RNA (snRNA), το οποίο συναρμολογείται στο προ-mRNA (Εικόνα 1). Οι ριβονουκλεοπρωτεΐνες αποτελούνται από 1 ή 2 μικρά πυρηνικά RNA (snRNAs U1, U2, U4/U6 ή U5) και έναν μεταβλητό αριθμό ειδικών για το σύμπλοκο πρωτεϊνών. 10 Πρωτεομικές αναλύσεις καθαρισμένων ανθρώπινων συμπλεγμάτων ματίσματος έχουν δείξει ότι εκατοντάδες πρωτεΐνες μπορούν να συσχετιστούν με το μάτισμα κατά τη διαδικασία ματίσματος. 11 Αυτές οι πρωτεΐνες παίζουν κρίσιμους ρόλους όχι μόνο στην αναγνώριση των θέσεων ματίσματος αλλά και στη σωστή τοποθέτηση του pre-mRNA για κατάλυση. Στα μέσα της δεκαετίας του 1990, 2 δεκαετίες μετά την ανακάλυψη του ματίσματος, οι Tarn και Steitz 12 αναγνώρισαν ένα δεύτερο μάτισμα. Αυτό το δεύτερο μάτισμα ονομάστηκε ελάσσονα μάτισμα και στοχεύει μια δευτερεύουσα τάξη (<1%) ιντρονίων (Εικόνα 2). Το δευτερεύον μάτισμα είναι λειτουργικά ανάλογο με το κύριο μάτισμα, αλλά διαφέρει στη χρήση των snRNA (τα δευτερεύοντα snRNA είναι τα U11, U12, U4atac/U6atac και U5). Επειδή το κύριο μάτισμα χρησιμοποιεί τη μικρή πυρηνική ριβονουκλεοπρωτεΐνη U2 (snRNP) και το δευτερεύον μάτισμα το U12 snRNP, τα κύρια ιντρόνια ονομάζονται ιντρόνια τύπου U2 και τα δευτερεύοντα ιντρόνια είναι εσώνια τύπου U12. Αν και το δευτερεύον μάτισμα λειτουργεί με παρόμοιο τρόπο με το κύριο μάτισμα, υπάρχουν ορισμένες ευδιάκριτες διαφορές. Πρώτον, οι αλληλουχίες της θέσης ματίσματος 5', της θέσης ματίσματος 3' και της αλληλουχίας σημείου διακλάδωσης διαφέρουν μεταξύ των 2 ματισμάτων (Εικόνα 2Β και 2Γ). 13 Δεύτερον, το μάτισμα που διεξάγεται από το κύριο μάτισμα συμβαίνει αυστηρά στον πυρήνα, ενώ το μάτισμα από το δευτερεύον μάτισμα συμβαίνει κυρίως στο κυτταρόπλασμα. 14 Τρίτον, το δευτερεύον μάτισμα έχει σημαντικά πιο αργό ρυθμό ματίσματος και επομένως μπορεί να είναι το περιοριστικό βήμα στην ωρίμανση ενός mRNA. 15 Τέταρτον, το δευτερεύον μάτισμα σπάνια παράγει εναλλακτικές ισομορφές 16 και φαίνεται ότι χρησιμοποιείται κυρίως ως μηχανισμός για τον έλεγχο της έκφρασης γονιδίων που περιέχουν ιντρόνια δευτερεύουσας τάξης. Από αυτή την άποψη, είναι γνωστό ότι η διατήρηση ενός ιντρονίου δευτερεύουσας τάξης γενικά οδηγεί σε υποβάθμιση της μεταγραφής. 17 Ο λόγος για την ύπαρξη 2 διαφορετικών ματισμάτων δεν είναι πλήρως κατανοητός, αλλά έχει προταθεί ότι το δευτερεύον μάτισμα δρα στο κυτταρόπλασμα για να αποφύγει την εξάρτηση από έναν λειτουργικό πυρήνα. Αυτό έχει 1 σημαντικό πλεονέκτημα όταν κατά τη διάρκεια της κυτταρικής διαίρεσης, το πυρηνικό περίβλημα διασπάται, ενώ υπάρχει ακόμα μικρό μάτισμα. Σε συμφωνία με αυτό, έχει αποδειχθεί ότι το μικρό μάτισμα είναι ενεργό κατά τη μίτωση και σημαντικό για τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων. 14 Η υψηλή εξελικτική διατήρηση και το γεγονός ότι το μικρό μάτισμα συμβαίνει μόνο σε <1% των ιντρονίων υποδηλώνουν ότι το δευτερεύον μάτισμα δεν είναι υποκατάστατο για το κύριο μάτισμα, αλλά μάλλον μια ξεχωριστή διαδικασία. Ίσως χρησιμεύει ως τελικός έλεγχος του mRNA στο κυτταρόπλασμα, και έτσι ελέγχει μετα-μεταγραφικά την έκφραση ενός συγκεκριμένου υποσυνόλου γονιδίων. Παρόλο που το ελάσσονα μάτισμα είναι πολύ λιγότερο άφθονο από το μείζον μάτισμα 18, η σημασία του υπογραμμίζεται από το γεγονός ότι οι μεταλλάξεις στα δευτερεύοντα snRNAs ματίσματος U4atac οδηγούν σε σοβαρές αναπτυξιακές διαταραχές όπως ο μικροκεφαλικός οστεοδυσπλαστικός αρχέγονος νανισμός τύπου 1. 19 Ήταν ενδιαφέρον πρόσφατα έδειξε ότι η χρήση του δευτερεύοντος ματίσματος αυξάνεται ταχέως με την ενεργοποίηση της ενεργοποιημένης από κυτταρικό στρες κινάσης πρωτεΐνης κινάσης ρ38 ενεργοποιημένης από μιτογόνο (MAPK) μέσω σταθεροποίησης του U6atac. 17 Αυτό είχε ως αποτέλεσμα την αυξημένη έκφραση εκατοντάδων δευτερευόντων γονιδίων που περιέχουν ιντρόνιο. Επειδή τα mRNA με διατηρούμενα ελάσσονα εσώνια συχνά αποικοδομούνται μέσω της οδού διάσπασης με τη μεσολάβηση μη νόημα (NMD) (Εικόνα 2Α), η ενεργοποίηση της ρ38 MAPK μπορεί να πυροδοτήσει τη χρήση ελάσσονος ματίσματος και επομένως να ελέγξει την έκφραση γονιδίου ως απόκριση στο στρες.

Φιγούρα 1. Αντίδραση ματίσματος δύο σταδίων. Το μάτισμα γίνεται σε 2 βήματα μεταφρ-αντίδραση εστεροποίησης για απομάκρυνση ιντρονίων και ένωση εξονίων μεταξύ τους. Στο πρώτο βήμα, η μικρή πυρηνική ριβονουκλεοπρωτεΐνη U1 (snRNP) συγκεντρώνεται στη θέση ματίσματος 5' ενός εξονίου και η U2 snRNP στην αλληλουχία σημείου διακλάδωσης (BPS), ακριβώς ανάντη της θέσης ματίσματος 3' του παρακείμενου/κατάντη εξονίου. Αυτή η διαμόρφωση είναι γνωστή ως prespliceosome. Στη συνέχεια, τα U1 και U2 ενώνονται με τα σύμπλοκα snRNPs U5 και U4–U6 για να σχηματίσουν το προκαταλυτικό μάτισμα. Στη συνέχεια, τα συμπλέγματα U4–U6 ξετυλίγονται, απελευθερώνοντας τα U4 και U1 από το προπληχοσωματικό σύμπλεγμα. Αυτό επιτρέπει στο U6 να ζευγαρώσει τη βάση με τη θέση ματίσματος 5′ και το BPS. Η θέση ματίσματος 5' διασπάται, γεγονός που οδηγεί σε μια ελεύθερη ομάδα 3' ΟΗ στο ανάντη εξόνιο και σε μια διακλαδισμένη ιντρονική περιοχή στο κατάντη εξόνιο, που ονομάζεται λαριάτιο ιντρονίου. Κατά τη διάρκεια του δεύτερου βήματος, το U5 ζευγαρώνει με αλληλουχίες τόσο στη θέση ματίσματος 5' και 3', τοποθετώντας τα 2 άκρα μαζί. Η ομάδα 3' ΟΗ του ανάντη (5') εξονίου συγχωνεύεται με τη διασταύρωση 3' ιντρονίου-εξονίου, ενώνοντας έτσι τα 2 εξόνια και αποκόπτοντας το ιντρόνιο με τη μορφή ενός λαριατίου ιντρονίου σε σχήμα λάσο. Τέλος, το μάτισμα αποσυναρμολογείται και όλα τα συστατικά ανακυκλώνονται για μελλοντικές αντιδράσεις ματίσματος.

Σχήμα 2. Μείζον και δευτερεύον μάτισμα. ΕΝΑ, Κύρια και ελάσσονα μάτισμα. Τα κύρια εσώνια ματίζονται και τα δευτερεύοντα εσώνια είτε διατηρούνται (και το mRNA αποικοδομείται πιο συχνά στη συνέχεια) είτε το δευτερεύον εσώνιο ματίζεται και σχηματίζεται ένα ώριμο mRNA. σι, Τα 4 βασικά σήματα ματίσματος είναι η θέση δότη ματίσματος 5', η θέση δέκτη ματίσματος 3', η αλληλουχία σημείου διακλάδωσης (BPS) και η οδός πολυπυριμιδίνης (PT). Τα συρματοσωματικά συστατικά αναγνωρίζουν και συνδέονται με αυτές τις αλληλουχίες και μεσολαβούν στην αντίδραση ματίσματος. Οι ενισχυτές και οι σιγαστήρες ιντρονικών και εξωνικών ματίσματος καθορίζουν τον ρυθμό συμπερίληψης των εξονίων. Το BPS (μείζον, δευτερεύον YNYURAY, UCCUUAACU) βρίσκεται 20 έως 50 bp ανάντη της θέσης ματίσματος 3′ και το PT (Y10–12) βρίσκεται μεταξύ του BPS και της θέσης ματίσματος 3′ (N=οποιοδήποτε νουκλεοτίδιο, Y=C ή U, R=A, ή G και S=C ή G). ντο, Το δευτερεύον μάτισμα χρησιμοποιεί διαφορετικές θέσεις ματίσματος 5' και 3' και BPS και στερείται του PT. Το ESE υποδεικνύει ενισχυτές εξωνικού ματίσματος ESS, σιγαστήρες εξωνικού ματίσματος ISE, σιγαστήρες ιντρονικής συναρμογής και ISS, σιγαστήρες ιντρονικής μάτισης.

Διαφορετικοί τύποι εναλλακτικών συρραφών

Το εναλλακτικό μάτισμα είναι η διαδικασία όπου το μάτισμα επιλέγει να συμπεριλάβει ή να αποκλείσει συγκεκριμένα μέρη του mRNA. Τέσσερις τρόποι εναλλακτικού ματίσματος παρατηρούνται γενικά: (1) παράκαμψη εξονίου, (2) αμοιβαία αποκλειστική χρήση εξονίων, (3) επιλογή εναλλακτικής θέσης ματίσματος και (4) διατήρηση ιντρονίων (Εικόνα 3Α). Η παράκαμψη εξονίου, η πιο διαδεδομένη μορφή εναλλακτικού ματίσματος σε ανώτερους ευκαρυώτες, 20 υποδηλώνει την εκτομή ≥1 εξονίων και των περιβαλλόντων εσωνίων του από ένα προ-mRNA. Η αμοιβαία αποκλειστική χρήση εξονίων αντιπροσωπεύει μια μορφή παράλειψης εξονίων όπου είτε το ένα είτε το άλλο εξόνιο, αλλά ποτέ και τα δύο, περιλαμβάνεται στο ώριμο mRNA. Η εναλλακτική επιλογή θέσης ματίσματος βασίζεται στη δυνατότητα χρήσης διαφορετικών θέσεων ματίσματος στο 5' και 3' άκρο ενός εξονίου, με αποτέλεσμα μακρύτερα ή μικρότερα εξόνια από το ίδιο αντίγραφο. Η τελευταία μορφή είναι η κατακράτηση ιντρονίου, μια διαδικασία κατά την οποία (μέρος) ενός ιντρονίου διατηρείται στο ώριμο μεταγράφημα mRNA.

Εικόνα 3. Διαφορετικοί τύποι εναλλακτικού ματίσματος. ΕΝΑ, Απεικονίζονται οι διαφορετικοί τύποι ματίσματος. Η διαδικασία της αποκοπής ιντρονίων και της ένωσης των εξονίων μεταξύ τους είναι συστατικό μάτισμα. Η παράκαμψη εξονίου είναι η συμπερίληψη ή η εξαίρεση ενός ή περισσότερων εξονίων (γνωστά ως εξόνια κασέτας). Τα εξόνια κασέτας μπορεί να είναι αμοιβαία αποκλειόμενα. Η εναλλακτική επιλογή θέσης ματίσματος 5' ή 3' (SS) έχει ως αποτέλεσμα μικρότερα ή μακρύτερα εξόνια. Η κατακράτηση ιντρονίου είναι η συμπερίληψη (μέρους) ενός ιντρονίου στο ώριμο mRNA. σιΆλλοι τρόποι δημιουργίας πολλαπλών διαφορετικών μεταγραφών mRNA από ένα μόνο γονίδιο είναι η εναλλακτική χρήση πρώτου εξονίου και η εναλλακτική πολυαδενυλίωση.

Αυτά τα διαφορετικά συμβάντα ματίσματος μπορεί να έχουν πολλαπλές λειτουργικές συνέπειες. Όταν το συμβάν ματίσματος συμβαίνει στην περιοχή κωδικοποίησης του mRNA, το πιο προφανές αποτέλεσμα είναι ένας διακόπτης ισομορφής, που οδηγεί σε αλλοιωμένες ή ακόμη και αντίθετες λειτουργίες της πρωτεΐνης. Δεύτερον, το εναλλακτικό μάτισμα μπορεί να οδηγήσει σε ισομορφές mRNA με πρόωρα κωδικόνια τερματισμού που αποικοδομούνται μέσω της οδού NMD. Αν και η οδός NMD αναγνωρίστηκε αρχικά ως μονοπάτι επιτήρησης σφαλμάτων, έχει καταστεί σαφές ότι το NMD χρησιμεύει επίσης για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Ως εκ τούτου, το εναλλακτικό NMD που προκαλείται από το μάτισμα παρέχει ένα μέσο για τον έλεγχο της πρωτεϊνικής έκφρασης. 21 Τέλος, εναλλακτικά συμβάντα ματίσματος που συμβαίνουν στις 5' ή 3' αμετάφραστες περιοχές (UTRs) μπορεί να οδηγήσουν σε αλλοιωμένα UTRs, τα οποία με τη σειρά τους μπορεί να επηρεάσουν τη σταθερότητα του mRNA, την προσβασιμότητα του microRNA και τον εντοπισμό του mRNA.

Εκτός από το εναλλακτικό μάτισμα, υπάρχουν 2 άλλες διαδικασίες που μπορούν να δημιουργήσουν πολλαπλά μεταγραφήματα mRNA από ένα μόνο προ-mRNA ή γονίδιο: εναλλακτική πολυαδενυλίωση (APA) και εναλλακτική χρήση πρώτου εξονίου (ή χρήση εναλλακτικού προαγωγέα Εικόνα 3Β). Τα ευκαρυωτικά προ-mRNA υφίστανται επεξεργασία στο 3' άκρο τους με διάσπαση και προσθήκη πολυ(Α) ουράς. Είναι ενδιαφέρον ότι τα περισσότερα ευκαρυωτικά mRNA έχουν πολλαπλές θέσεις πολυαδενυλίωσης και οι γονιδιωματικές μελέτες τα τελευταία χρόνια έχουν δείξει ότι ≈70% των ανθρώπινων γονιδίων παράγουν εναλλακτικές ισομορφές mRNA που διαφέρουν σε μήκος στο άκρο 3' με μια διαδικασία που ονομάζεται εναλλακτική διάσπαση και πολυαδενυλίωση. 22 Οι ισομορφές APA γενικά διαφέρουν ως προς το 3'UTR τους, αλλά στο ένα τρίτο περίπου των περιπτώσεων διαφέρουν επίσης ως προς τις κωδικοποιητικές αλληλουχίες. 23 Επειδή το 3'UTR γενικά φιλοξενεί λειτουργικούς τομείς όπως θέσεις δέσμευσης microRNA ή RBP, το τροποποιημένο μήκος 3'UTR από το APA μπορεί να έχει βαθιές επιπτώσεις στη γονιδιακή έκφραση. 24 Η εναλλακτική χρήση πρώτου εξονίου συμβαίνει όταν ο μεταγραφικός μηχανισμός ξεκινά από διαφορετικό προαγωγέα και οδηγεί σε διαφορετικές ισόμορφες mRNA ή πρωτεΐνης στο Ν άκρο. Και οι 3 διαδικασίες, το εναλλακτικό μάτισμα, το APA και η εναλλακτική χρήση πρώτου εξονίου, φαίνεται να είναι συνεξαρτώμενες, αλλά ο τρόπος με τον οποίο αυτές οι διαδικασίες συνδέονται λειτουργικά μένει να διευκρινιστεί. 4,25,26 Ωστόσο, η χρήση του APA και του εναλλακτικού πρώτου εξονίου είναι, αν και παρόμοια ως προς το αποτέλεσμα με το εναλλακτικό μάτισμα, τεχνικά δεν είναι εναλλακτικό μάτισμα καθώς δεν μεσολαβείται από το μάτισμα.

Συναρμολόγηση και μη κωδικοποιώντας RNA

Εκτός από το μάτισμα των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες, επίσης μακροχρόνια μη κωδικοποιητικά RNA (lncRNAs) υπόκεινται σε εναλλακτικό μάτισμα αν και σε μικρότερο βαθμό. 27 Αυτό θα μπορούσε να οφείλεται στον μικρότερο μέσο αριθμό εξονίων στα lncRNA. Είναι ενδιαφέρον ότι η παραγωγή πολλών μη κωδικοποιημένων RNA, όπως τα microRNA και τα μικρά πυρηνικά RNA (snoRNAs) βασίζεται στο μάτισμα.Αυτά τα μη κωδικοποιητικά RNA βρίσκονται σε εσώνια και ματίζονται από το μεταγράφημα του ξενιστή τους, μετά το οποίο υποβάλλονται σε επεξεργασία. 28 Η έκφραση αυτών των μη κωδικοποιητικών RNA συνδέεται στενά με την έκφραση των mRNA ξενιστών τους και για τα snoRNA, έχει προταθεί ότι τα mRNA ξενιστές τους είναι απλώς ένα παραπροϊόν της διαδικασίας παραγωγής snoRNA. 29 Επίσης, πολλά διαφορετικά μη κωδικοποιητικά RNA (συμπεριλαμβανομένων των snoRNA, lncRNA και sno-lncRNAs) αναγνωρίζονται ως ρυθμιστές εναλλακτικού ματίσματος. Το lncRNA MALAT1, για παράδειγμα, έχει αποδειχθεί ότι ρυθμίζει το επίπεδο έκφρασης, τον εντοπισμό και τη δραστηριότητα των πρωτεϊνών SR (πρωτεΐνες πλούσιες σε σερίνη/αργινίνη). 30 Έχει προταθεί ότι το MALAT1, τουλάχιστον εν μέρει, λειτουργεί ως μοριακός σπόγγος για τις πρωτεΐνες SR. Η ρύθμιση του MALAT1 ρυθμίζει έτσι έμμεσα το μάτισμα των στόχων πρωτεΐνης SR.

Ένα άλλο παράδειγμα είναι ο σχηματισμός κυκλικών RNA. Τα κυκλικά RNA θεωρούνταν από καιρό ότι είναι ένα τυχαίο παραπροϊόν του ματίσματος, αλλά αποδεικνύεται ότι ρυθμίζονται σε μεγάλο βαθμό, υποδηλώνοντας συγκεκριμένους λειτουργικούς ρόλους για αυτή τη νέα κατηγορία RNA. 31 Τα κυκλικά RNA συντίθενται με αντίστροφο μάτισμα, μια μορφή ματίσματος όπου μια θέση ματίσματος 5' ενός εξονίου συνδέεται με τη θέση ματίσματος 3' ενός ανάντη εξονίου, δημιουργώντας έτσι ένα κυκλικό RNA. Προφανώς, σχετικά άγνωστες μορφές ματίσματος, όπως το back-splicing, θα μπορούσαν να εμφανιστούν ως νέοι ρυθμιστές βιολογικών διεργασιών.

Κανονισμός Συναρμογής

Το εναλλακτικό μάτισμα είναι μια δυναμική και ρυθμιζόμενη διαδικασία και μπορεί να επηρεαστεί από μια σειρά μεταβλητών όπως π. cis-ρυθμιστικές ακολουθίες και μεταφρ-ενεργοί παράγοντες, η μεταγραφική διαδικασία και η μεθυλίωση DNA/RNA. Μαζί, αυτά τα ρυθμιστικά χαρακτηριστικά RNA συνθέτουν τον κώδικα ματίσματος, έναν κώδικα που καθορίζει εναλλακτικά συμβάντα ή μοτίβα ματίσματος. 32

Επί του παρόντος, ≈1500 RBPs έχουν εντοπιστεί σε ανθρώπους. 33 Τα RBP δρουν ως ρυθμιστές διαφορετικών μετα-μεταγραφικών διεργασιών, συμπεριλαμβανομένου του συστατικού και εναλλακτικού ματίσματος, της μεταφοράς και εντοπισμού του mRNA, της σταθερότητας του mRNA, της αναστολής του microRNA και της μετάφρασης του mRNA. Πιθανώς οι πιο καλά περιγραφόμενες οικογένειες RBP είναι η οικογένεια πρωτεϊνών SR και η οικογένεια πρωτεϊνών της ετερογενούς πυρηνικής ριβονουκλεοπρωτεΐνης (hnRNP). Οι περισσότερες πρωτεΐνες από αυτές τις οικογένειες εκφράζονται πανταχού παρόντα και διαδραματίζουν κρίσιμους ρόλους στη συναρμολόγηση του ματοσωμικού. Οι πρωτεΐνες SR χαρακτηρίζονται από την παρουσία τουλάχιστον 1 μοτίβου αναγνώρισης RNA και μιας περιοχής RS. Η περιοχή μοτίβου αναγνώρισης RNA απαιτείται για τη δέσμευση RNA, ενώ η περιοχή RS λειτουργεί ως τομέας αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης. Δίπλα στις ≈20 περιγραφόμενες πρωτεΐνες SR, υπάρχουν πολλές πρόσθετες πρωτεΐνες που περιέχουν τον τομέα RS που αναφέρονται ως πρωτεΐνες που σχετίζονται με το SR. 34 Η οικογένεια πρωτεϊνών hnRNP πήρε το όνομά της από τη συσχέτισή της με τα hnRNA, έναν ιστορικό όρο που είναι συνώνυμος του pre-mRNA. Οι πρωτεΐνες hnRNP έχουν τουλάχιστον 1 μοτίβο δέσμευσης RNA και τουλάχιστον 1 επιπλέον λειτουργικό τομέα υπεύθυνο για τη ρύθμιση, για παράδειγμα, αλληλεπιδράσεων πρωτεΐνης-πρωτεΐνης ή κυτταρικό εντοπισμό. 35 Ωστόσο, λόγω των παρόμοιων ιδιοτήτων και της λειτουργίας των πρωτεϊνών SR και hnRNP, η διάκριση μεταξύ των 2 οικογενειών έχει γίνει θολή με τα χρόνια. Εκτός από τις πανταχού εκφραζόμενες RBPs από τις οικογένειες πρωτεϊνών SR- και hnRNP, υπάρχουν πολυάριθμα RBP ειδικά για ιστούς ή εμπλουτισμένα σε ιστούς. Αν και τα περισσότερα RBP από τις οικογένειες πρωτεϊνών SR- και hnRNP πιστεύεται ότι είναι περιττά, ο συνδυασμός διαφορετικών RBPs (συμπεριλαμβανομένων των ειδικών για ιστούς RBPs) στο μάτισμα καθορίζει την ειδικότητά του στην αναγνώριση εναλλακτικών εξονίων. Η έκφραση διαφορετικών παραγόντων ματίσματος έχει βαθιές επιπτώσεις στην έκβαση του εναλλακτικού ματίσματος. Υπάρχουν πολυάριθμα παραδείγματα όπου η ισορροπία διαφορετικών παραγόντων ματίσματος ρυθμίζεται με έναν ειδικό για κύτταρο/ιστό, 36 ειδικό για την ανάπτυξη, 37 ή για νόσο τρόπο. 38 Η ισορροπία μεταξύ αυτών των παραγόντων ματίσματος καθορίζει στη συνέχεια τη συμπερίληψη ή την εξαίρεση συγκεκριμένων εξονίων. Ίσως το καλύτερο παράδειγμα είναι η ανταγωνιστική λειτουργία των μυοτυφλών και πρωτεϊνικών οικογενειών CUG-BP και παρόμοιου με το ETR-3 (CELF). Κατά την ανάπτυξη, τα επίπεδα μυϊκής τυφλής και πρωτεΐνης CELF καθορίζουν τη συμπερίληψη των εμβρυϊκών εξονίων και τον αποκλεισμό των εξονίων ενηλίκων σε ένα σύνολο γονιδίων. 37 Εκτός από τη ρύθμιση του επιπέδου έκφρασης των RBP, η δραστηριότητά τους μπορεί επίσης να ελεγχθεί (π.χ. μέσω φωσφορυλίωσης) και αυτό επηρεάζει επίσης το pre-mRNA ή το εναλλακτικό μάτισμα. 39

Ο βαθμός στον οποίο ένα mRNA ματίζεται εναλλακτικά εξαρτάται επίσης από τη χρήση ισχυρών και αδύναμων θέσεων ματίσματος. Οι ισχυρές θέσεις ματίσματος γενικά οδηγούν σε συστατικό μάτισμα, καθώς χρησιμοποιούνται πάντα από το μάτισμα. Η χρήση αδύναμων θέσεων ματίσματος εξαρτάται από παράγοντες όπως η αλληλουχία θέσεων ματίσματος, η θέση της θέσης ματίσματος και οι παράγοντες δεσμευμένου ματίσματος. Για παράδειγμα, ciΟι ρυθμιστικές ακολουθίες s που είναι γνωστές ως ενισχυτές ιντρονικής συναρμογής, σιγαστήρες ιντρονικής μάτισης, ενισχυτές εξωνικού ματίσματος και εξωνικοί σιγαστήρες ματίσματος μπορούν να δεσμευτούν από μεταφρ-δρώντα RBP, τα οποία με τη σειρά τους προσλαμβάνουν ματοσωμικά συστατικά. Με βάση την αλληλουχία και τη θέση της θέσης στο pre-mRNA, μεταφρ-Τα δρώντα RBP μπορούν να ενισχύσουν ή να μειώσουν τη συμπερίληψη των εξονίων. 40 Είναι ενδιαφέρον ότι οι θέσεις ματίσματος μπορούν να αλλοιωθούν με επεξεργασία RNA, μια μετα-μεταγραφική διαδικασία με την οποία τα κύτταρα μπορούν να κάνουν διακριτές αλλαγές σε συγκεκριμένα νουκλεοτίδια μέσα σε ένα μόριο RNA. Οι πρωτεΐνες που είναι υπεύθυνες για αυτή τη διαδικασία είναι απαμινάσες αδενοσίνης που δρουν στο RNA (ADAR) και ελέγχοντας την επεξεργασία του RNA, αυτές οι πρωτεΐνες είναι σε θέση να ρυθμίζουν έμμεσα το μάτισμα, επηρεάζοντας τις αλληλουχίες θέσεων ματίσματος. 41

Επιπλέον, η ίδια η διαδικασία μεταγραφής μπορεί να έχει θεμελιώδη επίδραση στο εναλλακτικό μάτισμα. Σε αντίθεση με ό,τι πιστεύεται εδώ και πολλά χρόνια, το μάτισμα δεν συμβαίνει μετά τη μεταγραφή, αλλά συμβαίνει κατά τη διάρκεια της μεταγραφής. Ως εκ τούτου, η συντριπτική πλειονότητα των ανθρώπινων ιντρονίων ματίζονται όταν η μεταγραφή εξακολουθεί να πραγματοποιείται. 42 Επομένως, το pre-mRNA αντιπροσωπεύει μια εικονική οντότητα. Εκτός από το ότι συμβαίνει ταυτόχρονα, γίνεται όλο και πιο σαφές ότι και μηχανιστικά, η μεταγραφή και το μάτισμα είναι συνδεδεμένες διαδικασίες. Οι 2 μηχανισμοί που αποτελούν τη βάση της συνεξάρτησης των διαδικασιών είναι η σύζευξη πρόσληψης και η κινητική σύζευξη. Η σύζευξη στρατολόγησης βασίζεται στην ικανότητα του μεταγραφικού μηχανήματος να προσλαμβάνει RBP που μοιράζονται επίσης τα μηχανήματα ματίσματος. Για παράδειγμα, είναι γνωστό ότι η καρβοξυτελική περιοχή της RNA πολυμεράσης II (Pol II) στρατολογεί παράγοντα ματίσματος πλούσιου σε σερίνη/αργινίνη (SRSF)-3, μια πρωτεΐνη SR που εμπλέκεται στη ρύθμιση εναλλακτικού ματίσματος της φιμπρονεκτίνης. 43 Η κινητική σύζευξη βασίζεται στην ταχύτητα με την οποία το Pol II μεταγράφει το DNA (ρυθμός επιμήκυνσης), επηρεάζοντας έτσι τη διαθεσιμότητα αδύναμων και ισχυρών θέσεων ματίσματος. Αν και το Pol II μεταγράφει το DNA, το pre-mRNA γίνεται διαθέσιμο στο μάτισμα, ακόμη και όταν η μεταγραφή δεν έχει ολοκληρωθεί. Εάν η επιμήκυνση με τη μεσολάβηση Pol II είναι αργή και διατίθεται μια ασθενής θέση ματίσματος, το μηχάνημα ματίσματος θα κάνει χρήση της ασθενούς θέσης ματίσματος. Εάν, ωστόσο, η επιμήκυνση είναι γρήγορη και οι αδύναμες και ισχυρές θέσεις ματίσματος είναι διαθέσιμες περισσότερο ή λιγότερο ταυτόχρονα, ο μηχανισμός ματίσματος θα ευνοήσει την ισχυρή θέση ματίσματος έναντι της ασθενούς θέσης ματίσματος. Υπάρχουν αρκετά παραδείγματα αυτού του φαινομένου, 44,45, αλλά τα πιο επιτακτικά στοιχεία παρέχονται από τη χρήση μεταλλαγμένου αργού Pol II, με αποτέλεσμα βραδύτερο ρυθμό επιμήκυνσης και αλλοιωμένη χρήση εξονίων της φιμπρονεκτίνης. 46

Το γεγονός ότι οι ρυθμοί επιμήκυνσης Pol II επηρεάζουν το εναλλακτικό μάτισμα οδήγησε στην υπόθεση ότι οι επιγενετικές τροποποιήσεις θα μπορούσαν επίσης να επηρεάσουν το εναλλακτικό μάτισμα επειδή αυτές οι τροποποιήσεις μπορούν να επηρεάσουν τη δομή της χρωματίνης και επομένως τον ρυθμό επιμήκυνσης του Pol II. Πρόσφατα, έχει επίσης αποδειχθεί ότι η μεθυλίωση του DNA εμπλουτίζεται σε εξόνια σε σύγκριση με τα πλευρικά εσώνια τους, 47 υποδηλώνοντας έτσι ότι οι επιγενετικές τροποποιήσεις παίζουν ρόλο στο μάτισμα. Όπως αποδεικνύεται, η μεθυλίωση του DNA μπορεί να συνδεθεί με εναλλακτικό μάτισμα ≈20% εναλλακτικά ματισμένων εξονίων 48, τόσο μέσω της σύζευξης στρατολόγησης 48 όσο και της κινητικής σύζευξης. 49 Όσον αφορά την κινητική σύζευξη, οι Shukla et al 49 απέδειξαν ότι η μεθυλίωση μιας θέσης CCCTC-binding factor (CTCF) στο ανθρώπινο γονίδιο CD45 καθόρισε τον ρυθμό εγκλεισμού του εξονίου 5. Όταν η θέση CTCF δεν είναι μεθυλιωμένη, η CTCF μπορεί να συνδεθεί και να εξυπηρετήσει ως εμπόδιο για το Pol II, επιβραδύνοντας αποτελεσματικά τον ρυθμό επιμήκυνσης. Αυτό, με τη σειρά του, οδηγεί σε συμπερίληψη εξονίων. Αντίθετα, όταν η θέση CTCF στο εξόνιο 5 είναι μεθυλιωμένη, η δέσμευση CTCF αναστέλλεται και το εξόνιο αποκλείεται, αποδεικνύοντας ότι οι ρυθμοί επιμήκυνσης Pol II επηρεάζονται από την κατάσταση μεθυλίωσης του DNA. Η τοποθέτηση νουκλεοσωμάτων και οι τροποποιήσεις ιστόνης επηρεάζουν επίσης την (εναλλακτική) μάτιση. Τα νουκλεοσώματα είναι μονάδες συσκευασίας DNA που αποτελούνται από πρωτεΐνες ιστόνης και ένα τμήμα DNA. Είναι ενδιαφέρον ότι τα νουκλεοσώματα κατά προτίμηση τοποθετούνται στα εξόνια, με κατά μέσο όρο 1 νουκλεόσωμα ανά εξόνιο. 6 Τα εσώνια δεν στερούνται νουκλεοσωμάτων, αλλά η κατανομή των νουκλεοσωμάτων στα εσώνια είναι πολύ πιο τυχαία. 50 Αυτό οδήγησε στην ιδέα ότι τα νουκλεοσώματα βοηθούν τον μηχανισμό ματίσματος για τον εντοπισμό των εξονίων. Τα νουκλεοσώματα λειτουργούν ως ανύψωση ταχύτητας για να επιβραδύνουν την επιμήκυνση, η οποία παρέχει περισσότερο χρόνο στον μηχανισμό ματίσματος για να αναγνωρίσει τη θέση ματίσματος 3. 51 Το γεγονός ότι τα εναλλακτικά εξόνια είναι περισσότερο εμπλουτισμένα σε νουκλεοσώματα από ό,τι τα συστατικά εξόνια υποδηλώνει έναν ρυθμιστικό ρόλο για τα νουκλεοσώματα και στην εναλλακτική συναρμογή. 50 Όπως τα νουκλεοσώματα, οι τροποποιήσεις ιστόνης εμπλουτίζονται επίσης στα εξόνια. Για ορισμένες τροποποιήσεις ιστόνης, αυτό είναι αποτέλεσμα αυξημένης πυκνότητας νουκλεοσώματος στα εξόνια, αλλά ακόμη και όταν διορθώνεται για εμπλουτισμό νουκλεοσώματος, ορισμένες τροποποιήσεις ιστόνης (όπως H3K36me3, H3K4me3 και H3K27me2) εξακολουθούν να είναι αυξημένες, ενώ άλλες μειώνονται (όπως H3K9me3) . 52 Τα σημάδια ιστόνης μπορούν να επηρεάσουν το εναλλακτικό μάτισμα τόσο μέσω της κινητικής όσο και της σύζευξης πρόσληψης. 6,52,53 Η σχέση μεταξύ μεθυλίωσης DNA και τροποποιήσεων ιστόνης έχει διερευνηθεί καλά και πρόσφατα οι Yearim et al 48 αποκάλυψαν ότι η κατάσταση μεθυλίωσης του DNA ρυθμίζει τη στρατολόγηση συστατικών ματίσματος μέσω της πρωτεΐνης HP1 που περιέχει χρωμοτομέα, η οποία αποδείχθηκε ότι συνδέεται άμεσα στο H3K9me3, μια τροποποίηση ιστόνης που προκαλείται από τη μεθυλίωση του DNA. Εκτός από τη μεθυλίωση του DNA, η μεθυλίωση του RNA (N 6-methyladenosine [m 6 A]) έχει αναδειχθεί τα τελευταία χρόνια ως σημαντικός παράγοντας εναλλακτικής ματίσματος. 54 Το 2015, οι Liu et al 55 έδειξαν ότι η μεθυλίωση του RNA επηρεάζει τη δευτερογενή δομή του RNA με τέτοιο τρόπο που το m 6 A ανοίγει το mRNA για αλληλεπιδράσεις με τα RBP.

Συνδυαστικοί Παράγοντες στην Αναπτυσσόμενη Καρδιά

Αν και οι περισσότεροι από τους γενικούς μηχανισμούς που ελέγχουν το εναλλακτικό μάτισμα δεν έχουν διερευνηθεί σε ένα καρδιακό πλαίσιο (δηλαδή, μικρό μάτισμα, σύζευξη μεταγραφής και μάτισης και μεθυλίωση DNA), γίνεται φανερό ότι το εναλλακτικό μάτισμα παίζει καθοριστικό ρόλο στην ανάπτυξη, την ομοιόσταση και καρδιακή νόσο.

Χρησιμοποιώντας μια οθόνη μεγάλης κλίμακας με μικροσυστοιχίες ματίσματος, οι Kalsotra et al 37 αποκάλυψαν 63 εναλλακτικά συμβάντα ματίσματος στην αναπτυσσόμενη καρδιά του ποντικιού. Η βιοπληροφορική ανάλυση των ιντρονίων που πλευρίζουν αυτά τα συμβάντα ματίσματος εντόπισε εμπλουτισμένα μοτίβα για CELF και μυοτυφλές πρωτεΐνες. Χρησιμοποιώντας διαγονιδιακά και νοκ-άουτ μοντέλα ποντικιών, οι Kalsotra et al 37 έδειξαν στη συνέχεια ότι οι πρωτεΐνες CELF και μυοτυφλές προσδιορίζουν περισσότερα από τα μισά από τα 63 παρατηρούμενα αναπτυξιακά ρυθμιζόμενα συμβάντα ματίσματος. Κατά την ανάπτυξη της καρδιάς, οι πρωτεΐνες CELF ρυθμίζονται προς τα κάτω >10 φορές, ενώ οι μυοτυφλές πρωτεΐνες ρυθμίζονται προς τα πάνω ≈4 φορές και φαίνεται ότι η στοιχαστική έκφραση αυτών των 2 πρωτεϊνών καθορίζει σε μεγάλο βαθμό τη χρονική έκφραση πολυάριθμων ισομορφών ματίσματος.

Η πρωτεΐνη 24 του μοτίβου δέσμευσης RNA (Rbm24) έχει πρόσφατα αποδειχθεί ότι είναι ένας κύριος ρυθμιστής των συμβάντων ματίσματος της καρδιάς και των σκελετικών μυών. 56 Ποντίκια που δεν έχουν Rbm24 πεθαίνουν μεταξύ E12.5 και E14.5 λόγω πολλαπλών καρδιακών δυσπλασιών, συμπεριλαμβανομένων των ελαττωμάτων του κοιλιακού διαφράγματος, της μειωμένης σωληνώσεων και της συμπίεσης και των διεσταλμένων κόλπων. Εντυπωσιακά, η σαρκομερογένεση καταργήθηκε σχεδόν πλήρως στα έμβρυα νοκ-άουτ. Η μεταγραφική ανάλυση των καρδιών των μεταλλαγμένων εμβρύων αποκάλυψε ανώμαλο μάτισμα 68 εξαρτώμενων από Rbm24 γονιδίων, αρκετά από τα οποία είναι σημαντικά για την καρδιο- και σαρκομερογένεση. Παρόλο που και οι δύο μυοτυφλοί/CELF και Rbm24 ρυθμίζουν συμβάντα ματίσματος ειδικά για τους μύες, υπάρχει μόνο ≈10% επικάλυψη στους στόχους τους, υποδηλώνοντας ότι αυτές οι πρωτεΐνες ρυθμίζουν διαφορετικές διαδικασίες.

Επίσης, μέλη της οικογένειας πρωτεϊνών SR έχουν εμπλακεί στη ρύθμιση του εναλλακτικού ματίσματος στην αναπτυσσόμενη καρδιά. Ένα παράδειγμα είναι το SRp38 −/− ποντίκι, που περιγράφεται από τους Feng et al. Η 57 SRp38 (ή SRSF10) είναι μια πανταχού εκφρασμένη πρωτεΐνη SR, αν και ασυνήθιστη. Οι περισσότερες πρωτεΐνες SR δρουν ως ενεργοποιητές ματίσματος, αλλά η SRp38 δρα ως επί το πλείστον ως καταστολέας ματίσματος. Η απώλεια του SRp38 είναι εμβρυονικά θανατηφόρα, αλλά η πλειονότητα των μεταλλαγμένων εμβρύων επιβιώνει μέχρι την E15.5. Λίγο αργότερα, τα μεταλλαγμένα έμβρυα πεθαίνουν λόγω πολλαπλών καρδιακών ελαττωμάτων. Αυτό αποδίδεται σε μια απορρύθμιση της τριαδίνης και της καλσεκεστρίνης2 και σε μια διαταραγμένη αναλογία ισομορφών τριαδίνης 1 και 2. Η τριαδίνη και η καλσεκεστρίνη2 εμπλέκονται στη ρύθμιση της απελευθέρωσης Ca 2+ από το σαρκοπλασματικό δίκτυο και η απώλεια της SRp38 οδηγεί σε αύξηση των σπινθήρων Ca 2+ από το σαρκοπλασμικό δίκτυο, το οποίο υποδεικνύει έναν ρόλο για το SRp38 στη ρύθμιση της απελευθέρωσης Ca 2+.

Η μεταγεννητική ανάπτυξη της καρδιάς συνοδεύεται επίσης από σημαντικές εναλλακτικές αλλαγές στο μάτισμα, 58 και πολλά μοντέλα ποντικών έχουν αποκαλύψει έναν ρόλο για τους παράγοντες μάτισης στη μεταγεννητική ανάπτυξη της καρδιάς. Ένα από τα πρώτα παραδείγματα είναι ο εναλλακτικός παράγοντας ματίσματος ASF/SF2 (ή SFRS1), ο οποίος είναι μια πρωτεΐνη SR που εκφράζεται παντού και δρα ως συστατικός και εναλλακτικός ρυθμιστής ματίσματος. 59 Τα ποντίκια νοκ-άουτ ASF/SF2 είναι εμβρυονικά θανατηφόρα και η υπό όρους ειδική για την καρδιά αφαίρεση προκαλεί έναν υπερσυσταλτικό καρδιακό φαινότυπο που προκαλείται από ένα ελάττωμα στον χειρισμό του Ca 2+. Τα ποντίκια με νοκ-άουτ υπό όρους ASF/SF2 πεθαίνουν 6 έως 8 εβδομάδες μετά τη γέννηση. Η διαγραφή του ASF/SF2 οδηγεί σε εσφαλμένη συναρμογή πολλών γονιδίων, συμπεριλαμβανομένης της πρωτεϊνικής κινάσης που εξαρτάται από Ca2+/καλμοδουλίνη (CamkIIδ), της καρδιακής τροπονίνης Τ (cTnT) και της δέσμευσης 3 στον τομέα LIM (LDB3). Είναι ενδιαφέρον ότι η παρεκκλίνουσα εναλλακτική συναρμογή των CamkIIδ, cTnT και LDB3 παρουσιάστηκε 20 ημέρες μετά τη γέννηση, παρόλο που η ASF/SF2 διαγράφηκε στα πρώιμα στάδια της καρδιογένεσης. Αυτό θα μπορούσε να σημαίνει ότι το ASF/SF2 διαδραματίζει κρίσιμο ρόλο κατά τη μεταβατική περίοδο από ανήλικους σε ενήλικες, αλλά είναι απαραίτητο σε προηγούμενα στάδια. Η εσφαλμένη συναρμογή του CamkIIδ σε καρδιές νοκ-άουτ ASF/SF2 έχει ως αποτέλεσμα διαταραγμένο χειρισμό Ca 2+ και σοβαρά ελαττώματα σύζευξης διέγερσης-σύσπασης, τα οποία με τη σειρά τους οδηγούν σε διατατική μυοκαρδιοπάθεια (DCM).

Ο πλούσιος σε SR παράγοντας ματίσματος 2 (SRSF2 ή SC35) είναι μια ακόμη πρωτεΐνη SR που εκφράζεται παντού. Η συστηματική διαγραφή του SC35 σε ποντίκια οδηγεί σε εμβρυϊκή θνησιμότητα, ακόμη και πριν από την έναρξη της καρδιογένεσης. 60 Η παράκαμψη αυτού του προβλήματος με τη δημιουργία ενός ειδικού για την καρδιά νοκ-άουτ του SC35 αποκάλυψε τον ρόλο του SC35 στην καρδιά, καθώς αυτά τα ποντίκια ανέπτυξαν καρδιακή υπερτροφία και DCM σε ηλικία 5 έως 6 εβδομάδων. 60 Είναι εντυπωσιακό ότι η διάρκεια ζωής αυτών των μεταλλαγμένων ποντικών δεν επηρεάστηκε. Ο φαινότυπος της νόσου σχετίζεται με μια προς τα κάτω ρύθμιση του υποδοχέα ρυανοδίνης 2 (Ryr2) στις καρδιές SC35 knockout. Αν και δεν παρασχέθηκε ακριβής μηχανισμός, οι συγγραφείς εικάζουν ότι το RyR2 είναι εσφαλμένο συναρμολογημένο και επομένως θα διασπαστεί μέσω της οδού NMD. Συμπερασματικά, η αφαίρεση του SC35 στην καρδιά δείχνει ότι η σωστή έκφραση αυτού του παράγοντα ματίσματος κατά τη μεταγεννητική ανάπτυξη της καρδιάς είναι απαραίτητη για τη διατήρηση της καρδιακής μορφής και λειτουργίας.

Λίγα είναι γνωστά για τις ειδικές λειτουργίες των πρωτεϊνών hnRNP στην καρδιά, αλλά η υπό όρους διαγραφή του hnRNP U στην καρδιά του ποντικού οδηγεί σε σοβαρό DCM και είναι θανατηφόρο 2 εβδομάδες μετά τη γέννηση. 61 Είναι ενδιαφέρον ότι, όπως τα SRSF1, SRSF2 και SRFS10, το hnRNP U είναι σημαντικό για τη σωστή συναρμογή γονιδίων χειρισμού Ca 2+ όπως το CamkIIδ, υποδηλώνοντας ότι η εναλλακτική συναρμολόγηση των γονιδίων που χειρίζονται Ca 2+ είναι κρίσιμη στην πρώιμη μεταγεννητική ανάπτυξη της καρδιάς.

Εναλλακτικό μάτισμα σε ασθένειες

Το ανώμαλο εναλλακτικό μάτισμα μπορεί να είναι τόσο η αιτία όσο και η συνέπεια της νόσου και έχει αποδειχθεί ότι μπορεί να επηρεάσει τη σοβαρότητα και την ευαισθησία της νόσου. 62 Μεταλλάξεις σε γονίδια που απαιτούνται για τη σωστή λειτουργία του ματίσματος έχουν περιγραφεί ως αιτία για νωτιαία μυϊκή ατροφία, μελαγχρωστική αμφιβληστροειδίτιδα και σύνδρομο Prader-Willi. 63–65 Η μυϊκή ατροφία της σπονδυλικής στήλης, για παράδειγμα, προκαλείται από την απώλεια του επιζώντος του γονιδίου του κινητικού νευρώνα-1 (SMN1), το οποίο είναι απαραίτητο για τη σωστή συναρμολόγηση και μεταφορά του snRNP. 63 Είναι ενδιαφέρον ότι, παρόλο που το SMN1 εκφράζεται παντού, ο φαινότυπος περιορίζεται στους κινητικούς νευρώνες. Δεν είναι απολύτως σαφές γιατί οι κινητικοί νευρώνες είναι πιο ευαίσθητοι στην απώλεια της συγκρότησης και της λειτουργίας snRNP που κατευθύνεται από το SMN1, αλλά είναι πιθανό ότι ορισμένα συμβάντα ματίσματος είναι πιο κρίσιμα για αυτά τα κύτταρα. Στην περίπτωση του συνδρόμου Prader-Willi, η απώλεια snoRNAs και sno-lncRNAs που κωδικοποιούνται στον τόπο SNURF/SNRNP, προκαλεί εσφαλμένη συναρμογή του υποδοχέα σεροτονίνης 2C και άλλων στόχων, αλλά νεότερες γραμμές αποδεικτικών στοιχείων υποδηλώνουν ένα ρόλο για αυτά τα snoRNAs στην επεξεργασία του RNA το αντίγραφο του υποδοχέα σεροτονίνης 2C επίσης. 28,66

Δίπλα σε μεταλλάξεις σε συνιστώσες ματίσματος, οι μεταλλάξεις στις θέσεις ματίσματος μπορεί να έχουν ενοχλητική επίδραση στο μάτισμα. Είναι ενδιαφέρον ότι μια μελέτη αποκάλυψε ότι μια αξιοσημείωτη ποσότητα ≤15% των γνωστών μεταλλάξεων που προκαλούν νόσο φαίνεται να επηρεάζει τις θέσεις ματίσματος στα προ-mRNA, αντί να διαταράσσει την κωδικοποιητική περιοχή πρωτεΐνης ενός mRNA. 67 Ωστόσο, αυτή η μελέτη διεξήχθη σε μια εποχή που η γνώση του κώδικα ματίσματος ήταν ελλιπής και ως εκ τούτου αγνόησε έναν τεράστιο αριθμό μεταλλάξεων που δυνητικά προκαλούν ανωμαλίες ματίσματος. Ως εκ τούτου, έχει προταθεί ότι το 15% μπορεί να είναι μια κατάφωρη υποεκτίμηση του πραγματικού αριθμού και ότι το ποσοστό των μεταλλάξεων που προκαλούν ασθένειες που προκαλούν ανωμαλίες ματίσματος, τόσο στις θέσεις ματίσματος όσο και στα γονίδια που σχετίζονται με το μάτισμα, είναι πιο κοντά στο 60%. 68,69

Μελέτες σχετικά με τις εναλλακτικές αλλαγές ματίσματος στην καρδιά έχουν αποκαλύψει μεγάλες διαφορές μεταξύ των καταστάσεων ανάπτυξης ή ασθένειας. Περιέργως, όπως η επανενεργοποίηση επιλεγμένων εμβρυϊκών γονιδίων, ορισμένες ισομορφές ματίσματος του εμβρύου εκφράζονται επίσης ξανά στην καταπονημένη ή άρρωστη καρδιά. 70 Για παράδειγμα, το μάτισμα των σαρκομερικών πρωτεϊνών τιτίνης και μυομεσίνης ρυθμίζεται κατά την ανάπτυξη και οι εμβρυϊκές ισομορφές τους εκφράζονται εκ νέου στην καταπονημένη καρδιά. 71 Εκτός από την επανέκφραση των ισομορφών του εμβρύου, είναι γνωστό ότι το εναλλακτικό μάτισμα μεταβάλλεται ευρέως στην καρδιακή υπερτροφία και νόσο. Η καρδιακή υπερτροφία μπορεί να είναι φυσιολογική, αναστρέψιμη και προσαρμοστική ή να εξελιχθεί σε παθολογική υπερτροφία με μη αναστρέψιμες και δυσπροσαρμοστικές αλλαγές. Οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που διακρίνουν τις 2 μορφές δεν είναι ακόμη πλήρως κατανοητοί, αλλά έχει καταστεί σαφές ότι τα εναλλακτικά προφίλ ματίσματος των 2 μορφών είναι διαφορετικά. 72 Σε υπερτροφικές και ανεπαρκείς καρδιές ποντικιού, τα εναλλακτικά προφίλ ματίσματος τροποποιούνται επίσης, με τις μεγαλύτερες διαφορές στις καρδιές που αποτυγχάνουν. 73 Στους ανθρώπους, οι Kong et al 74 ήταν οι πρώτοι που χρησιμοποίησαν μια προσέγγιση σε όλο το γονιδίωμα για να μελετήσουν εναλλακτικές αλλαγές ματίσματος στην άρρωστη καρδιά.Το προφίλ ματίσματος των ασθενών καρδιών και των καρδιών ελέγχου διέφερε εκτενώς και, στη συνέχεια, οι συγγραφείς μπόρεσαν να αντιστοιχίσουν σωστά δείγματα σε μάρτυρες ή ασθένεια με βάση αποκλειστικά το προφίλ ματίσματος. Επιπλέον, το μάτισμα 4 βασικών σαρκομερικών γονιδίων, της τροπονίνης T (TNNT)-2, TNNI3, MYH7 και FLNC, άλλαξε σημαντικά στην ανθρώπινη ισχαιμική μυοκαρδιοπάθεια, το DCM και τη στένωση της αορτής. Στην υπερφορτωμένη με πίεση καρδιά, προηγήθηκε ακόμη και της εμφάνισης καρδιακής ανεπάρκειας (ΣΥ). Επιπλέον, η αναλογία μείζονος: δευτερεύουσας ισομορφής μόνο 3 από αυτά τα γονίδια, TNNT2, MYH7 και FLNC, ήταν επαρκής για την ορθή ανάθεση δειγμάτων σε έλεγχο ή ασθένεια με ακρίβεια >98%, η οποία θα μπορούσε να είναι χρήσιμη ως διαγνωστικό εργαλείο.

Αν και δεν μεσολαβείται από το μάτισμα, μια πρόσφατη μελέτη από την ομάδα μας αποκάλυψε ότι ο σχηματισμός άκρου 3' του mRNA μέσω του APA μεταβάλλεται επίσης στο HF. Με τη δημιουργία χαρτών πολυαδενυλίωσης σε όλο το γονιδίωμα στην ανθρώπινη καρδιά, αποδείχθηκε ότι υποσύνολα γονιδίων εμφάνιζαν επιμήκυνση 3'UTR, ενώ άλλα εμφάνιζαν βράχυνση 3'UTR. Είναι ενδιαφέρον ότι τα γονίδια με αλλοιωμένο μήκος 3'UTR ήταν συχνά απορρυθμισμένα σε καρδιές με ανεπάρκεια, με αντίστροφη συσχέτιση μεταξύ του μήκους 3'UTR και του επιπέδου γονιδιακής έκφρασης. Αυτό υποδηλώνει ότι, εκτός από το εναλλακτικό μάτισμα, οι διακόπτες ισομορφής με τη μεσολάβηση APA αντιπροσωπεύουν επίσης ένα σημαντικό στρώμα γονιδιακής ρύθμισης στο HF. 75

Συνδυαστικοί παράγοντες στην άρρωστη καρδιά

Μόλις αρχίζουμε να κατανοούμε τις λειτουργίες διαφορετικών παραγόντων ματίσματος και για πολλά RBP, ο ρόλος τους στην κανονική και άρρωστη καρδιά έχει πρόσφατα αποκαλυφθεί (Πίνακας 1). Είναι αξιοσημείωτο ότι δεν έχουν περιγραφεί πολλές μεταλλάξεις σε παράγοντες ματίσματος που οδηγούν σε καρδιακές παθολογίες στον άνθρωπο. Μέχρι σήμερα, μόνο οι μεταλλάξεις στην πρωτεΐνη μοτίβου 20 που δεσμεύει τον παράγοντα μάτισης RNA (RBM20) έχουν συνδεθεί αιτιολογικά με καρδιακές παθήσεις. 76–78 Η έλλειψη παραγόντων ματίσματος στον κατάλογο των γονιδίων που προκαλούν καρδιακές παθήσεις θα μπορούσε να έχει πολλαπλές εξηγήσεις. Μπορεί οι μεταλλάξεις στους παράγοντες μάτισης να είναι σοβαρές και εμβρυονικά θανατηφόρες. Αρκετά μοντέλα ποντικιών στα οποία έχει εξαλειφθεί ένας παράγοντας ματίσματος (π.χ. Rbm24, SC35, SRp20 και SRp38) υποστηρίζουν αυτήν την ιδέα. 56,57,60,79 Επίσης, πριν από την επικείμενη αλληλουχία επόμενης γενιάς, η αναζήτηση για υποψήφια γονίδια βασιζόταν σε υποθέσεις και συχνά δεν περιελάμβανε παράγοντες ματίσματος, και κατά συνέπεια, τα γονίδια που κωδικοποιούσαν τους παράγοντες ματίσματος απλά δεν αλληλουχήθηκαν σε προσβεβλημένους ασθενείς . Μόλις πρόσφατα κατέστη δυνατή η αναζήτηση υποψηφίων γονιδίων με ευρύτερο και συχνά αμερόληπτο τρόπο, και τα γονίδια που σχετίζονται με το μάτισμα μπορούν να αναλυθούν σε μεγαλύτερη κλίμακα.

Τραπέζι 1. Χαρακτηριστικά και γνωστή λειτουργία των παραγόντων ματίσματος στην καρδιά

Η ASF υποδεικνύει εναλλακτικό παράγοντα ματίσματος CELF, CUG-BP και παράγοντα DCM παρόμοιο με ETR-3, διατατική μυοκαρδιοπάθεια DM, μυοτονική δυστροφία HF, καρδιακή ανεπάρκεια hn-RNP, ετερογενή πυρηνική-ριβονουκλεοπρωτεΐνη MBNL, μυοτυφλή PKC, πρωτεϊνική κινάση πολυπυριμική C PTBB, RBM, πρωτεΐνη SF με μοτίβο δέσμευσης RNA, παράγοντας ματίσματος και SRSF, παράγοντας ματίσματος πλούσιος σε σερίνη/αργινίνη.

* Αυτά τα άρθρα περιγράφουν την ανοδική ρύθμιση 17 παραγόντων ματίσματος, μεταξύ των οποίων είναι οι Rbm25 και Luc7l3, στην ανθρώπινη καρδιακή ανεπάρκεια. Μόνο τα Rbm25 και Luc7l3 χαρακτηρίστηκαν μοριακά, αλλά οι άλλοι 15 παράγοντες ματίσματος πιθανότατα παίζουν ρόλο και στην καρδιά.

Ωστόσο, το 2009, οι Brauch et al 76 περιέγραψαν μεταλλάξεις σε RBM20 να είναι αιτιολογική για οικογενειακό DCM. Από τότε, μεταλλάξεις σε RBM20 έχουν βρεθεί σε πολλαπλές κοόρτες, υπεύθυνες για το 3% έως 5% όλων των οικογενών περιπτώσεων DCM. 77,78 Στη συνέχεια, ένας μοριακός μηχανισμός που συνδέει το RBM20 με εναλλακτικό μάτισμα αρκετών βασικών καρδιακών γονιδίων συμπεριλαμβανομένης της τιτίνης αναγνωρίστηκε από τους Guo et al. 80 αρουραίοι με έλλειψη Rbm20 με καρδιακό φαινότυπο που μοιάζει πολύ με το DCM σε άτομα με RBM20 αναλύθηκαν μεταλλάξεις. Η αλληλουχία RNA των καρδιών του αρουραίου με έλλειψη Rbm20 και ενός ανθρώπινου φορέα μετάλλαξης RBM20 αποκάλυψε ένα σύνολο 30 εξαρτώμενων από RBM20 εναλλακτικά ματισμένων γονιδίων που διατηρήθηκαν μεταξύ αρουραίου και ανθρώπου. Ένα από τα συμβάντα ματίσματος που εξαρτώνται από το Rbm20 είναι αυτό της περιοχής ελατηρίου της τιτίνης και πιστεύεται ότι είναι ένας σημαντικός καθοριστικός παράγοντας του φαινοτύπου DCM. 80,81 Στα ποντίκια, η απώλεια Rbm20 έχει ως αποτέλεσμα μια γιγάντια ισομορφή τιτίνης (N2BA-G), αύξηση της ελαστικότητας που βασίζεται στην τιτίνη και εξασθενημένο μηχανισμό Frank-Starling (δηλ. την ικανότητα αύξησης της συσταλτικής δύναμης με αυξημένο σαρκομέριο μήκος). 95 Εκτός από τα εναλλακτικά συμβάντα ματίσματος στην τιτίνη, είναι πλέον γνωστό ότι το RBM20 ρυθμίζει επίσης εναλλακτικά συμβάντα ματίσματος σε CamkIIδ, Ryr2 και Cacna1c. 82 Η απώλεια του Rbm20 προκαλεί μια αλλαγή CamkIIδ από CamKIIδ-B και CamkIIδ-C σε 2 μεγαλύτερες ισομορφές (CamkIIδ-A και CamkIIδ-9). Αυτό δυνητικά οδηγεί σε απορύθμιση της φυσιολογικής λειτουργίας του CamkIIδ και μπορεί να επηρεάσει την ομοιόσταση του Ca 2+ και άλλες λειτουργίες του CamkIIδ. Τα εναλλακτικά συμβάντα ματίσματος στο Ryr2 και το Cacna1c θα μπορούσαν επίσης να επηρεάσουν την ομοιόσταση του Ca 2+ και μαζί μπορεί να συμβάλουν στον αυξημένο κίνδυνο αιφνίδιου καρδιακού θανάτου σε RBM20 φορείς μετάλλαξης. Είναι αξιοσημείωτο ότι η έκφραση του RBM20 ποικίλλει πολύ στις άρρωστες ανθρώπινες καρδιές και η έκφρασή του συσχετίζεται με το μάτισμα των γονιδίων-στόχων RBM20. 82 Αυτό υποδηλώνει ότι και στο RBM20 αρνητικό DCM μετάλλαξης, το RBM20 μπορεί να παίζει ρόλο στην εξέλιξη της νόσου.

Η ανοδική ρύθμιση του SF3B1, ενός άλλου παράγοντα ματίσματος, μπορεί να είναι αρκετή για να προκαλέσει καρδιακή νόσο. Το SF3B1, ένας επαγόμενος από το Hif1α παράγοντας ματίσματος, ρυθμίζεται προς τα πάνω στην άρρωστη καρδιά του ανθρώπου και του ποντικού και συντονίζει μια μετατόπιση στις ισομορφές της κετοεξοκινάσης. 89 Η κετοεξοκινάση είναι το κεντρικό ένζυμο που μεταβολίζει τη φρουκτόζη και υπάρχει σε 2 ισομορφές: την κετοεξοκινάση-Α και την κετοεξοκινάση-C. Κατά τη διάρκεια της υπερτροφίας και της ανεπάρκειας, η καρδιά στρέφεται προς περισσότερη γλυκόλυση εις βάρος του μεταβολισμού των λιπαρών οξέων, 96 και η μετατόπιση που προκαλείται από το SF3B1 από την κετοεξοκινάση-Α στην κετοεξοκινάση-C είναι απαραίτητη και επαρκής για την επιβολή φρουκτόλυσης στα καρδιομυοκύτταρα. Είναι ενδιαφέρον ότι η καρδιακή-ειδική απώλεια του SF3B1 ή της κετοεξοκινάσης αποτρέπει τη μεταβολική αλλαγή και προστατεύει από την παθολογική καρδιακή ανάπτυξη.

Μέλη της οικογένειας των πρωτεϊνών FOX είναι επίσης απορυθμισμένα σε καρδιακές παθήσεις. Η έκφραση του Rbfox1 μειώνεται σε ανεπαρκείς καρδιές ανθρώπων και ποντικών και η απώλεια του Rbfox1 επιδεινώνει την υπερφόρτωση της πίεσης στα ποντίκια. 83 Η ανάλυση ματίσματος αποκάλυψε έναν διακόπτη ισομορφής στην οικογένεια γονιδίων του ενισχυτή μυοκυττάρου παράγοντα-2 (Mef2), που περιλαμβάνει τα αμοιβαία αποκλειόμενα εξόνια α1 και α2, η οποία παρεμβαίνει στη μεταγραφική δραστηριότητα του Mef2. Είναι αξιοσημείωτο ότι η επανέκφραση του Rbfox1 σε καρδιές ποντικών με υπερφόρτωση πίεσης εξασθενεί την καρδιακή υπερτροφία και ανεπάρκεια.

Η έκφραση του Rbfox2 μειώνεται επίσης στην υπερφορτωμένη με πίεση καρδιά του ποντικιού και η υπό όρους διαγραφή του Rbfox2 οδηγεί σε DCM και HF. 85 Η ανάλυση ματίσματος τόσο των υπερφορτωμένων με πίεση καρδιών όσο και των καρδιών Rbfox2 −/− αποκάλυψε έναν εμπλουτισμό σε αναπτυξιακά ρυθμιζόμενα συμβάντα ματίσματος. Εντυπωσιακά, αυτά τα συμβάντα ματίσματος αντιστράφηκαν με την απώλεια του Rbfox2, υποδηλώνοντας έναν ρόλο για το Rbfox2 στη φάση αντιστάθμισης κατά τη διάρκεια της καρδιακής νόσου.

Μεταλλάξεις σε τοποθεσίες Splice που οδηγούν σε ανθρώπινη καρδιακή νόσο

Υπάρχουν επί του παρόντος μόνο λίγα παραδείγματα μεταλλάξεων σε θέσεις ματίσματος που προκαλούν άμεσα καρδιακή νόσο στον άνθρωπο (Πίνακας 2). Μία από τις πρώτες μεταλλάξεις της θέσης ματίσματος που έχει αναφερθεί ότι οδηγεί σε καρδιακή νόσο είναι μια μετάλλαξη στη θέση ματίσματος 5' του εξονίου 15 της καρδιάς TNNT2. 97 Μια μετάβαση G-A διαταράσσει τη θέση ματίσματος 5' και οδηγεί σε περικοπή παραλλαγών mRNA. Είναι ενδιαφέρον ότι η διακοπή της θέσης ματίσματος οδηγεί όχι μόνο σε παράβλεψη του εξονίου 15 αλλά και σε ενεργοποίηση μιας κρυπτικής θέσης ματίσματος στο εξόνιο 15, με αποτέλεσμα ένα δεύτερο μη ανώμαλο προϊόν ματίσματος του TNNT2. Κατά συνέπεια, οι σαρκομερικές συσπάσεις εξασθενούν και επέρχεται υπερτροφική μυοκαρδιοπάθεια. Στο ίδιο μήκος κύματος, οι Bonne et al 98 ανέφεραν μια μετάλλαξη στη θέση ματίσματος πρωτεΐνη-C που δεσμεύει τη μυοσίνη, που κωδικοποιεί επίσης μια σαρκομερική πρωτεΐνη, που προκαλεί υπερτροφική μυοκαρδιοπάθεια. Είναι ενδιαφέρον, όπως το TNNT2 μετάλλαξη, η μετάλλαξη σε πρωτεΐνη-C που δεσμεύει τη μυοσίνη διαταράσσει μια θέση ματίσματος και ταυτόχρονα ενεργοποιεί μια κρυπτική κατάντη θέση ματίσματος, με αποτέλεσμα ανώμαλο μάτισμα του mRNA πρωτεΐνης C που δεσμεύει τη μυοσίνη.

Πίνακας 2. Μεταλλάξεις τοποθεσίας Splice που έχουν αποδειχθεί ότι είναι αιτίες για ανθρώπινη καρδιακή νόσο

Το RBP υποδεικνύει πρωτεΐνη δέσμευσης RNA και παράγοντα ματίσματος SRSF, πλούσιο σε σερίνη/αργινίνη.

Στο οικογενειακό DCM, TTN είναι το πιο συχνά μεταλλαγμένο γονίδιο και σε ≈25% των ιδιοπαθών οικογενών ασθενών DCM, περικόπτουν μεταλλάξεις σε TTN βρίσκονται. Συγκεκριμένα, ≈31% των περικοπών μεταλλάξεων σε TTN είναι μεταλλάξεις θέσεων ματίσματος. 99 Αυτές οι μεταλλάξεις της θέσης ματίσματος μεταβάλλουν το TTN πλήρους μήκους και αλλάζουν την παθητική ακαμψία του καρδιακού μυός. Είναι ενδιαφέρον ότι η μεταβολή των ισομορφών TTN στην καρδιακή νόσο, το 110 και η ανώμαλη συναρμογή TTN μπορεί επομένως να είναι τόσο αιτία όσο και συνέπεια καρδιακής νόσου.

Σε ορισμένες περιπτώσεις, αντί να διαταράξει μια θέση ματίσματος, η μετάλλαξη προκαλεί μια νέα θέση ματίσματος. Για παράδειγμα σε SCN5A, η οποία κωδικοποιεί την υπομονάδα α του καρδιακού καναλιού νατρίου, μια εισαγωγή 4 bp στο εξόνιο 27 δημιουργεί μια κρυπτική θέση ματίσματος, προκαλώντας μια διαγραφή 96 bp που οδηγεί στην απώλεια βασικών τομέων του SCN5A. 107 Το μεταλλαγμένο κανάλι αποτυγχάνει να εκφράσει οποιοδήποτε ρεύμα νατρίου και οδηγεί στο σύνδρομο Brugada, μια καρδιακή νόσο που χαρακτηρίζεται από μη φυσιολογικό ΗΚΓ και αυξημένο κίνδυνο αιφνίδιου θανάτου.

Περισσότερα παραδείγματα γονιδίων με μεταλλάξεις θέσης ματίσματος παρατίθενται στον Πίνακα 2 και είναι πιθανό ότι, με την τρέχουσα κατανόηση της σημασίας του σωστού ματίσματος και της χρήσης μεθόδων διαλογής σε όλο το γονιδίωμα, θα ακολουθήσουν πολλά άλλα.

Μυοτονική Δυστροφία

Η μυοτονική δυστροφία (DM), πιθανώς η πιο γνωστή διαταραχή που σχετίζεται με το μάτισμα, είναι μια νευρομυϊκή νόσος που χαρακτηρίζεται από μυϊκή απώλεια, μυϊκή υπερσυστολή, ελαττώματα καρδιακής αγωγιμότητας και μυοκαρδιοπάθεια. Υπάρχουν 2 τύποι ΣΔ: ο τύπος 1, ο οποίος προκαλείται από την επέκταση των επαναλήψεων CUG στο 3'UTR του DMPK γονίδιο και τύπος 2, ο οποίος προκαλείται από την επέκταση των επαναλήψεων CCUG στο εσώνιο 1 στο ZNF9 γονίδιο. Τα υγιή άτομα έχουν 5 έως 40 επαναλήψεις, ενώ οι ασθενείς με ΣΔ έχουν εκατοντάδες έως χιλιάδες από αυτές τις επαναλήψεις. 111 Οι παράγοντες ματίσματος της οικογένειας των μυοτυφλών και των CELF είναι ανταγωνιστικά (αλλά χωριστά) απορυθμισμένοι στο ΣΔ και φαίνεται να παίζουν κρίσιμο ρόλο στην ανάπτυξη του ΣΔ. Από αυτή την άποψη, οι μυοτυφλές πρωτεΐνες αποδείχθηκε ότι απομονώνονται στις επαναλήψεις (C)CUG του μεταλλαγμένου RNA και συσσωματώνονται σε πυρηνικές εστίες, γεγονός που παρεμβαίνει στο μάτισμα των μυοτυφλών στόχων. 112 Στον ΣΔ τύπου 1 (αλλά όχι στον τύπο 2), το CUGBP1 (ή CELF) υπερφωσφορυλιώνεται από την πρωτεϊνική κινάση C και η δραστηριότητά του είναι αυξημένη. 113 Επιπλέον, η έκφραση του CELF ρυθμίζεται από τα miR-23a και miR-23b, τα οποία ρυθμίζονται προς τα κάτω στις καρδιές ΣΔ. 114.115 Οι ανταγωνιστικές λειτουργίες του μυοτυφλού και του CELF παρατηρούνται επίσης κατά την ανάπτυξη και η αθροιστική επίδραση της απώλειας της λειτουργίας του μυοτυφλού και του κέρδους της λειτουργίας του CELF προάγει ένα εμβρυϊκό προφίλ ματίσματος στο ΣΔ. Στα ποντίκια, τόσο η απώλεια της λειτουργίας του μυοτυφλού όσο και η αύξηση της λειτουργίας του CELF επαρκούν για να επάγουν έναν φαινότυπο που μοιάζει με DM. 86,87 Καρδιακές ανωμαλίες συμβαίνουν σε >80% των ασθενών με ΣΔ, 115, αλλά οι ακριβείς μοριακοί μηχανισμοί που διέπουν αυτές τις καρδιακές ανωμαλίες δεν είναι πλήρως κατανοητοί. Πιθανότατα σχετίζεται με τις διαταραγμένες λειτουργίες του μυοτυφλού και του CELF, που είναι γνωστό ότι ρυθμίζουν το μάτισμα των ClC-1, TNNT2 και TNNT3. 86 Εκτός από τις διαταραχές ματίσματος, είναι πλέον γνωστό ότι οι επαναλήψεις CUG προκαλούν συνολική μείωση της έκφρασης Mef2. 115 Αυτό, με τη σειρά του, οδηγεί σε μειωμένη έκφραση των γονιδίων-στόχων Mef2 και σε γενικό επαναπρογραμματισμό του καρδιακού μεταγραφώματος.

Τέλος, παρόλο που είναι γενικά αποδεκτό ότι οι επαναλήψεις CUG είναι αιτιολογικές για το DM1 και είναι γνωστό ότι οι επαναλήψεις είναι απαραίτητες και επαρκείς για την πρόκληση του φαινοτύπου της νόσου, 116.117 δεν μπορεί να αποκλειστεί ο ρόλος της ίδιας της DMPK, καθώς οι ασθενείς με DM1 έχουν μειωμένη DMPK στο κυτταρόπλασμα, 118 και ποντίκια με απώλεια DMPK εμφανίζουν ήπιο φαινότυπο DM. 119

Θεραπευτικό Δυναμικό Εναλλακτικού Συναρμογής

Υπάρχουν διάφοροι τρόποι με τους οποίους μπορεί να χρησιμοποιηθεί εναλλακτικό μάτισμα στην κλινική, αλλά ορισμένες προσεγγίσεις είναι πιο ελπιδοφόρες από άλλες. Σε ένα διαγνωστικό περιβάλλον, εναλλακτικά προφίλ ματίσματος ή ειδική έκφραση ισομορφής ματίσματος μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως βιοδείκτες για διαφορετικές ανθρώπινες ασθένειες. Η συνδυασμένη αναλογία μείζονος και δευτερεύουσας ισομορφής μόνο 3 καρδιακών γονιδίων ήταν επαρκής για να αποδοθούν σωστά τα δείγματα σε κατάσταση είτε υγιούς είτε ασθένειας (ισχαιμική μυοκαρδιοπάθεια, DCM και στένωση αορτής). 74 Ένα άλλο παράδειγμα είναι η διαγνωστική χρήση της EH-myomesin, μιας επαναεκφρασμένης εμβρυϊκής ισομορφής της μυομεσίνης, ως δείκτη για το ανθρώπινο DCM. Είναι ενδιαφέρον ότι η EH-μυομεσίνη σηματοδοτεί συγκεκριμένα το DCM και όχι την υπερτροφική μυοκαρδιοπάθεια ή το DCM με μια βοηθητική συσκευή αριστερής κοιλίας. 120

Όσον αφορά τη θεραπεία, μια πολλά υποσχόμενη προσέγγιση είναι η χρήση αντιπληροφοριακών ολιγονουκλεοτιδίων (AONs) για την ανακατεύθυνση του ματίσματος. Αυτή η προσέγγιση έχει δοκιμαστεί σε μια ποικιλία ασθενειών, όπως η μυϊκή δυστροφία Duchenne, η νωτιαία μυϊκή ατροφία 121, η προγηρία Hutchinson-Gilford, 123 και η ΣΔ. 124 AON συνδέονται σε θέσεις ματίσματος με συμπληρωματικό τρόπο, εμποδίζοντας έτσι την πρόσβαση των RBP στον στόχο τους. Στη μυϊκή δυστροφία Duchenne, τα AON χρησιμοποιούνται για να προκαλέσουν παράλειψη εξονίου του εξονίου που περιέχει την παθογόνο μετάλλαξη στο γονίδιο της δυστροφίνης, αποκαθιστώντας εν μέρει τη λειτουργικότητα της πρωτεΐνης δυστροφίνης. Αυτά τα AON έχουν ήδη δοκιμαστεί σε κλινικές δοκιμές και έχουν δώσει ενθαρρυντικά αποτελέσματα. Σε αυτά τα παραδείγματα, τα AON έχουν χρησιμοποιηθεί με τρόπο απώλειας λειτουργίας, καθώς εμποδίζουν τις θέσεις ματίσματος (τόσο ενισχυτές ματίσματος όσο και σιγαστήρες). Αντίθετα, τα AON μπορούν επίσης να χρησιμοποιηθούν με τρόπο κέρδους λειτουργίας, όπου συνδέονται με τους στόχους τους και είτε μιμούνται το αποτέλεσμα ενός RBP 125 είτε χρησιμεύουν ως δεσμευτική θέση για RBP. 126 Σε αυτή την περίπτωση, το AON περιλάμβανε μια συμπληρωματική ακολουθία με τον στόχο του και συζευγνύεται είτε με έναν συνθετικό τομέα RS είτε με μια θέση συνθετικής ματίσματος. Μια άλλη προσέγγιση είναι η χρήση του μεταφρ-splicing, μια μορφή ματίσματος κοινή στους κατώτερους ευκαρυώτες, όπου 2 διαφορετικές μεταγραφές συνδυάζονται μεταξύ τους. Μεταφρ-Το μάτισμα βασίζεται στην εισαγωγή ενός εξωγενούς υγιούς μεταγράφου, το οποίο στη συνέχεια μπορεί να ματιστεί μαζί με το μεταλλαγμένο προ-mRNA. Εν ολίγοις, ένα μεταγράφημα άγριου τύπου με μια συμπληρωματική αλληλουχία σε ένα εσώνιο ανάντη του μεταλλαγμένου εξονίου και μια ισχυρή θέση ματίσματος στο άκρο 3' συνδέεται με το μεταλλαγμένο προ-mRNA και το μάτισμα στη συνέχεια ματίζει το υγιές τμήμα άγριου τύπου σε το μεταλλαγμένο mRNA, αντικαθιστώντας το μεταλλαγμένο εξόνιο. Αυτή η τεχνική ονομάζεται RNA μεσολαβούμενο από μάτισμα μεταφρ-splicing (SMaRT) και έχει χρησιμοποιηθεί επιτυχώς in vitro και in vivo στη μυϊκή δυστροφία Duchenne, 127 και είναι χρήσιμο για ασθενείς με μεταλλάξεις που δεν επιτρέπουν την παράλειψη εξονίων ως τρόπος αποκατάστασης μιας λειτουργικής πρωτεΐνης δυστροφίνης. Άλλες πιθανές προσεγγίσεις περιλαμβάνουν την (επαν)εισαγωγή παραγόντων ματίσματος σε άρρωστο ιστό, για παράδειγμα, με τη χρήση αδενοσυνδεόμενων ιών. Πιθανοί υποψήφιοι για αυτήν την παρέμβαση θα μπορούσαν να είναι το RBM20 in RBM20 φορείς μετάλλαξης και μυοτυφλοί σε ασθενείς με ΣΔ. Θα μπορούσε επίσης να εξεταστεί η χρήση RNAi (π.χ. siRNAs) για την καταστροφή των επιβλαβών ισομορφών ματίσματος ή η εισαγωγή προστατευτικών ισομορφών ματίσματος με αδενοσχετιζόμενους ιούς σε ασθένειες. Τέλος, η χρήση μικρών μορίων για την αλλαγή της δραστηριότητας της RBP παρέχει ένα μέσο για τη ρύθμιση της εναλλακτικής ματίσματος, αλλά ένα σημαντικό μειονέκτημα εδώ είναι ο μεγάλος κίνδυνος επιδράσεων εκτός στόχου. 128

Συμπεράσματα και μελλοντικές κατευθύνσεις

Το αναδυόμενο πεδίο της βιολογίας του RNA, ειδικά το μάτισμα RNA, έχει κάνει μεγάλα άλματα προς τα εμπρός την τελευταία δεκαετία. Πολλά περισσότερα είναι γνωστά για τη ρύθμιση του ματίσματος, ο κώδικας ματίσματος αρχίζει να ξετυλίγεται και η αναγνώριση των κρίσιμων παραγόντων ματίσματος και των λειτουργιών τους, όπως το RBM20 και το SF3B1 στην καρδιά, οδήγησε σε νέα γνώση των μηχανισμών ασθενειών. Ωστόσο, η υποεκτίμηση του αριθμού των διαμορφωτών ματίσματος, των μεταλλάξεων ματίσματος και των ισομορφών ματίσματος υποδεικνύει ότι το μάτισμα διαταράσσεται σε πολλές περισσότερες ασθένειες από ό,τι πιστεύαμε προηγουμένως, και αυτό μπορεί να σημαίνει ότι ορισμένες ασθένειες θα πρέπει να επανεξεταστούν για ανωμαλίες ματίσματος. Σε προηγούμενες μελέτες, οι μικροσυστοιχίες χρησιμοποιήθηκαν κυρίως για να διερευνήσουν την έκφραση γονιδίων και τις διαφορές ισομορφής ματίσματος. Ωστόσο, αυτή η τεχνική έχει σοβαρούς περιορισμούς, καθώς περιορίζεται από το σχεδιασμό των ανιχνευτών συστοιχίας, και επομένως δεν θα συλλάβει ποτέ όλες τις γνωστές ή πιθανές ισομορφές mRNA. Επιπλέον, καθώς βασίζεται σε προηγούμενα σχολιασμένα γονίδια, δεν έχουν αναλυθεί νέες κατηγορίες γονιδίων όπως τα lncRNA. Είναι επομένως πιθανό ότι ο αριθμός των παρατηρούμενων εναλλακτικών γεγονότων ματίσματος υποτιμάται σε μεγάλο βαθμό σε αυτές τις μελέτες. Σήμερα, ο προσδιορισμός της αλληλουχίας RNA είναι η μέθοδος εκλογής για τη μελέτη διαφορών τόσο στην έκφραση γονιδίου όσο και σε ισομορφή. Το πλεονέκτημα της αλληλουχίας RNA είναι ότι συλλαμβάνει όλες τις ισόμορφες mRNA που υπάρχουν, αλλά η ανάλυση εξακολουθεί να παρεμποδίζεται από την έλλειψη τυποποιημένων μεθόδων και τον ελλιπή σχολιασμό των μεταγραφωμάτων.

Η έκφραση των σωστών ισομορφών μπορεί να αποδειχθεί εξίσου σημαντική για τη σωστή καρδιακή μορφή και λειτουργία με τη συνολική ποσότητα μιας μεταγραφής που εκφράζεται. Η ανάλυση του ρόλου των εμβρυϊκών ισομορφών και η διόρθωση προς ευεργετικές ισομορφές μπορεί, επομένως, να είναι εξίσου σημαντική για τη σωστή λειτουργία της καρδιάς με τη διόρθωση των επιπέδων γονιδιακής έκφρασης. Επιπλέον, είναι ενδιαφέρον να δούμε ότι πρωτεΐνες με άσχετες βιολογικές λειτουργίες ταυτοποιούνται ότι έχουν επίσης ρόλο στο μάτισμα. Για παράδειγμα, ο μεταγραφικός παράγοντας Tbx3, κλασικά γνωστός για τον κρίσιμο μεταγραφικό του ρόλο στην ανάπτυξη και τη μοίρα των κυττάρων, αναγνωρίστηκε πρόσφατα ότι έχει ικανότητα δέσμευσης RNA και συντονίζει επίσης το μάτισμα. 129 Συνεπώς, ο αριθμός των αναγνωρισμένων RBP πιθανότατα θα αυξηθεί τα επόμενα χρόνια. Μια άλλη πρόκληση θα είναι να ξετυλίξουμε τα προφίλ ματίσματος διαφορετικών παραγόντων ματίσματος και τον συνεργατικό ρόλο που μπορεί να διαδραματίσουν αυτοί οι παράγοντες ματίσματος. Οι πρόσφατες πρόοδοι στις τεχνικές διερεύνησης της αλληλεπίδρασης πρωτεΐνης-RNA, όπως η Αλληλουχία υψηλής απόδοσης του RNA που απομονώνεται με Διασταυρούμενη Ανοσοκαθίζηση (HITS-CLIP για τον εντοπισμό στόχων RNA των RBPs) και η Ανοσοκατακρήμνιση με δυνατότητα φωτοενεργοποιήσιμης ριβονουκλεοσίδης με ενισχυμένη αναγνώριση διασταυρούμενης σύνδεσης (PAR-CLIP to των RBPs), θα μπορούσε να χρησιμοποιηθεί για την απόκτηση πληρέστερης κατανόησης των δικτύων-στόχων RBP. Από αυτή την άποψη, πολλοί παράγοντες ματίσματος έχουν επικαλυπτόμενους γονιδιακούς στόχους. Για παράδειγμα, το CamkIIδ και το LDB3 μπορούν και τα δύο να συναρμολογηθούν από το RBM20 και το ASF/SF2, και θα είναι ενδιαφέρον να δούμε σε ποιο βαθμό το μάτισμα συντονίζεται ως καθολικά προφίλ ματίσματος ή ως μεμονωμένα συμβάντα. Επίσης, η συναρπαστική ιδέα των (καρδιακών) κύριων ρυθμιστών ματίσματος, δηλαδή παραγόντων ματίσματος που ρυθμίζουν ολόκληρα δίκτυα μεταγραφών, απαραίτητων για τη διαφοροποίηση, την προδιαγραφή ή τη δέσμευση ενός συγκεκριμένου τύπου κυττάρου ή τύπου ιστού, πιθανότατα θα κερδίσει την προσοχή τα επόμενα χρόνια . 130 Η παρατήρηση ότι μεταλλάξεις σε μεταφρ-Τα δρώντα RBP μπορούν να προκαλέσουν ασθένεια που περιορίζεται σε έναν μεμονωμένο ιστό ή κυτταρικό διαμέρισμα, ακόμη και όταν η RBP εκφράζεται πανταχού παρόντα (π.χ. απώλεια SMN1 σε νωτιαία μυϊκή ατροφία), υποστηρίζει την έννοια των κυρίων ρυθμιστών ματίσματος.

Επιπλέον, ορισμένες πτυχές του ματίσματος αξίζουν περισσότερη προσοχή από ό,τι είχαν λάβει στο παρελθόν. Για παράδειγμα, ένας πιθανός ρόλος για το εξαιρετικά εξελικτικό συντηρημένο δευτερεύον ματίσωμα σε ασθένεια, ίσως ως μέσο ελέγχου της έκφρασης ενός συγκεκριμένου συνόλου γονιδίων, μένει να προσδιοριστεί. Η ανοδική ρύθμιση της δραστηριότητας MAPK της p38 στην καρδιακή νόσο υποδηλώνει ότι το δευτερεύον μάτισμα είναι πιο ενεργό στην καταπονημένη καρδιά. 131 Ως εκ τούτου, μπορεί να είναι ενδιαφέρον να διερευνηθεί το μικρό μάτισμα στο πλαίσιο του πολλαπλασιασμού των μυοκυττάρων ή της καρδιακής αναγέννησης.

Συμπερασματικά, αν και έχει σημειωθεί πρόοδος στην κατανόησή μας για την εναλλακτική συναρμολόγηση, είναι σαφές ότι αυτή η γνώση είναι ακόμα περιορισμένη. Από τη θετική πλευρά, η κατανόησή μας έχει ήδη οδηγήσει σε πολλά υποσχόμενες θεραπευτικές επιλογές. Ωστόσο, η αναγνώριση του κώδικα καρδιακού ματίσματος και όλων των απαιτούμενων συστατικών του εναλλακτικού ματίσματος θα είναι ζωτικής σημασίας για μια ολοκληρωμένη κατανόηση αυτής της δυναμικής και ευέλικτης διαδικασίας στην καρδιά.


Τρέχοντες περιορισμοί και προοπτικές

Το μάτισμα έχει μελετηθεί εντατικά, αλλά είναι μόνο μία από τις διαδικασίες που καθορίζουν τη χημική σύνθεση του mRNA. Οι ρόλοι της επεξεργασίας RNA και των τροποποιήσεων RNA εστιάζονται τώρα ως πρόσθετες πιθανές πηγές ετερογένειας. Οι τεχνικές διαμόρφωσης μεταγραφικού προφίλ είναι ισχυρές λόγω της εξαιρετικής λεπτομέρειας που παρέχουν και η απεικόνιση επιτρέπει στους ερευνητές να παρακολουθούν τα κύτταρα με την πάροδο του χρόνου. Οι μελλοντικές προσπάθειες συνδυασμού αυτών των πλεονεκτημάτων προκειμένου να δημιουργηθούν διαχρονικές μελέτες μεταγραφής και ματίσματος είναι ελπιδοφόρες αλλά σε πρώιμα στάδια [122]. Εν τω μεταξύ, το πρόβλημα της ερμηνείας των φαινοτυπικών συνεπειών της μεταβλητότητας παραμένει μια σημαντική πρόκληση.


2.5 – Μεταγραφή και Μετάφραση

Ένα συμπληρωματικό αντίγραφο του DNA δημιουργείται στον πυρήνα για να σχηματιστεί το mRNA. Αυτή η διαδικασία καταλύεται από το ένζυμο RNA πολυμεράση. Για την αντιγραφή του mRNA, ξετυλίγεται η διπλή έλικα του DNA ελικάση DNA, με τους δεσμούς υδρογόνου να σπάνε μεταξύ των ζευγών βάσεων που πρόκειται να αντιγραφούν. Το DNA ανοίγει στη θέση μεταγραφής ή στη θέση του γονιδίου που πρέπει να αντιγραφεί.

Το σκέλος κωδικοποίησης, ή το σκέλος αίσθησης, είναι το πρότυπο για το mRNA. Ωστόσο, το mRNA είναι στην πραγματικότητα χτισμένο ενάντια στο αντι-λογικό σκέλος. Έχει το ίδιο μοτίβο με το αντίθετο σκέλος λόγω του δωρεάν συνδυασμού βάσεων.

Τα ελεύθερα νουκλεοτίδια ζευγαρώνουν με τα νουκλεοτίδια του DNA. Η μόνη διαφορά είναι ότι ουρακίλη αντικαθιστά τη θυμίνη, δεσμεύεται με την αδενίνη. Η RNA πολυμεράση σχηματίζει τους φωσφοδιεστερικούς δεσμούς για να δημιουργήσει τη ραχοκοκαλιά του μορίου mRNA. Το mRNA στη συνέχεια αποσπάται και φεύγει από τον πυρήνα μέσω των πυρηνικών πόρων στη μεμβράνη. Εισέρχεται στο κυτταρόπλασμα για ανάγνωση στα ριβοσώματα. Η διπλή έλικα του DNA αναμορφώνεται.

2.5.3 – Περιγράψτε τον γενετικό κώδικα με όρους κωδικονίων που αποτελούνται από τρίδυμα βάσεων

Κάθε ακολουθία τριών βάσεων κωδικοποιεί ένα αμινοξύ, που ονομάζεται κώδικας τριπλής. Αυτές οι ομάδες των τριών ονομάζονται κωδικόνια.

Για κάθε αμινοξύ, έχει δύο ή τρεις τριάδες που κωδικοποιούν για αυτά. Άλλα τρίδυμα λειτουργούν ως «αρχή' ή 'να σταματήσεικωδικόνια, τα οποία ορίζουν πού να αρχίσει και πού να τελειώσει η πολυπεπτιδική αλληλουχία.

Υπάρχουν επίσης πολλές τρίδυμες που κωδικοποιούν αυτά τα κωδικόνια «σημείων στίξης».

2.5.4 – Εξηγήστε τη διαδικασία μετάφρασης, που οδηγεί στον σχηματισμό πολυπεπτιδίων

Τα αμινοξέα ενεργοποιούνται με συνδυασμό με tRNA (RNA μεταφοράς) στο κυτταρόπλασμα. Τα μόρια tRNA έχουν σχήμα φύλλου τριφυλλιού. Κάθε μόριο συνδέεται με ένα συγκεκριμένο αμινοξύ κωδικόνιο, το άλλο άκρο συνδέεται με το αμινοξύ. Το άλλο άκρο έχει ένα αντικωδικόνιο, οι οποίες
είναι το συμπληρωματικό κωδικόνιο για το mRNA. Το tRNA συνδέεται με το αμινοξύ, που καταλύεται από ένα ένζυμο. Αυτή η διαδικασία χρησιμοποιεί ATP.

Μόλις μεταγραφεί το μόριο mRNA, αποστέλλεται στο ριβόσωμα στο κυτταρόπλασμα ή στο ενδοπλασματικό δίκτυο για μετάφραση. Η πρωτεΐνη σχηματίζεται από τα πολυπεπτίδια, τα οποία συσσωρεύονται στα ριβοσώματα. Τα ριβοσώματα κινούνται κατά μήκος του mRNA και «διαβάζουν» τον κώδικα, ξεκινώντας από το κωδικόνιο έναρξης.

Από εδώ, τα μόρια tRNA, με τα αμινοξέα τους, βρίσκουν το συμπληρωματικό κωδικόνιό τους στο mRNA. Τα αμινοξέα δεσμεύονται στα ριβοσώματα για να σχηματίσουν το πολυπεπτιδικές αλυσίδες. Στη συνέχεια, το tRNA διαχωρίζεται από το αμινοξύ και το mRNA και αποστέλλεται πίσω στο κυτταρόπλασμα για να βρει περισσότερα αμινοξέα. Αυτή η διαδικασία συνεχίζεται μέχρι να επιτευχθεί ένα κωδικόνιο τερματισμού, οπότε απελευθερώνεται η πολυπεπτιδική αλυσίδα.

Προκειμένου να παρασχεθούν αρκετά ελεύθερα αμινοξέα για μετάφραση, ετερότροφα να τα καταναλώνουν στην πρωτεΐνη της διατροφής τους.

Το πρώτο κωδικόνιο στο μόριο mRNA είναι το AUG, το κωδικόνιο έναρξης, το οποίο συνδέεται με το αντι κωδικόνιο [UAC] στο μόριο tRNA. Αυτό το μόριο tRNA μεταφέρει τα αμινοξέα Μεθειονίνη. Η δέσμευση κωδικονίου με αντικωδικόνιο είναι αντιπαράλληλος.

Τα πολυπεπτίδια σχηματίστηκαν με πτυχή στο σχήμα τους για την πρωτεΐνη ως αποτέλεσμα διαφόρων διαμοριακών δυνάμεων.

Η διαδικασία συνεχίζεται μέχρι να σχηματιστεί το πλήρες πολυπεπτίδιο.

2.5.5 – Συζητήστε τη σχέση μεταξύ ενός γονιδίου και ενός πολυπεπτιδίου

Η θεωρία είναι ότι ένα γονίδιο σχηματίζει ένα πολυπεπτίδιο. Αυτό ισχύει στις περισσότερες περιπτώσεις, ωστόσο υπάρχουν μερικές εξαιρέσεις:


Μεταγραφή σε Προκαρυώτες και Ευκαρυώτες (Με Διάγραμμα)

Στους προκαρυωτικούς οργανισμούς η μεταγραφή λαμβάνει χώρα σε τρεις φάσεις γνωστές ως έναρξη, επιμήκυνση και τερματισμό.

Το RNA συντίθεται από ένα μόνο ένζυμο RNA πολυμεράσης που περιέχει πολλαπλές πολυπεπτιδικές υπομονάδες. Στο E. coli, η RNA πολυμεράση έχει πέντε υπομονάδες: δύο α, μία β, μία β' και μία σ υπομονάδα (α2ββ’σ). Αυτή η μορφή ονομάζεται ολοένζυμο. Η υπομονάδα σ μπορεί να διαχωριστεί από τις άλλες υπομονάδες για να αφήσει μια μορφή γνωστή ως ένζυμο πυρήνα.

Αυτές οι δύο μορφές της RNA πολυμεράσης έχουν διαφορετικούς ρόλους στη μεταγραφή:

(i) Έναρξη:

Η μεταγραφή δεν μπορεί να ξεκινήσει τυχαία, αλλά πρέπει να ξεκινήσει συγκεκριμένα στην αρχή ενός γονιδίου. Τα σήματα για την έναρξη της μεταγραφής συμβαίνουν στην αλληλουχία προαγωγέα που βρίσκεται απευθείας ανάντη της μεταγραφόμενης αλληλουχίας του γονιδίου. Ο προαγωγέας περιέχει συγκεκριμένες αλληλουχίες DNA που δρουν ως σημεία σύνδεσης για την RNA πολυμεράση.

Στο E. coli, υπάρχουν δύο στοιχεία αλληλουχίας που αναγνωρίζονται από την RNA πολυμεράση γνωστή ως αλληλουχία -10 και την αλληλουχία -35. Οι ακριβείς αλληλουχίες μπορεί να ποικίλλουν μεταξύ των προαγωγέων, αλλά όλες συμμορφώνονται με ένα συνολικό πρότυπο γνωστό ως συναινετική αλληλουχία. Η σ υπομονάδα της RNA πολυμεράσης είναι υπεύθυνη για την αναγνώριση και τη δέσμευση του προαγωγέα, πιθανώς στο -35 Box.

Απουσία της υπομονάδας σ, το ένζυμο μπορεί ακόμα να συνδεθεί με το DNA, αλλά η δέσμευση είναι πιο τυχαία. Όταν το ένζυμο συνδέεται με τον προαγωγέα, αρχικά σχηματίζει ένα κλειστό σύμπλεγμα προαγωγέα στο οποίο το DNA του προαγωγέα παραμένει ως διπλή έλικα. Το ένζυμο καλύπτει περίπου 60 ζεύγη βάσεων του προαγωγέα συμπεριλαμβανομένων των κουτιών -10 και -35. Για να επιτραπεί η έναρξη της μεταγραφής, η διπλή έλικα διασπάται μερικώς στο πλαίσιο – 10, το οποίο είναι πλούσιο σε ασθενείς δεσμούς Α-1 για να δώσει ένα ανοιχτό σύμπλεγμα προαγωγέα.

Η υπομονάδα σ στη συνέχεια διασπάται από το σύμπλεγμα ανοιχτού προαγωγέα αφήνοντας το ένζυμο πυρήνα. Ταυτόχρονα τα δύο πρώτα ριβονουκλεοτίδια συνδέονται με το DNA, σχηματίζεται ο πρώτος φωσφοδιεστερικός δεσμός και ξεκινά η μεταγραφή (Εικ. 7.7).

(ii) Επιμήκυνση:

Κατά την επιμήκυνση η RNA πολυμεράση κινείται κατά μήκος του μορίου DNA λιώνοντας και ξετυλίγοντας τη διπλή έλικα καθώς προχωρά. Το ένζυμο προσθέτει ριβονουκλεοτίδια στο 3′ άκρο του αναπτυσσόμενου μορίου RNA με τη σειρά προσθήκης να καθορίζεται από τη σειρά των βάσεων στον κλώνο του εκμαγείου.

Στις περισσότερες περιπτώσεις, μια αλληλουχία οδηγός μεταβλητού μήκους μεταγράφεται πριν επιτευχθεί η κωδικοποιητική αλληλουχία του γονιδίου. Παρομοίως, στο τέλος της κωδικεύουσας αλληλουχίας μεταγράφεται μια μη κωδικοποιητική ακολουθία τρέιλερ πριν τελειώσει η μεταγραφή.

Κατά τη μεταγραφή μόνο ένα μικρό τμήμα της διπλής έλικας ξετυλίγεται κάθε φορά. Η ξετυλιγμένη περιοχή περιέχει το πρόσφατα συντιθέμενο RNA βάσης σε σύζευξη με τον κλώνο DNA εκμαγείου και εκτείνεται σε 12-17 βάσεις.

Η περιοχή ξετυλίγματος πρέπει να παραμείνει μικρή γιατί το ξετύλιγμα σε μια περιοχή απαιτεί υπερβολική περιέλιξη σε γειτονικές περιοχές και αυτό επιβάλλει πίεση στο μόριο DNA. Για να ξεπεραστεί αυτό το πρόβλημα, το RNA απελευθερώνεται από το πρότυπο DNA καθώς συντίθεται επιτρέποντας στη διπλή έλικα του DNA να αναμορφωθεί (Εικ. 7.8).

(iii) Τερματισμός:

Ο τερματισμός της μεταγραφής συμβαίνει μη τυχαία και λαμβάνει χώρα σε συγκεκριμένα σημεία μετά το τέλος της κωδικοποιητικής ακολουθίας. Στο E. coli, ο τερματισμός λαμβάνει χώρα σε αλληλουχίες γνωστές ως παλίνδρομες. Αυτά είναι συμμετρικά γύρω από το μέσο τους έτσι ώστε το πρώτο μισό της ακολουθίας να ακολουθείται από το ακριβές συμπλήρωμά του στο δεύτερο μισό.

Σε μονόκλωνα μόρια RNA αυτό το χαρακτηριστικό επιτρέπει στο πρώτο μισό της αλληλουχίας να ζευγαρώσει βάσεων με το δεύτερο μισό για να σχηματίσει αυτό που είναι γνωστό ως δομή στελέχους-βρόχου (Εικ. 7.9). Αυτά φαίνεται να λειτουργούν ως σήματα τερματισμού. Σε ορισμένες περιπτώσεις η αλληλουχία στελέχους-βρόχου ακολουθείται από μια σειρά 5-10 όπως στο DNA που σχηματίζουν ασθενή ζεύγη βάσεων A-U με το πρόσφατα συντιθέμενο RNA.

Θεωρείται ότι η RNA πολυμεράση σταματά αμέσως μετά τον βρόγχο στελέχους και ότι τα ασθενή ζεύγη βάσεων A-U σπάνε προκαλώντας την αποκόλληση της μεταγραφής από το πρότυπο. Σε άλλες περιπτώσεις η εκτέλεση του As απουσιάζει και εμφανίζεται ένας διαφορετικός μηχανισμός με βάση τη δέσμευση μιας πρωτεΐνης που ονομάζεται Rho (ρ) η οποία διαταράσσει το ζευγάρωμα βάσεων μεταξύ του εκμαγείου και της μεταγραφής όταν η πολυμεράση σταματά μετά τον βρόχο στελέχους. Ο τερματισμός της μεταγραφής περιλαμβάνει την απελευθέρωση του μεταγράφου και του ενζύμου πυρήνα που μπορεί στη συνέχεια να επανασυνδεθεί με την υπομονάδα σ και να προχωρήσει σε έναν άλλο γύρο μεταγραφής (Εικ. 7.9 & amp 7.10).

Σε πολλά βακτήρια, γονίδια σχετικών λειτουργιών ομαδοποιούνται σε οπερόνια. Ένα οπερόνιο δρα ως ενιαία μεταγραφική μονάδα και έτσι παράγει πολυκιστρονικό mRNA. Στους ευκαρυώτες, γενικά παράγονται μόνο μονοκιστρονικά mRNA.

Εικ. 7.10. Διαγραμματική παρουσίαση της σύνθεσης RNA από πολυμεράση E.coli

Μεταγραφή στους Ευκαρυώτες:

Η μεταγραφή συμβαίνει στους ευκαρυώτες με τρόπο παρόμοιο με τους προκαρυωτικούς. Ωστόσο, η έναρξη είναι πιο περίπλοκη, ο τερματισμός δεν περιλαμβάνει δομές στελέχους-βρόγχου και η μεταγραφή πραγματοποιείται από τρία ένζυμα (RNA πολυμεράσες I, II και III) καθένα από τα οποία μεταγράφει ένα συγκεκριμένο σύνολο γονιδίων και λειτουργεί με ελαφρώς διαφορετικό τρόπο.

Η RNA πολυμεράση Ι μεταγράφει γονίδια που κωδικοποιούν τρία από τα τέσσερα ριβοσωμικά RNA (18S, 28S και 5.8S). Το ένζυμο RNA πολυμεράση II μεταγράφει γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες. Η σύνδεση της RNA πολυμεράσης II στον προαγωγέα της περιλαμβάνει πολλά διαφορετικά στοιχεία αλληλουχίας DNA και έναν αριθμό πρωτεϊνών που ονομάζονται παράγοντες μεταγραφής. Η RNA πολυμεράση III μεταγράφει ένα σύνολο βραχέων γονιδίων που κωδικοποιούν τα RNA μεταφοράς και το ριβοσωμικό RNA 5S.

Σε αντίθεση με την κατάσταση στα προκαρυωτικά γονίδια, η μεταγραφή στους ευκαρυώτες λαμβάνει χώρα εντός του πυρήνα και το mRNA μετακινείται έξω από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα για μετάφραση. Η έναρξη και η ρύθμιση της μεταγραφής είναι πιο εκτεταμένη από τα προκαρυωτικά. Μια άλλη σημαντική διαφορά μεταξύ των προκαρυωτών και των ευκαρυωτικών έγκειται στο γεγονός ότι το mRNA στους ευκαρυώτες υποβάλλεται σε επεξεργασία από το πρωτεύον μεταγράφημα RNA, μια διαδικασία που ονομάζεται ωρίμανση.

Αρχικά στο 5′ άκρο προστίθεται ένα καπάκι (αποτελούμενο από 7-μεθυλογουανοσίνη ή 7 mG) και μια ουρά πολυ Α στο 3′ άκρο (Εικ. 7.11) Το καπάκι είναι ένα χημικά τροποποιημένο μόριο τριφωσφορικής γουανοσίνης ( GTP). Το πρωτεύον ευκαρυωτικό μεταγράφημα mRNA είναι πολύ μεγαλύτερο και εντοπίζεται στον πυρήνα, όταν ονομάζεται επίσης ετερογενές πυρηνικό RNA (hnRNA) ή προ-mRNA.

Τα ευκαρυωτικά πρωτογενή mRNA αποτελούνται από δύο τύπους τμημάτων που δεν κωδικοποιούν ιντρόνια και τα κωδικοποιητικά εξόνια. Τα εσώνια αφαιρούνται με μια διαδικασία που ονομάζεται μάτισμα RNA. Από ένα ζεύγος μικρής πυρηνικής ριβονουκλεοπρωτεΐνης (SnRNP που προφέρονται “snurps”), η μία συνδέεται με τη θέση ματίσματος 5′ και η άλλη με τη θέση ματίσματος 3′.

Ένα μάτισμα σχηματίζεται λόγω της αλληλεπίδρασης μεταξύ των SnRNPs και άλλων πρωτεϊνών. Αυτό το μάτισμα χρησιμοποιεί την ενέργεια του ATP για να κόψει το RNA, απελευθερώνει τα ιντρόνια και ενώνει δύο γειτονικά εξόνια για να παράγει ώριμο mRNA. Εκτός αυτού, αυτές οι δύο μετα-μεταγραφικές τροποποιήσεις, η επεξεργασία RNA μπορεί επίσης να πραγματοποιηθεί πριν ξεκινήσει η μετάφραση.

Επεξεργασία μετά τη μεταγραφή:

Το πρωτογενές αντίγραφο είναι συχνά μεγαλύτερο από τα λειτουργικά RNA. Ονομάζεται ετερογενές ή hnRNA ειδικά στην περίπτωση mRNA.

Απαιτείται επεξεργασία μετά τη μεταγραφή για τη μετατροπή του πρωτογενούς μεταγράφου σε λειτουργικά RNA.

Μεγαλύτεροι πρόδρομοι RNA διασπώνται για να σχηματίσουν μικρότερα RNA. Το πρωτεύον μεταγράφημα του rRNA είναι το 45S στους ευκαρυώτες.

Διασπάται για να σχηματιστεί το εξής:

Το πρωτογενές αντίγραφο διασπάται από τη ριβονουκλεάση-Ρ (ένα ένζυμο RNA) για να σχηματίσει 5-7 πρόδρομους tRNA,

Τα ευκαρυωτικά μεταγραφήματα διαθέτουν επιπλέον τμήματα (εσώνια ή ενδιάμεσες αλληλουχίες). Αφαιρούνται με νουκλεάσες. Το ριβοένζυμο (ένζυμο an-RNA) είναι ένα αυτοματιζόμενο εσώνιο που εμπλέκεται σε ορισμένες από αυτές τις αντιδράσεις καθώς και στον καταλυτικό πολυμερισμό.


76 Επεξεργασία RNA σε Ευκαρυώτες

Μέχρι το τέλος αυτής της ενότητας, θα μπορείτε να κάνετε τα εξής:

  • Περιγράψτε τα διάφορα στάδια στην επεξεργασία του RNA
  • Κατανοήστε τη σημασία των εξονίων, των ιντρονίων και του ματίσματος για τα mRNA
  • Εξηγήστε πώς επεξεργάζονται τα tRNA και rRNA

Μετά τη μεταγραφή, τα ευκαρυωτικά προ-mRNA πρέπει να υποβληθούν σε διάφορα στάδια επεξεργασίας προτού μεταφραστούν. Τα ευκαρυωτικά (και προκαρυωτικά) tRNA και rRNA υφίστανται επίσης επεξεργασία πριν μπορέσουν να λειτουργήσουν ως συστατικά στον μηχανισμό πρωτεϊνοσύνθεσης.

Επεξεργασία mRNA

Το ευκαρυωτικό προ-mRNA υφίσταται εκτεταμένη επεξεργασία πριν είναι έτοιμο για μετάφραση. Οι αλληλουχίες που κωδικοποιούν τις ευκαρυωτικές πρωτεΐνες δεν είναι συνεχείς, όπως είναι στους προκαρυώτες. Οι κωδικοποιητικές αλληλουχίες (εξόνια) διακόπτονται από μη κωδικοποιητικά εσώνια, τα οποία πρέπει να αφαιρεθούν για να δημιουργηθεί ένα μεταφράσιμο mRNA. Τα πρόσθετα βήματα που εμπλέκονται στην ωρίμανση του ευκαρυωτικού mRNA δημιουργούν επίσης ένα μόριο με πολύ μεγαλύτερο χρόνο ημιζωής από ένα προκαρυωτικό mRNA. Τα ευκαρυωτικά mRNA διαρκούν αρκετές ώρες, ενώ τα τυπικά Ε. coli Το mRNA δεν διαρκεί περισσότερο από πέντε δευτερόλεπτα.

Τα προ-mRNA επικαλύπτονται πρώτα σε πρωτεΐνες που σταθεροποιούν το RNA, αυτές προστατεύουν το προ-mRNA από την αποικοδόμηση ενώ υποβάλλεται σε επεξεργασία και εξάγεται από τον πυρήνα. Τα τρία πιο σημαντικά στάδια της προ-mRNA επεξεργασίας είναι η προσθήκη παραγόντων σταθεροποίησης και σηματοδότησης στα 5′ και 3′ άκρα του μορίου και η αφαίρεση των ιντρονίων ((Εικόνα)). Σε σπάνιες περιπτώσεις, το μεταγράφημα mRNA μπορεί να «επεξεργαστεί» μετά τη μεταγραφή του.


Τα τρυπανοσώματα είναι μια ομάδα πρωτόζωων που περιλαμβάνουν το παθογόνο Trypanosoma brucei, που προκαλεί νάγκανα στα βοοειδή και την ασθένεια του ύπνου στους ανθρώπους σε μεγάλες περιοχές της Αφρικής ((Εικόνα)). Το τρυπανόσωμα μεταφέρεται με το δάγκωμα των μυγών του γένους Γλωσσίνα (κοινώς ονομάζονται μύγες τσέτσε). Τα τρυπανοσώματα, και ουσιαστικά όλοι οι άλλοι ευκαρυώτες, έχουν οργανίδια που ονομάζονται μιτοχόνδρια και τροφοδοτούν το κύτταρο με χημική ενέργεια. Τα μιτοχόνδρια είναι οργανίδια που εκφράζουν το δικό τους DNA και πιστεύεται ότι είναι τα υπολείμματα μιας συμβιωτικής σχέσης μεταξύ ενός ευκαρυώτικου και ενός εμποτισμένου προκαρυώτικου. Το μιτοχονδριακό DNA των τρυπανοσωμάτων παρουσιάζει μια ενδιαφέρουσα εξαίρεση στο κεντρικό δόγμα: τα προ-mRNA τους δεν έχουν τις σωστές πληροφορίες για να καθορίσουν μια λειτουργική πρωτεΐνη. Συνήθως, αυτό συμβαίνει επειδή στο mRNA λείπουν αρκετά νουκλεοτίδια U. Το κύτταρο εκτελεί ένα πρόσθετο βήμα επεξεργασίας RNA που ονομάζεται επεξεργασία RNA για να το διορθώσει.


Άλλα γονίδια στο μιτοχονδριακό γονιδίωμα κωδικοποιούν 40- έως 80-νουκλεοτιδικά καθοδηγητικά RNA. Ένα ή περισσότερα από αυτά τα μόρια αλληλεπιδρούν με συμπληρωματικό ζευγάρωμα βάσεων με μερικά από τα νουκλεοτίδια στο προ-mRNA μεταγραφή. Ωστόσο, το οδηγό RNA έχει περισσότερα νουκλεοτίδια Α από ό,τι το pre-mRNA έχει νουκλεοτίδια U με τα οποία συνδέεται. Σε αυτές τις περιοχές, το RNA-οδηγό ξεφεύγει. Τα 3′ άκρα των οδηγών RNA έχουν μια μακριά ουρά πολυ-U και αυτές οι βάσεις U εισάγονται σε περιοχές του μεταγράφου προ-mRNA στις οποίες τοποθετούνται βρόχοι τα οδηγά RNA. Αυτή η διαδικασία διαμεσολαβείται εξ ολοκλήρου από μόρια RNA. Δηλαδή, τα καθοδηγητικά RNA - αντί για πρωτεΐνες - χρησιμεύουν ως καταλύτες στην επεξεργασία του RNA.

Η επεξεργασία RNA δεν είναι απλώς ένα φαινόμενο τρυπανοσωμάτων. Στα μιτοχόνδρια ορισμένων φυτών, σχεδόν όλα τα προ-mRNA είναι επεξεργασμένα. Η επεξεργασία RNA έχει επίσης εντοπιστεί σε θηλαστικά όπως αρουραίους, κουνέλια, ακόμη και ανθρώπους. Ποιος θα μπορούσε να είναι ο εξελικτικός λόγος για αυτό το πρόσθετο βήμα στην προ-mRNA επεξεργασία; Μια πιθανότητα είναι ότι τα μιτοχόνδρια, ως υπολείμματα αρχαίων προκαρυωτών, έχουν μια εξίσου αρχαία μέθοδο που βασίζεται στο RNA για τη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης. Προς υποστήριξη αυτής της υπόθεσης, οι τροποποιήσεις που γίνονται στα προ-mRNAs διαφέρουν ανάλογα με τις κυτταρικές συνθήκες. Αν και εικαστική, η διαδικασία της επεξεργασίας RNA μπορεί να είναι μια αναμονή από έναν αρχέγονο χρόνο όταν τα μόρια RNA, αντί για πρωτεΐνες, ήταν υπεύθυνα για την κατάλυση αντιδράσεων.

5′ Κάλυψη

Ενώ το pre-mRNA εξακολουθεί να συντίθεται, ένα κάλυμμα 7-μεθυλγουανοσίνης προστίθεται στο άκρο 5′ του αναπτυσσόμενου μεταγράφου μέσω ενός φωσφορικού δεσμού. Αυτή η λειτουργική ομάδα προστατεύει το εκκολαπτόμενο mRNA από την αποικοδόμηση. Επιπλέον, παράγοντες που εμπλέκονται στη σύνθεση πρωτεϊνών αναγνωρίζουν το κάλυμμα για να βοηθήσει στην έναρξη της μετάφρασης από τα ριβοσώματα.

3′ Poly-A Tail

Μόλις ολοκληρωθεί η επιμήκυνση, το pre-mRNA διασπάται από μια ενδονουκλεάση μεταξύ μιας συναινετικής αλληλουχίας AAUAAA και μιας πλούσιας σε GU αλληλουχία, αφήνοντας την αλληλουχία AAUAAA στο pre-mRNA. Ένα ένζυμο που ονομάζεται πολυ-Α πολυμεράση προσθέτει στη συνέχεια μια σειρά υπολειμμάτων περίπου 200 Α, που ονομάζεται ουρά πολυ-Α. Αυτή η τροποποίηση προστατεύει περαιτέρω το pre-mRNA από την αποικοδόμηση και είναι επίσης η θέση δέσμευσης για μια πρωτεΐνη που είναι απαραίτητη για την εξαγωγή του επεξεργασμένου mRNA στο κυτταρόπλασμα.

Προ-mRNA Splicing

Τα ευκαρυωτικά γονίδια αποτελούνται από εξόνια, τα οποία αντιστοιχούν σε αλληλουχίες που κωδικοποιούν πρωτεΐνες (πρώην-on σημαίνει ότι είναι πρώηνπιεσμένο), και ενθΑκολουθίες που ονομάζονται εσώνια (ενδο-ron δηλώνει τους ενθενεργητικός ρόλος), τα οποία μπορεί να εμπλέκονται στη ρύθμιση των γονιδίων αλλά αφαιρούνται από το pre-mRNA κατά την επεξεργασία. Οι αλληλουχίες ιντρονίων στο mRNA δεν κωδικοποιούν λειτουργικές πρωτεΐνες.

Η ανακάλυψη των ιντρονίων προκάλεσε έκπληξη για τους ερευνητές της δεκαετίας του 1970, οι οποίοι περίμεναν ότι τα προ-mRNAs θα καθόριζαν τις πρωτεϊνικές αλληλουχίες χωρίς περαιτέρω επεξεργασία, όπως είχαν παρατηρήσει στους προκαρυώτες. Τα γονίδια των ανώτερων ευκαρυωτών πολύ συχνά περιέχουν ένα ή περισσότερα εσώνια. Αυτές οι περιοχές μπορεί να αντιστοιχούν σε ρυθμιστικές αλληλουχίες, ωστόσο, η βιολογική σημασία της ύπαρξης πολλών εσωνίων ή της ύπαρξης πολύ μακρών ιντρονίων σε ένα γονίδιο είναι ασαφής. Είναι πιθανό τα εσώνια να επιβραδύνουν την έκφραση των γονιδίων επειδή χρειάζεται περισσότερος χρόνος για να μεταγραφούν τα προ-mRNA με πολλά ιντρόνια. Εναλλακτικά, τα εσώνια μπορεί να είναι μη λειτουργικά υπολείμματα αλληλουχίας που έχουν απομείνει από τη σύντηξη αρχαίων γονιδίων σε όλη την πορεία της εξέλιξης. Αυτό υποστηρίζεται από το γεγονός ότι τα ξεχωριστά εξόνια συχνά κωδικοποιούν ξεχωριστές υπομονάδες ή περιοχές πρωτεΐνης.Ως επί το πλείστον, οι αλληλουχίες των ιντρονίων μπορούν να μεταλλαχθούν χωρίς να επηρεαστεί τελικά το προϊόν πρωτεΐνης.

Όλα τα εσώνια ενός προ-mRNA πρέπει να αφαιρεθούν πλήρως και με ακρίβεια πριν από την πρωτεϊνοσύνθεση. Εάν η διεργασία σφάλλει έστω και κατά ένα μόνο νουκλεοτίδιο, το πλαίσιο ανάγνωσης των επανενωμένων εξονίων θα μετατοπιστεί και η προκύπτουσα πρωτεΐνη θα ήταν δυσλειτουργική. Η διαδικασία αφαίρεσης εσωνίων και επανασύνδεσης εξονίων ονομάζεται μάτισμα ((Εικόνα)). Τα εσώνια αφαιρούνται και αποικοδομούνται ενώ το pre-mRNA είναι ακόμα στον πυρήνα. Το μάτισμα λαμβάνει χώρα με έναν ειδικό για την αλληλουχία μηχανισμό που διασφαλίζει ότι τα ιντρόνια θα αφαιρεθούν και τα εξόνια θα επανασυνδεθούν με την ακρίβεια και την ακρίβεια ενός μόνο νουκλεοτιδίου. Αν και το ίδιο το εσώνιο δεν κωδικοποιεί, η αρχή και το τέλος κάθε ιντρονίου σημειώνονται με συγκεκριμένα νουκλεοτίδια: GU στο 5′ άκρο και AG στο 3′ άκρο του ιντρονίου. Το μάτισμα των προ-mRNA διεξάγεται από σύμπλοκα πρωτεϊνών και μορίων RNA που ονομάζονται ματίσματα.


Τα λάθη στο μάτισμα εμπλέκονται σε καρκίνους και άλλες ανθρώπινες ασθένειες. Τι είδους μεταλλάξεις μπορεί να οδηγήσουν σε σφάλματα ματίσματος; Σκεφτείτε διαφορετικά πιθανά αποτελέσματα εάν προκύψουν σφάλματα ματίσματος.

<!– <link window=”new” target-id=”fig-ch15_04_02″ document=””/>Μεταλλάξεις στην αλληλουχία αναγνώρισης ματοσώματος και σε κάθε άκρο της πρωτεΐνης σε κάθε άκρο της Τα RNA που συνθέτουν το μάτισμα μπορεί να βλάψουν το μάτισμα. Οι μεταλλάξεις μπορεί επίσης να προσθέσουν νέες τοποθεσίες αναγνώρισης ματίσματος. Τα σφάλματα ματίσματος θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε διατήρηση εσωνίων στο ματισμένο RNA, αποκοπή εξονίων ή αλλαγές στη θέση της θέσης ματίσματος. –>

Σημειώστε ότι περισσότερα από 70 μεμονωμένα εσώνια μπορούν να υπάρχουν και το καθένα πρέπει να υποβληθεί στη διαδικασία ματίσματος - εκτός από την κάλυψη 5′ και την προσθήκη μιας ουράς πολυ-Α - μόνο για να δημιουργηθεί ένα μόνο, μεταφράσιμο μόριο mRNA.

Δείτε πώς αφαιρούνται τα ιντρόνια κατά τη συναρμογή RNA σε αυτόν τον ιστότοπο.

Επεξεργασία tRNA και rRNA

Τα tRNA και rRNA είναι δομικά μόρια που έχουν ρόλους στη σύνθεση πρωτεϊνών, ωστόσο, αυτά τα RNA δεν μεταφράζονται από μόνα τους. Τα προ-rRNA μεταγράφονται, επεξεργάζονται και συναρμολογούνται σε ριβοσώματα στον πυρήνα. Τα προ-tRNA μεταγράφονται και υποβάλλονται σε επεξεργασία στον πυρήνα και στη συνέχεια απελευθερώνονται στο κυτταρόπλασμα όπου συνδέονται με ελεύθερα αμινοξέα για τη σύνθεση πρωτεϊνών.

Τα περισσότερα από τα tRNA και rRNA σε ευκαρυώτες και προκαρυώτες μεταγράφονται αρχικά ως ένα μακρύ πρόδρομο μόριο που εκτείνεται σε πολλαπλά rRNA ή tRNA. Έπειτα τα ένζυμα διασπούν τους πρόδρομους σε υπομονάδες που αντιστοιχούν σε κάθε δομικό RNA. Μερικές από τις βάσεις των προ-rRNA είναι μεθυλιωμένο δηλαδή α –Χ3 Η λειτουργική ομάδα μεθυλίου προστίθεται για σταθερότητα. Τα προ-tRNA μόρια υφίστανται επίσης μεθυλίωση. Όπως και με τα προ-mRNA, η εκτομή υπομονάδας λαμβάνει χώρα σε ευκαρυωτικά προ-RNA που προορίζονται να γίνουν tRNA ή rRNA.

Τα ώριμα rRNA αποτελούν περίπου το 50 τοις εκατό κάθε ριβοσώματος. Μερικά από τα μόρια RNA ενός ριβοσώματος είναι καθαρά δομικά, ενώ άλλα έχουν καταλυτικές ή δεσμευτικές δραστηριότητες. Τα ώριμα tRNA παίρνουν μια τρισδιάστατη δομή μέσω τοπικών περιοχών ζευγαρώματος βάσεων που σταθεροποιούνται με ενδομοριακούς δεσμούς υδρογόνου. Το tRNA διπλώνει για να τοποθετήσει τη θέση δέσμευσης αμινοξέων στο ένα άκρο και το αντικωδικόνιο στο άλλο άκρο ((Εικόνα)). Το αντικωδικόνιο είναι μια αλληλουχία τριών νουκλεοτιδίων σε ένα tRNA που αλληλεπιδρά με ένα κωδικόνιο mRNA μέσω συμπληρωματικού ζευγαρώματος βάσεων.


Περίληψη Ενότητας

Τα ευκαρυωτικά προ-mRNA τροποποιούνται με ένα κάλυμμα 5′ μεθυλγουανοσίνης και μια ουρά πολυ-Α. Αυτές οι δομές προστατεύουν το ώριμο mRNA από την αποικοδόμηση και βοηθούν στην εξαγωγή του από τον πυρήνα. Τα προ-mRNA υφίστανται επίσης μάτισμα, κατά το οποίο τα ιντρόνια αφαιρούνται και τα εξόνια επανασυνδέονται με ακρίβεια ενός νουκλεοτιδίου. Μόνο τα τελικά mRNA που έχουν υποστεί κάλυψη 5′, πολυαδενυλίωση 3′ και μάτισμα ιντρονίων εξάγονται από τον πυρήνα στο κυτταρόπλασμα. Τα προ-rRNA και τα προ-tRNA μπορούν να υποστούν επεξεργασία με ενδομοριακή διάσπαση, μάτισμα, μεθυλίωση και χημική μετατροπή νουκλεοτιδίων. Σπάνια, η επεξεργασία RNA εκτελείται επίσης για την εισαγωγή βάσεων που λείπουν μετά τη σύνθεση ενός mRNA.

Ερωτήσεις οπτικής σύνδεσης

(Εικόνα) Τα σφάλματα στο μάτισμα εμπλέκονται σε καρκίνους και άλλες ανθρώπινες ασθένειες. Τι είδους μεταλλάξεις μπορεί να οδηγήσουν σε σφάλματα ματίσματος; Σκεφτείτε διαφορετικά πιθανά αποτελέσματα εάν προκύψουν σφάλματα ματίσματος.

(Εικόνα) Μεταλλάξεις στην αλληλουχία αναγνώρισης ματίσματος σε κάθε άκρο του ιντρονίου ή στις πρωτεΐνες και τα RNA που συνθέτουν το μάτισμα, μπορεί να επηρεάσουν το μάτισμα. Οι μεταλλάξεις μπορεί επίσης να προσθέσουν νέες τοποθεσίες αναγνώρισης ματίσματος. Τα σφάλματα ματίσματος θα μπορούσαν να οδηγήσουν σε διατήρηση εσωνίων στο ματισμένο RNA, αποκοπή εξονίων ή αλλαγές στη θέση της θέσης ματίσματος.

Επιθεώρηση των ερωτήσεων

Ποιο στάδιο επεξεργασίας προ-mRNA είναι σημαντικό για την έναρξη της μετάφρασης;

Ποιο στάδιο επεξεργασίας ενισχύει τη σταθερότητα των προ-tRNA και προ-rRNA;

Ένας επιστήμονας αναγνωρίζει ένα προ-mRNA με την ακόλουθη δομή.


Ποιο είναι το προβλεπόμενο μέγεθος του αντίστοιχου ώριμου mRNA σε ζεύγη βάσεων (bp), εξαιρουμένου του 5' καλύμματος και της ουράς πολυ-Α 3';

Ερωτήσεις κριτικής σκέψης

Οι ασθενείς με χρόνια λεμφοκυτταρική λευχαιμία συχνά φέρουν ανόητες μεταλλάξεις στον μηχανισμό τους. Περιγράψτε πώς αυτή η μετάλλαξη του ματίσματος θα άλλαζε την τελική θέση και την αλληλουχία ενός προ-mRNA.

Οι ανόητες μεταλλάξεις ματίσματος θα εξαλείφουν το στάδιο ματίσματος της επεξεργασίας του mRNA, έτσι τα ώριμα mRNA θα διατηρούν τα εσώνιά τους και θα είναι τέλεια συμπληρωματικά με ολόκληρη την αλληλουχία μήτρας DNA. Ωστόσο, τα mRNA θα εξακολουθούσαν να υφίστανται προσθήκη του 5' καλύμματος και της ουράς πολυ-Α, και επομένως το καθένα έχει τη δυνατότητα να εξαχθεί στο κυτταρόπλασμα για μετάφραση.

Γλωσσάριο


Δες το βίντεο: Your Bodys Molecular Machines (Νοέμβριος 2022).